Biologia e Biochimica - Appunti

DAL DNA ALLE PROTEINE: DAL GENOTIPO AL FENOTIPO

IL DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

Nei procarioti la duplicazione, la trascrizione e traduzione avviene nel citoplasma.

Negli eucarioti la duplicazione e la trascrizione avvengono nel nucleo, la traduzione nel citoplasma.

I VIRUS A RNA

RNA RNA PROTEINE: (virus a RNA) i virus a RNA contengono un genoma a RNA. Sintetizzano un

filamento di RNA complementare che funziona da stampo per la sintesi di copie multiple del genoma virale

(trascrizione). Viene utilizzata una RNA polimerasi RNA dipendente.

DNA RNA PROTEINE: (retrovirus) i retrovirus contengono un genoma a RNA. Sintetizzano un

filamento di DNA complementare che sfruttano da stampo per la sintesi di copia del loro genoma a RNA

mediante retrotrascrizione, una DNA polimerasi RNA dipendenti.

CONNESIONE TRA DNA, RNA E PROTEINE

I geni codificano per le proteine: come si scopre questa connessione?

- 1896: Archinbald Corrad studiò l’alcaptonuria (malattia umana facilmente individuabile): le urine

diventano nere al contatto con l’aria. Conclude che ha una base ereditaria e che, chi ne è affetto

espelle una sostanza chimica che diventa nera al contatto con l’aria: gli individui normali

metabolizzano questa sostanza.

- 1906: deduce che è un errore congenito del metabolismo. Non sa che la malattia deriva dalla

modificazione di un gene che codifica per un enzima che metabolizza un composto chimico chiave.

PRIMA EVIDENZA DI UNA CORRELAZIONE TRA GENI E METABOLISMO

- 1940: Beadle e Tatum studiano la muffa Neurospora crassa che mostra una correlazione diretta tra

geni ed enzimi. Il fungo aploide con necessità nutrizionali semplici e il tipo selvatico (neurospora

wild) cresce senza difficoltà su un terreno minimo (MM) con Sali inorganici, saccarosio e una

vitamina: i funghi utilizzano semplici sostanze chimiche del MM per creare tutte le molecole più

complesse per la crescita e la riproduzione del DNA).

Irradiano con raggi X (agenti mutageni), che causano mutazioni: alcune specie non germinano e

alcune non crescono sul MM (a meno che esso non venga arricchito di AA o vitamine). I cloni che

non crescono sul MM sono detti auxotrofi (mutanti nutrizionali) e si ipotizza che abbiano un difetto

in un gene che codifica per un enzima necessario a sintetizzare un particolare nutriente. Analizzando

ogni singolo clone mutante sul MM con l’aggiunta di un singolo nutriente al terreno, fu scoperto di

quale specifico nutriente il clone avesse necessità per poter crescere e quindi quale fosse il difetto

genetico. Es. se un mutante necessita l’aggiunta di arginina ha un difetto in un gene per un enzima

coinvolto nella sintesi dell’arginina.

DEDUCONO IL PROCESSO DALL’ARGININA E MOSTRARONO QUALE GENE CODIFICA PER

L’ENZIMA COINVOLTO IN CIASCUNA FASE: DIMOSTRANO UNA RELAZIONE DIRETTA TRA

GENI ED ENZIMI

IPOTESI 1 GENE = 1 ENZIMA

Diventa

IPOTESI 1 GENE = 1 POLIPEPTIDE

IL PERCORSO DAL GENE AL POLIPEPTIDE COMPRENDE LA TRASCRIIONE E LA TRADUZIONE

- Trascrizione: meccanismo con cui l’informazione codificata dal DNA è riportata in una copia di

RNA complementare.

- Traduzione: uso dell’informazione codificata nell’RNA per assemblare un polipeptide.

Nel 1956 Francis Crick ha definito dogma centrale il flusso di informazioni dal DNA, all’RNA, alle

proteine. Nella trascrizione, l’enzima RNA polimerasi, copia la sequenza di DNA di un gene in una

sequenza di RNA. Il processo è simile alla replicazione del DNA, eccetto per il fatto che solo uno dei due

filamenti di DNA (filamento stampo) è copiato in un filamento di RNA.

