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Il CICLO CELLULARE serve alla cellula per crescere e dividersi, e spesso è anche caratteristica di ogni tipo

cellulare. Per alcune cellule, per esempio le staminali, è prevista una proliferazione più sporadica rispetto

ad altre.

Cellule post mitotiche sono cellule che vivono in G0 quindi non si dividono più, alcune pero non perdono la

capacita di dividersi e sotto determinati stimoli possono rientrare nel ciclo cellulare, come gli EPATOCITI.

Anche la durata del ciclo cellulare varia in base alle cellule, infatti le cellule del lievito hanno un tempo

molto breve, in 90 min concludono il loro ciclo, mentre le cellule di mammifero in attiva proliferazione

hanno un ciclo molto più lungo di circa 20 ore.

Le cellule uovo di anfibi, successivamente alla fecondazione, lo zigote va incontro a divisioni molto rapide

che si chiamano DIVISIONI DI CLIVAGGIO. Le cellule diventano sempre più piccole perché non hanno tempo

di crescita, sono moltissime ma di piccolissime dimensioni.

I TRE SISTEMI EUCATIOTICI IN CUI IL CICLO CELLULARE è STATO MAGGIORMENTE STUDIATO:

- LE CELLULE DEL MAMMIFERO IN COLTURA

- GLI EMBRIONI ANIMALI (anfibi, molluschi… )

- LIEVITI

Questi studi hanno permesso di conoscere i meccanismi alla base del ciclo cellulare.

CELLULE DI MAMMIFERO IN COLTURA

Le cellule isolate in coltura in particolare nei primi anni 70’

sono stati fatti esperimenti di fusione cellulare, l’ipotesi era di

scoprire cosa controllasse il ciclo cellulare e hanno scoperto

l’esistenza di segnali chimici che regolano il ciclo cellulare e

diffondono dal nucleo al citoplasma.

L’sperimento prevedeva cellule che si trovavano in fasi diversi,

una in fase S quindi stava duplicando mentre l’altra in G1 non

stava ancora duplicando. Veniva usato un virus inattivato per

farle fondere e formare un ETEROCARION, infatti il nucleo in

G1 entrava in fase S. Fondendo una cellula in fase M e una in

G1, la seconda entrava in fase M senza il passaggio nella fase S.

Quindi nel citoplasma della cellula in M deve esserci un fattore

chimico che stimola la cellula nella fase M.

VARIE COMBINAZIONI DI FUSIONE CELLULARI.

Sono esperimenti di fusione cellulare dei primi anni 70 (P. Rao e R. Johnson)

Nel PRIMO caso il nucleo in G1 iniziava subito a duplicare del DNA, ATTIVATORE DELLA FASE S; nel

SECONDO CASO il nucleo in G2 ini iniziava la sintesi di DNA, evidentemente la duplicazione del DNA era

impedita prima che la fase M fosse avvenuta; nel TERZO caso l’eterocarion G1-G2 non proseguiva in fase ,

evidentemente il passaggio attraverso la mitosi era necessario per ripristinare l’abilità di duplicare il DNA.

Le HeLasono state le prime cellule umane «immortalizzate» (linea continua) utilizzate ed hanno

rappresentato una grande risorsa per la ricerca scientifica. Furono isolate daGeorge Otto Geynel 1951 da

una biopsiadella massa tumorale (tumore cervice uterina) di una paziente.

Le cellule Hela in fase M fuse con cellule PtK2 in G1, in S e in G2. Nelle Hela c’è qualcosa che spinge il nucleo

delle altre ad entrare in fase M e si può vedere chiaramente dalla condensazione che avviene subito dopo

la fusione. La cromatina deve potersi far leggere e la cromatina provocata immediatamente un aspetto

polverizzato, perché l’improvvisa condensazione di una cromatina che si sta duplicando e quindi è rilassata

porta a questo stato.

EMBRIONI ANIMALI

Le cellule uovo di molti animali sono molto grandi, perché accumulano nel citoplasma molte riserve per le

successive rapide divisioni. Con una centrifugazione, si ottiene una grande quantità di citoplasma che

contiene quei fattori solubili, SELF FREE SYSTEM.

