Biologia dello sviluppo

UN MODELLO PER L’INDUZIONE DEL MESODERMA E L’ORGANIZZAZIONE

- Come si fa a capire quali sono i segnali previsti dall’ipotesi?

Si capì che queste molecole devono rispettare dei requisiti ed i criteri spazio-temporali e di

attività, quindi è necessario che questi segnali vengano rilasciati nel posto giusto al momento

giusto

- una proteina deve essere espressa nell’endoderma per essere induttore

mesodermico a livello di blastula precoce.

- Deve inoltre avere attività di induttore mesodermico, quindi mimare gli

effetti dei trapianti delle cellule ectodermiche.

Saggio di induzione mesodermica

Si preleva un animal cap da una blastula e, se si lascia semplicemente in una piastra petri in

soluzione fisiologica, questo si trasformerà in epidermide.

Mentre se nella piastra viene aggiunto il fattore da saggiare, le cellule della calotta diventeranno

mesoderma solamente se ricevono i segnali dai fattori giusti (sennò diventano epidermide).

- Ci si chiede quindi se il fattore aggiunto è in grado di indurre le cellule a diventare mesoderma;

Per saggiare i criteri spazio-temporali si utilizza l’IBRIDAZIONE IN SITU

Si clona il gene a disposizione, si genera una sonda antisenso e si osserva dove è espresso il

gene.

Fattori coinvolti nell’induzione del mesoderma in Xenopus

È stato visto che i fattori coinvolti nell’induzione del mesoderma, che rispondevano perfettamente

ai requisiti, sono sia zigotici che materni.

Ci sono anche fattori materni perché l’ovocita di Xenopus contiene al suo interno una serie di

fattori (proteine, mRNA, subunità ribosomiali), fra cui quelli materni già depositati come mRNA

nell’ovocita; i fattori zigotici invece derivano dalla trascrizione del genoma zigotico

La differenza principale sta nel tipo di proteina prodotta dai vari geni, mentre i fattori materni

producono sia fattori secreti che di trascrizione, i fattori zigotici producono solamente fattori secreti.

- ZIGOTICI (dalla trascrizione del genoma zigotico)

→

Fattori secreti TGF-beta: Xenopus nodal related (Xnr1, Xnr2, Xnr4), Derriére

Sono tutte proteine secrete che funzionano per trasduzione del segnale accoppiandosi con il loro

recettore; i fattori della superfamiglia di TGF-beta sono molecole secrete che fanno da ligandi per

recettori specifici.

- MATERNI (depositati come mRNA nell’ovocita)

→

Fattori secreti TGF-beta: Vg-1

Fattori di trascrizione Veg-T (induce Derriére)

→

Sono sia fattori secreti che di trascrizione.

Vg-1 può funzionare anche su cellule adiacenti ad un certo raggio, mentre Veg-1 81

Molecole secrete e vie di trasduzione del segnale

- la via di segnale della superfamiglia dei fattori TGF-

I fattori della superfamiglia di TGF-beta sono molecole secrete che fanno da ligandi per recettori

specifici

Quando si parla di famiglia TGF- si considerano solo i fattori

- Vg1 - Activin

- Nodal - TGF-

Un’altra via che fa parte della superfamiglia, simile ma distinta, è quella delle BMP o bone

morphogenetic proteins (inizialmente viste nello sviluppo dell’osso, fanno anche altre cose)

La via di TGF- e la via di BMP funzionano in maniera simile.

Via del TGF- classico

I fattori della famiglia di TGF- codificano tutti per proteine secrete che dimerizzano e hanno un

recettore di membrana composto da due subunità (recettore tipo 1 e 2), distanti nella membrana

fluida delle cellule che lo esprimono.

Le due subunità si avvicinano solo quando arriva il dimero del ligando, che agisce da ponte;

avvicinandosi risvegliano l’attività chinasica che permette una cross fosforilazione che parte dal

recettore 2 che fosforila il recettore 1.

- Come chinasi si hanno in particolare serine-treonine chinasi, rimuovono il gruppo fosfato

a livello di una serina o treonina;

Il recettore 1 fosforila un eterodimero chiamato Smad2,3 che è ora in grado di legare Smad4 e

solo ora può entrare nel nucleo e comportarsi da fattore di trascrizione.

Via distinta di BMP

1. Ligando avvicina i recettori 5. Il complesso entra nel nucleo e lega geni

2. Cross fosforilazione specifici, comportandosi da fattori di

3. Recettore 1 fosforila Smad1,5 trascrizione per geni diversi dalla via

4. Smad1,5 lega Smad4 TGF-. 82

Vg1

- Primo gene vegetativo isolato

È una molecola della famiglia di dei TGF-; è espresso precocemente da un fattore

materno.

L’ibridazione in situ su una sezione di ovocita di Xenopus permette di evidenziare la

locazione dell’espressione dell’mRNA di Vg1; si definisce Vg perché è espresso nella

regione VEGETATIVA.

VegT

Veg perché anch’esso è un fattore vegetativo e T perché la sequenza proteica contiene una T-box

importante per fattori trascrizione.

VegT e Vg1 attivano dei geni mesodermici, come il primo gene mesodermico in assoluto,

chiamato Xbra (Xneopus brachyury).

Ibridazione in situ di Xbra, in foto si osserva un anello blu, che corrisponde alla zona di

espressione di Xbra e anche alla zona marginale in cui si formerà il mesoderma.

VegT e Vg1 sono depositati nell’ovocita come mRNA; nel momento della fecondazione viene

attivata la traduzione, ma non la trascrizione.