Un gene che codifica per un polipeptide è un gene codificante per una proteina e l’RNA da esso trascritto

viene chiamato RNA messaggero (mRNA). Nella traduzione una molecola di RNA si associa con un

ribosoma (particella nella quale gli AA vengono legati insieme a formare una catena). Mentre il ribosoma si

muove lungo l’mRNA, gli AA indicati sono uniti uno dopo l’altro.

TRASCRIZIONE: sintesi di RNA

- RNA ribosomiale (rRNA): 80% dell’RNA cellulare totale.

- RNA di trasporto (tRNA): 5% dell’RNA cellulare totale.

- RNA messaggero (mRNA): 3% dell’RNA cellulare totale

- Piccole molecole di RNA

- RNA polimerasi: stampo a DNA, non necessita di innesco, lavora in direzione 5-3.

FASE DI INIZIO

La RNA polimerasi riconosce e lega specifiche sequenze (promotori) localizzate a monte di ogni gene. I

promotori indicano:

- Dove iniziare a trascrivere.

- Quale filamento trascrivere.

- In quale direzione procedere.

I promotori non sono identici nonostante abbiano caratteristiche comuni in ogni specie e possono essere più

o meno efficaci. Il legame della RNA polimerasi induce la denaturazione di una regione del DNA (10 paia di

basi ca.) originando il complesso aperto e la bolla di trascrizione. A valle del promotore vi è il sito di inizio

trascrizione.

FASE DI ALLUNGAMENTO

L’RNA polimerasi legge il filamento stampo in direzione 3-5 e sintetizza RNA in direzione 5-3. L’RNA

4 5

polimerasi non è in grado di correggere gli errori (un errore ogni 10 -10 basi); questi errori hanno un effetto

limitato in quanto le copie di RNA sono numerose. L’RNA ha una vita limite e non viene trasmessa alle

cellule figlie.

FASE DI TERMINAZIONE:

Specifiche sequenze sul DNA indicano i siti di terminazione della trascrizione. La terminazione può essere

dipendente o indipendente dall’attività di specifiche proteine. Mentre il DNA genico è segregato nei

cromosomi in un’unica copia o in poche copie, l’RNA è riprodotto in un grande numero di copie, che dopo la

loro sintesi vengono direttamente a contatto con i ribosomi nel citoplasma.

IL CODICE GENETICO

Insieme delle informazioni nucleotidiche che indicano la sequenza amminoacidica di un polipeptide è

chiamato codice genetico. La combinazione di almeno tre basi per codificare 20 differenti AA.

Il codice genetico è un codice a 3 lettere; ogni “parola” è detta codone o tripletta.

Nel 1964 Nirenberg e Leder scoprirono che i codoni di 3 basi erano capaci di legarsi ai ribosomi in provetta e

determinare il legame di un singolo tRNA portante il suo AA al ribosoma.

- È universale: stessi codoni codificano stessi AA in tutte le specie.

- È univoco, ma degenerato: lo stesso AA può essere codificato da più codoni, ma un codone da

origine ad un solo AA.

- Codoni simili codificano per lo stesso AA o per AA con caratteristiche simili.

- 61 codoni su 64 codificano per AA: codoni senso.

- Il codone AUG è un codone di inizio.

- UAA-UAG-UGA sono codoni stop.

LETTURA DEL CODICE GENETICO

Gli adattatori sono molecole di tRNA che si pongono all’interfaccia tra la sequenza nucleotidica

dell’mRNA e la sequenza amminoacidica delle proteine. La sequenza dell’mRNA si può definite come una

sequenza di codoni che si tradurrà in una sequenza amminoacidica delle proteine.

GLI RNA TRANSFER

I tRNA rappresentano il collegamento tra il codone sull’mRNA e l’AA corrispondente. Il tRNA:

- Trasporta un AA che si lega al sito di legame dell’AA.

