Biologia dello Sviluppo - studio sui meccanismi molecolari e fisiologici che controllano le varie fasi embrionali e la formazione di cellule, organi e tessuti differenziati

ESPERIMENTI

1)SPECIFICAZIONE AUTONOMA MIOPLASMA (Semiluna gialla; mioplasma = citoplasma

giallo detto così perché ci si forma il muscolo).

Conklin sfruttò la differente colorazione di queste regioni di citoplasma per seguire

ciascuna cellula dell’embrione fino al suo destino nella larva.

Scoprì che le cellule che ricevevano: 56

- il citoplasma chiaro diventano ectoderma;

- quelle con citoplasma giallo diventano endoderma;

- quelle con citoplasma grigio diventano tubo neurale e notocorda.

Le regioni citoplasmatiche sono disposte bilateralmente al piano di simmetria.

Con la 2° divisione il mesoderma viene a trovarsi nelle 2 cellule posteriori, mentre i futuri

neuro-ectoderma e cordomesoderma andranno a localizzarsi in quella anteriori.

Il 3° piano di divisione amplia questo processoà mesoderma confinato nei 2 blastomeri

vegetativi posteriori e il cordomesoderma nei 2 blastomeri vegetativi anteriori.

Scoprì inoltre che una coppia di blastomeri vegetativi formava tessuto muscolare della

coda perché le cellule contenevano citoplasma delle semiluna.

Nishikori vide che il citoplasma di un uovo fecondato induceva anche il blastomero del

polo animale ad esprimere proteine del muscolo.

Tungs & collaboratori (1977) dimostrarono che, quando si trapiantano nuclei di cellule

larvali in frammenti anucleati dell’uovo di tunicati, le cellule risultanti mostrano la struttura

tipica delle regioni dell’uovo che hanno fornito il citoplasma (non quella della cellula che ha

fornito il nucleo).

Quindi, nel citoplasma sono presenti dei “determinanti” in grado di riprogrammare il

nucleo trapiantato, agiscono attivando o inattivando selettivamente specifici geni.

La determinazione dei blastomeri e l’attivazione di certi geni sono regolate dalla

localizzazione spaziale dei determinanti morfogenetici.

Minganti (1946) Nella maggior parte dei casi ciascuna cellula isolata genera lo stesso tipo

di struttura che avrebbe formato nell’embrione (modello a mosaico).

Il SN, invece, si forma per induzione (modello regolativo).

Whittaker (1977) vide che nei blastomeri muscolari è presente acetilcolinesterasi (usata

qui come indicatore di cellule muscolari). Si separano i blastomeri vegetativi con

citoplasma giallo e si fanno crescere indipendentemente dell’embrione e si va a cercare la

AchE.

Se la colorazione è positiva con AchE allora è confermata la specificazione autonoma!! il

à

citoplasma giallo è necessario per la formazione di cellule muscolari.

La localizzazione dell’attività colinesterasica dipende dalla corretta segregazione dei

determinanti durante la segmentazioneà essenziale per il corretto sviluppo dell’embrione

il citoplasma giallo è sufficiente per la formazione delle cellule muscolari.

à

Sempre Whittaker (1982) allo stadio di 8 cellule il 3° piano di segmentazione è

equatoriale. Viene usato un ago come se fosse una bacchetta e viene applicata una

pressione, la cui funzione è quella di schiacciare il citoplasma giallo verso le cellule animali

(verso il piano di divisione equatoriale) non c’è più una netta divisione tra stato animale

à

e vegetativo, quindi il citoplasma giallo si sposta più facilmente.

L’embrione viene lasciato riposare e appena può rigenerare il piano di divisione, ritorna

allo stadio di 8 cellule ben divise.

Si ri-applica nuovamente una pressione, ma stavolta a livello del 3° solco di divisione,

quindi si separano i 4 blastomeri animali dai 4 vegetativià in seguito alla 1° pressione è

stato trasferito una certa quantità di citoplasma giallo ai blastomeri animali, quindi ora si 57

troverà all’internoà si formano cellule muscolari da cellule animali, che sono

ectodermicheà la tesi è confermata!

Nishida e Sawada (2001) Con l’impiego di tecniche di ibridazione dell’RNA trovarono che

certi mRNA sono presenti in quantità elevate nell’emisfero vegetativo dell’uovo dei tunicati.

Uno di questi messaggeri codifica per il tcf a dita di zinco macho-1.

Si è visto che macho-1 è concentrato nell’emisfero vegetativo dell’uovo non fecondato e,

all’inizio delle fecondazione, migra col citoplasma della semiluna gialla nella regione

vegetativa posteriore dell’uovo (si esprime nelle cellule che contengono la semiluna gialla).

Si è provato a vedere se fosse proprio macho-1 ad avere la funzione di sviluppo delle

strutture muscolarià esperimenti di guadagno (il gene viene sovraespresso o espresso

ectopicamente) e di perdita di funzione di macho-1.

Per perdita di funzione:

“disattiviamo” macho-1 tramite microiniezioni di oligont (oligonucleotidi) antisenso (si lega

al messaggero) e quindi l’mRNA macho-1 non viene tradotto, portando alla formazione di

una larva che manca della maggior parte della muscolatura e hanno code ridotte: i

blastomeri b4.1 non formano il muscolo.

Per guadagno di funzione:

microiniezioni di mRNA-macho-1 in blastomeri ectodermici o endodermici (induzione

ectopica di muscolo).

Quindi, l’insieme dei risultati indica che macho-1 è necessario e sufficiente a promuovere

lo sviluppo muscolare dei tunicati.

Nella semiluna gialla non basta il gene che forma il muscolo, ma serve anche il gene che

reprime la via alternativa, cioè la formazione delle notocordaà viene attivo il gene Snail

che reprime la regione dove verrebbe formata la notocorda.