Il citoplasma può essere usato per studi in provetta e queste cellule inoltre sono facilmente microignettabili

grazie alle loro dimensioni. Quindi è possibile estrarre il citoplasma di una cellula uovo matura e iniettarlo

in un oocita, ottenendo una cellula uovo matura. Nelle divisioni di clivaggio, la cellula gigante fecondata va

incontro a rapidissime (30 minuti) divisioni successive producendo un embrione costituito da migliaia di

cellule più piccole.

Cicli semplificati, solo S e M, senza fasi gap di controllo.

La cellula uovo in natura è ferma in G2, la stimolazione ormonale, cioè progesterone fa maturare questa

cellula uovo e fa entrare questa cellula immatura in meiosi, la seconda meiosi invece si ferma in metafase

della seconda divisione meiotica, sarà la fecondazione tramite spermatozoo a far concludere lo sviluppo.

Il PROGESTERONE è LO STIMOLO che fa maturare l’oocita. Negli oociti di anfibi si vide che se si prelevava

con una centrifugazione il citoplasma di un oocita fermo in metafase della seconda divisione, questo

citoplasma veniva iniettato in un oocita immaturo in G2, questo subito andava in metafase senza lo stimolo

del progesterone. Quindi nell’oocita maturo in M, doveva esserci un fattore che stimolava quello immaturo

a passare anche lui in fase M. il fattore fu chiamato MPF. Dimostrarono che aveva importanza anche alle

fasi successive alla metafase, infatti anche nelle fasi successive delle divisioni di clivaggio, questo fattore er

molto importante, l’esperimento fu fatto nelle cellule di rana.

Nel 1981 riuscirono a purificare MPF e scoprirono CDK.

I LIEVITI

I lieviti sono stato un altro modello sperimentale molto importanti per lo studio dei meccanismi di

regolazione del ciclo cellulare. Nel 2001 fu dato il premio nobel per questi studi.

SACCARMICES CEREVISEA, ha un ciclo cellulare molto breve e si può avere molte cellule in pochissimo

tempo. Il lievito può essere coltivato sia in terreni liquidi che solidi e può essere conservato anche a basse

temperature e scongelato dopo molti anni, come cellule eucariote ha un genoma mitocondriale e il suo

genoma di 6000 geni, 200 sono coinvolti in patologie umane. Sono importanti per gli studi. Il terzo

cromosoma, è stato il primo cromosoma ad essere sequenziato. Questo essere esiste sia in forma diploide

che aploide e si può dividere sia asessualmente per gemmazione o sessualmente. L’altro lievito è

schizzosaccharomices che si duplica per scissione, ha delle dimensioni maggiori e in natura ha la forma

aploide, in situazione di stress può esserci una fusione tra aploide e lo zigote si divide subito formando le

aploide. Rispetto al prima ha un genoma più piccolo, anche il suo genoma è stato sequenziato.

Sono cellule eucariotiche pluricellulari con un tempo di duplicazione veloce e sappiamo come sequenziare i

geni. Sono stati isolati dei MUTANTI CONDIZIONATI cioè dei mutanti su geni cruciali che si sono rivelati

cruciali per il controllo cellulare, questi mutanti hanno portato alla conoscenza dei fattori Cd.

I mutanti condizionati sono mutanti con un fenotipo diverso asseconda della temperatura. Ad una

temperatura più bassa il fenotipo non è evidente.

Passando alla temperatura restrittiva, viene espresso il gene e le cellule si bloccano in una fase cioè quella

fase in cui quel fattore proteico dovrebbe funzionare.

Si intuisce la funzione di quel gene nel punto in cui quelle cellule di fermano. Cdc sono geni che controllano

il ciclo e che se mutati mettono fuori uso i componenti del ciclo cellulare e lo studio della funzione di quel

gene ha permesso di capire la funzione chinasica di questi enzimi e capire le CDK.

I geni coinvolti nel ciclo sono stati scoperti grazie alla scoperta di alcuni mutanti temperatura sensibili nei

lieviti. Una mutazione può non essere compatibile con la vita cellulare stessa. Ad una temperatura

permissiva bassa il gene riesce a funzionare ma non riesce a funzionare ad una temperatura restrittiva che

è alta, quindi il prodotto proteico non è piu funzionante e avviene il l’arresto della progressione del ciclo.