- Si associa a molecole di mRNA per complementarietà mediante

l’anticodone.

- Interagisce con i ribosomi.

Ogni tRNA possiede uno specifico anticodone complementare al codone

sull’mRNA che codifica l’AA che viene trasportato. Non ci sono 61 tipi

di tRNA, ma sono circa un terzo in quanto il riconoscimento della terza

base del codone da parte dell’anticodone non è strettamente rispettato

(fenomeno dell’oscillazione): lo stesso tRNA può ad esempio

riconoscere i codoni GCA, GCC, GCU.

DAL DNA ALLE PROTEINE

I tRNA portano gli AA al ribosoma affinché questi possano essere aggiunti alla catena polipeptidica. I tRNA

sono piccole molecole simili all’mRNA lunghi 75-90 nucleotidi con una struttura che li distingue

inequivocabilmente e che serve affinché possano svolgere il loro ruolo

nella traduzione. Tutti i tRNA possono avvolgersi in quattro segmenti a

doppia elica formando strutture a trifoglio. All’estremità di uno dei

segmenti è presente l’anticodone (segmento che si appaia all’mRNA).

Affinché il processo di traduzione possa avvenire in modo corretto, l’AA

giusto deve essere presente sul corrispettivo tRNA: questo processo viene

detto aminolazione o caricamento il cui prodotto finito è un tRNA legato

al corretto AA chiamato aminoacil-tRNA (esistono 20 enzimi chiamati

aminoacil-tRNA sintetasi).

IL RIBOSOMA

I ribosomi sono costituiti da RNA ribosomiale e proteine. Sono composti da due sub-unità: maggiore e

minore e quando non sono impegnati nella sintesi delle proteine le due

sub-unità sono dissociate. I ribosomi possiedono un sito di legame per

l’mRNA. I ribosomi possiedono tre siti di legame per i tRNA.

- Sito A (AA): un anticodone di un tRNA carico riconosce e interagisce

con lo specifico codone sul mRNA posizionando correttamente l’AA

da aggiungere alla catena in via di sintesi.

- Sito P (polipeptide): dove il tRNA aggiunge l’AA alla catena in via di

sintesi.

- Sito E (uscita–exit): dove si localizza il tRNA scarico prima di dissociarsi ribosoma e tornare nel

citoplasma.

Il ribosoma controlla il corretto appaiamento codone-anticodone.

TRADUZIONE

FASE DI INIZIO

Con traduzione si intende l’assemblaggio degli AA in un polipeptide. Nei procarioti l’mRNA prodotto per

trascrizione è subito disponibile per la traduzione mentre negli eucarioti l’mRNA, prodotto mediante splicing

a partire dal pre-mRNA, esce prima dal nucleo e poi viene

tradotto nel citoplasma.

- FASE 1: una unità ribosomiale maggiore si lega ad una

minore con una molecola di mRNA e il primo

aminoacil-tRNA della nuova catena proteica si lega al

codone di inizio AUG (scansione). L’amminoacil-tRNA

utilizzato per l’inizio della traduzione è un tRNA

iniziatore specializzato che ha un anticodone

complementare al codone d’inizio AUG che indica la metiomina. Ogni fase di inizio è assistita da

proteine chiamate fattori di inizio.

- FASE 2: al complesso si lega la subunità maggiore del ribosoma in modo che il tRNA occupi il sito P

e che il sito A si trovi in corrispondenza del codone successivo.

FASE DI ALLUNGAMENTO

È la fase in cui gli AA vengono aggiunti uno alla volta alla catena polipeptidica in crescita. Assistito dalle

proteine chiamate fattori di allungamento. Il sito P, con una sola eccezione, può legarsi solo ad un

peptil-tRNA cioè a un tRNA legato ad una catena polipeptidica in crescita che contiene due o più AA (ad

eccezione del tRNA iniziatore).

- FASE 1: il ciclo inizia nel momento in cui il tRNA iniziatore (con la metionina) si trova nel sito P e il