Un altro mRNA nella semiluna gialla è CiVegTr, che codifica per un tcf della T-box (TATA

box che da sola promuove l’inizio della trascrizione in vitro). Questo mRNA migra col

citoplasma giallo, venendo ala fine incorporato nel blastomero b4.1.

La proteina CiVegTr si lega all’enancher del gene Snail (specifico del muscolo), che

impedisce l’espressione di Brachyury (cellule che diventano mesoderma) nelle cellule

muscolari presuntive: impedisce che i precursori del muscolo diventino cellule della

notocorda.

L’azione di macho-1 e CiVegTr è coadiuvata:

- macho-1 istruisce le cellule a divenire cellule muscolari

- CiVegTr istruisce le cellule a divenire notocorda 58

59

1’)SPECIFICAZIONE AUTONOMA ENDODERMA

L’endoderma presuntivo si forma da blastomeri vegetativi a4.1 e b4.1.

La specificazione coincide con la localizzazione della β-catenina :

- la sua inibizione porta alla perdita dell’endoderma e sostituzione con ectoderma

- il suo aumento porta all’incremento dell’endoderma a spese dell’ectoderma

- essa agisce attivando la sintesi di un tcf a omeodominio detto Lhx-3, la cui inibizione

porta al non differenziamento dell’endoderma 60

2)SPECIFICAZIONE CONDIZIONATA MESENCHIMA E NOTOCORDA

-Le cellule muscolari posteriori si formano per specificazione condizionata tramite

interazioni cellulari con le discendenti di blastomeri a4.1 vegetativo-Anteriore e b4.2

animale-Posteriore.

-La notocorda e il mesenchimale si formano per induzione da FGF (fattore di crescita dei

fibroblasti) secreto dalle cellule endodermiche.

-Le cellule anteriori, che diventano mesenchima, rispondono in maniera diversa per la

presenza di fattori derivati dal citoplasma vegetativo posteriore.

-La segnalazione del FGF al mesenchima serve per reprimere la formazione di tessuto

muscolare.

SPECIFICAZIONE ASSI CORPOREI

Sono determinati dal citoplasma dello zigote prima della 1° divisione di segmentazione:

- il 1° asse è D-V, definito dalla calotta di citoplasma al polo veg, che definisce la sede

in cui inizia la gastrulazione. (se nello zigote si asportano piccole regioni di

citoplasma del polo veg, lo zigote non attua la gastrulazione né forma l’asse D-V).

- il 2° asse è A-P, definito durante la migrazione del citoplasma dell’oocito. La

semiluna si forma nel futuro lato posteriore della larva. Questo citoplasma veg

posteriore (PVC) è dominante su altri tipi cellulari, poiché quando è trapiantato nella

regione veg anteriore, di zigoti a cui è stato asportato il PVC, la parte anteriore

diventa la nuova parte posteriore, rovesciando così l’asse. 61

RICCIO DI MARE

SEGMENTAZIONE

Di tipo oloblastica radiale, dove le prime divisioni sono stereotipiche, ovvero sono le

medesime per organismi che appartengono alla stessa specie.

Le prime 2 divisioni sono meridiane e perpendicolari l’una all’altra (il solco passa attraverso

il polo animale a quello vegetativo).

Il 3° piano di divisione è equatoriale e separa l’emisfero animale da quello vegetale.

La 4° divisione è diversa poiché si divide in senso meridiano, al polo animale, formando 8

cellule, blastomeri, di uguale volume, detti mesomeri; le cellule del polo vegetativo, invece,

subiscono una divisione ineguale, formando 4 cellule più grandi, macromeri, e 4 cellule più

piccole, micromeri.

Nella 5° divisione (stadio a 16 cellule): polo animaleà gli 8 mesomeri si dividono

equatorialmente formando 2 file, strati, posti uno sopra l’altro detti an1 e an2; polo

vegetativoà i macromeri si dividono in senso meridiano, formando una fila di 8 cellule

sottostante an2; i micromeri subiscono divisione ineguale, dando 4 micromeri più grandi e

4 micromeri più piccoli all’estremo del polo vegetativo.

Nella 6° divisione: polo animaleà divisione senso meridiano; polo vegetativoà divisione

equatoriale, formando 2 file di macromeri indicate come veg1 e veg2.

Nella 7° divisione abbiamo l’inverso: polo animaleà divisione equatoriale; polo

vegetativoà divisione meridiana.

Ora ci troviamo allo stadio di 128 cellule con la blastula, le quali cellule formano una sfera

cava ripiena di una soluzione proteica, detta blastocele.

Qui le cellule sono tutte di uguale dimensione poiché i micromeri hanno rallentato la

velocità di divisione. Sono tutte a contatto col liquido del blastocele all’interno, mentre

all’esterno sono a contatto con lo strato ialino.

Ora i blastomeri sono uniti da giunzioni strette a formare una lamina epiteliale continua che

circonda il blastocele.

Mentre le cellule continuano a dividersi, la blastula conserva lo spessore di uno strato

cellulare, assottigliandosi durante l’espansione, a causa dell’adesione dei blastomeri allo

strato ialino, e per l’ingresso di acqua, che amplia il blastocele.

Queste divisioni durano fino alla 9° o 10° divisione (a seconda della specie): le cellule, ora,

hanno ricevuto la loro specificazione, sviluppano delle ciglia sulla loro superficie apicale e

la blastula comincia a ruotare nella membrana di fecondazione.

Le cellule del polo vegetativo si ispessiscono formando una piastra vegetativa, mentre

quelle del polo animale sintetizzano e secernano un enzima di schiu