Sono stati trovati i geni CDC, cioè i geni del ciclo cellulare, sono proteine chinasiche dipendenti dalle cicline

e sono quelli che controllano le varie fasi. Hartwell e Nurse dimostrarono che le cellule di lievito

smettevano di crescere e si arrestavano in punti precisi del ciclo cellulare quando un gene chiamato p34

cdc2 in S. pombe e CDC28 in S. cerevisiae era mutato. Tali geni codificavano per proteine con attività

chinasica e sono omologhi dal punto di vista funzionale. L’isolamento e lo studio di questi geni fu favorito

grazie al fatto che cerevisiae vive in forma aploide ed è facile studiarlo e scoprirono che questi due geni

codificavano due chinasi. Fu identificato il gene umano che codifica per CDC2 che se fatto esprimere in

cellule di lievito funziona perfettamente.

LE BASI MOLECOLARI DELLA REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE SONO STRAORDINARIAMENTE

CONSERVATE ATTRAVERSO L’EVOLUZIONE DEGLI EUCARIOTI

Tim Hunt utilizzo le uova di riccio di mare fecondate e studiava in essi la sintesi proteica. Prima venivano

fecondate in acqua con metionina marcata con zolfo35, i ribosomi in questo modo avrebbero sintetizzato

proteine con metionina radioattiva. Lui osservo a intervalli di tempo regolare i ricci di mare fecondati in

acqua, faceva un lisato e separava le proteine mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con un gel

SDS page. Lui osservo le bande corrispondenti alle proteine marcate e vide chiaramente che c’era una

proteina di un preciso peso molecolare la cui banda aumentava, scompariva, aumentava e scompariva di

nuovo. Hunt aveva scoperto le CICLINE, la sua vita vedeva un ciclo di sintesi e degradazione, sintesi e

degradazione. Seguendo l’andamento temporale della concentrazione della ciclina, capi che c’era una

correlazione. MPF, il complesso CDK con la ciclina, correlava le divisioni della cellula uovo fecondata.

Con tutte queste scoperte era stato scoperto un modello che vedeva aumentare le cicline nell’interfase,

raggiungeva il massimo della concentrazione durante la divisione e poi veniva degradata. Ciclina A, viene

clonata e sequenziata nei molluschi e ci fu un lavoro che dimostro che questa ciclina inserita negli oociti

immaturi di anfibio induceva gli stessi effetti del progesterone. L’andamento del ciclo correlava con

l’attività dell’MPF ma anche con l’andamento della concentrazione delle cicline. L’osservazione che il

comportamento oscillatorio della ciclina rispecchiava quello di MPF, che MPF possedeva attività chinasica,

che era costituito da due subunità, portò all’ipotesi, poi estesamente verificata, che ciclina (subunità

regolatoria) e chinasi cdc2 (subunità catalitica) fossero le due subunità di MPF.

Quando la concentrazione di ciclina è bassa, la chinasi priva della subunità di ciclina è inattiva.

Quando la concentrazione di ciclina è sufficientemente alta, la chinasi è attiva.

QUINDI:

➢La progressione attraverso il ciclo delle cellule dipende da un enzima che fosforila altre proteine

substrato a livello di residui di serina e treonina in modo ATP dipendente.

➢L’attività della chinasi è controllata da una subunità la cui concentrazione varia da uno stadio ad un altro

del ciclo cellulare.

La loro concentrazione si può considerare costante durante il ciclo, ciò che cambia è l’attività stessa che

viene regolata tramite la regolazione della concentrazione delle cicline. Sicuramente perché questa chinasi

possa lavorare ha bisogno della ciclina e formare il complesso.

L’EVENTO PILOTA CHE GUIDA LA CELLULA ATTRAVERSO IL CICLO CELLULARE E’ LA FORMAZIONE DEL

COMPLESSO CICLINA/Cdk

Il complesso ciclina+CDK, quando è attivo fosforila proteine bersaglio a livello di specifici residui di serina e

treonina modulandone l’attività, per essere attivo l’enzima stesso subisce fosforilazione e defosforilazione.

- Regolazione che fosforila e defosforila l’enzima stesso, quindi entrano in gioco altre chinasi e

fosfatasi. La stessa CDK che fosforila le proteine bersaglio, è regolata per fosforilazione e

defosforilazioni.

Vengono fatte varie catene di ubiquitina che si legano alle cicline quando devono essere degradate. La

cellula controlla l’attività del complesso CDK anche controllando la localizzazione delle cicline stesse.