Le proteine di VegT e Vg1 iniziano a lavorare subito dopo la fecondazione

- Vg1 fa partire la trasduzione del segnale mediante la via di segnalazione dei TGF-beta;

- VegT (fattore di trascrizione) rimane fermo e pronto in attesa che la cromatina sia resa

disponibile con la MBT.

Brachyury è uno dei primi geni attivati con la MBT, e poi, mediante un’attivazione a cascata di altri

geni, permetterà di definire la specificazione della zona marginale in mesoderma.

Xbra attiva a sua volta un fattore secreto chiamato eFGF (embrional fibroblast growth factors), è il

primo fattore espresso nell’embrione e a sua volta attiva brachyury.

Il feedback positivo che si genera fra brachyury e eFGF questo permette l’attivazione dei geni

mesodermici.

Quali molecole inducono l’organizzatore?

L’organizzatore viene identificato da una combinazione di diverse molecole che soddisfano criteri

spazio-temporali e di attività.

1. Beta-catenina

Questa è una proteina intracellulare impiegata nell’interazione con le caderine, ossia proteine di

adesione transmembrana che interagiscono tra di loro mediante la porzione extramembrana; in

presenza di calcio, hanno una struttura estesa che permette l’interazione con la caderina della

cellula adiacente.

L’immagine mostra un’immuno-staining di una blastula tardiva, fatta con l’anticorpo anti-β-

catenina; la differenza tra il lato dorsale e il lato ventrale è che in quello dorsale si riescono ad

osservare i nuclei (in quanto la β-catenina è localizzata al loro interno). 83

Via di segnalazione di Wnt e b-catenina

La beta-catenina è anche l’effettore finale nella trasduzione del segnale innescata dalle proteine

della famiglia Wnt (omologo di wingless in Drosophila); la via di segnalazione è totalmente

conservata.

1. Una proteina della famiglia Wnt lega Frizzled (recettore transmembrana) e fa partire la

trasduzione del segnale;

2. I domini intracellulari di Frizzled interagiscono con Dishevelled (Dsh), il quale va ad inibire

la GSK-3 (glicogeno sintasi chinasi 3);

3. GSK3 a cose normali interagisce con altre proteine (es. APC, Axin) a formare un

complesso; se la GSK3 non è inibita, il complesso va a legare la β-catenina e la porta

verso la degradazione.

4. Se invece la GSK3 viene inibita da Dsh, non può esserci la degradazione della β-

catenina, e quindi essa in parte andrà a funzionare come ancora intracellulare per le

caderine.

5. In parte la beta-catenina andrà a legare, nel nucleo, il cofattore LEF/Tcf, formando un

complesso che va a legare promotori specifici per far partire la trascrizione di geni

specifici.

In assenza di β-catenina, LEF/Tct non è libero nel nucleoplasma, bensì si trova associato ai

promotori di geni specifici e ne inibisce la trascrizione, infatti solo con la β-catenina può

formarsi un complesso in grado di attivare la trascrizione.

L’attivazione dorsale della beta-catenina è mediata dalla rotazione corticale

Nella cortex vegetativa dell’ovocita sono presenti dei complessi proteici contenenti le proteine

essenziali per la via di segnalazione della β-catenina

- Dsh, Wnt11 e GBP (GSK3 binding protein);

In seguito alla rotazione corticale, questi granuli vengono spostati di 40° dalla posizione originaria

verso la regione dorsale.

Alla fine della rotazione (sempre allo stadio di 1 cellula), i complessi rilasciano il loro contenuto e

formano un gradiente di concentrazione dorso-ventrale

- la concentrazione più alta è sul lato dorsale, e spostandosi verso il lato ventrale essa va

esaurendosi; 84

Dsh e GBP legano e inibiscono l’azione di GSK3

Dsh va ad inibire la GSK3, quindi blocca la degradazione della β-catenina mediata dalla

fosforilazione della GSK3; la β-catenina entra nel nucleo e si lega a LEF/Tcf.

GBP è anch’esso un inibitore della GSK3, quindi permette il mantenimento della β-catenina.

Wnt11 è un fattore della famiglia Wnt che agisce per primo nella catena di trasduzione del segnale

che porta all’attivazione di Dsh.

Wnt11 assicura che venga attivato nuovo Dsh, così che sia mantenuta l’inibizione.

Il gradiente di concentrazione delle tre proteine ha come conseguenza che sul futuro lato dorsale

dell’embrione sia possibile l’accumulo di β-catenina, mentre sul futuro lato ventrale no, poiché

qui la concentrazione delle tre proteine è troppo bassa per inibire GSK3.

A questo punto l’embrione si cellularizza, quindi ogni cellula/nucleo riceverà, in base al gradiente

presente nel citoplasma, diversi livelli di stabilizzazione della β-catenina, ovvero diverse

concentrazioni di Dsh, GBP e Wnt11.

Il complesso β-catenina-LEF/Tcf si lega ai promotori di numerosi geni, la cui attività è di cruciale

importanza per la formazione dell’asse dorsoventrale.

In Xenopus, quando si vogliono bloccare molecole specifiche, un metodo utilizzato prevede

l’iniezione di una molecola antisenso di sintesi chiamata morpholino (non è né DNA né RNA),

costituita da basi tenute insieme da un anello morfolinico.

Se si inserisce precocemente, va a legarsi all’mRNA della molecola bersaglio e ne blocca la

possibilità di essere tradotto.

Se per esempio si blocca Dsh, anche se si è in presenza di Wnt11, che si lega a Frizzled, la GSK3

non viene inibita perché Frizzled non ha niente a cui legarsi.

- Dsh è sicuramente la molecola più importante per la dorsalizzazione; 85

Mec