Se le cicline sono presenti ma sono nel citoplasma e il CDK è nel nucleo, le cicline non trovano il partner

quindi un'altra regolazione è quella di capire dove stanno le cicline.

Ci sono anche inibitori che si legano alla CDK o al complesso intero per inibirli, quindi la sintesi e l’attività

degli inibitori stessi è controllata per controllare il complesso. Rispetto al modello del 1988 sono stati fatti

grandissimi progressi.

Il fatto che una cellula in G1 riesce a superare il punto di star che le permette di entrare in S, ha bisogno di

un controllo ambientale, cioè controllano se hanno sufficienti nutrienti e se la cellula è sufficientemente

cresciuta. Passando dagli unicellulari ai pluricellulari, il controllo ambientale prevede degli stimoli dai fattori

di crescita che permettono di superare il punto di start o restrizione.

Quando il punto di transizione è stato superato, il passaggio è irreversibile, sono previsti dei meccanismi

d’arresto per dar modo alla cellula di correggere gli errori ma il processo avviato deve procedere.

I meccanismi di regolazione sono complessi ma molto forti e c’è una certa ridodndanza nei meccanismi di

controllo in modo che se ci sono delle mutazioni ci sono dei backup che permetto di andare avanti anche se

manca un elemento di controllo.

I punti di controllo principali sono tre ma se durante la duplicazione del DNA si interferisce, la cellula si

ferma cercando di rimediare il danno, quindi oltre ai principali 3 checkpoint, ci sono vari sensori durante

tutto il ciclo. Il primo controllo è tra la fine della G1 e l’inizio della S, si chiama punto di START nei lieviti e

PUNTO DI RESTRIZIONE nei vertebrati. Fattori di crescita, fattori ambientali e crescita della cellula sono le

principali caratteristiche, l’altro punto è tra INTERFASE e fase M, oltre alle dimensioni della cellula si guarda

anche il DNA duplicato che non deve avere danni, anche prima dell’anafase, durante la fase M, la cellula

controlla il fuso mitotico prima di spartire il DNA diviso, un fuso mal assemblato porterebbe una

ripartizione anomala tra le due cellule.

PUNTO DI RESTRIZIONE: nel caso dei lieviti questo punto è influenzato dai

nutrienti, dalla dimensione della cellula e da altri fattori, il suo punto di

START è il punto principale di controllo, infatti la G2 è praticamente assente

e dalla S si passa quasi subito alla fase M, quindi si controlla quasi tutto

all’inizio. Diversamente avviene in quelli che si dividono per scissione

binaria, infatti questi hanno un controllo anche tra G2 ed M, regolato dalla

dimensione della cellula e dalla disponibilità dei nutrienti. Nelle cellule

animali il “punto di restrizione” è il principale punto di controllo, il nostro

ovocita immaturo è fermo in G2 aspettando la fecondazione. La

disponibilità di fattori di crescita o mitogeni, sono quelli che la spingeranno

in fase S. la durata della fase G1 è la più variabile, infatti alcune cellule

rimangono per giorni od anni, altre rimangono in una G1 specializzata per

tutta la vita e non entreranno mai in S.

La CDK deve associarsi alla ciclina partner, ma oltre a questo complesso servono gli eventi di fosforilazione

e defosforilazione, quindi CDK viene fosforilata a livello di un residuo di treonina 161 tramite un enzima che

si chiama CAK, chinasi-cdk-attiva. Questa chinasi permette l’attività di CDK aggiungendo un fosfato dopo

che questa ha formato il complesso con la ciclina.

La CDK cambia la conformazione quando si lega con la ciclina ma il sito

catalitico si apre completamente quando viene fosforilata, inoltre subisce

un'altra fosforilazione che ha un ruolo inibitorio, questo avviene grazie ad

un’altra chinasi Wee1 a livello di tirosina 15 e treonina14 , questi fosfati

con ruolo inibitorio devono essere tolti da una fosfatasi per poter rendere

completamento attivo il complesso.

ATTIVAZIONE COMPLESSO

-CDK si lega alla ciclina

- fosforilazione da parte di CAK

- eliminazione grazie a Cdc25 dei fosfati a livello della treonina 14 e

tirosina 15

Wee1 fu chiamata cosi perche trovarono mutanti di lievito “corti”, da qui deriva la parola, mente Cdc25

erano mutanti lunghi. Questo si spiega perche se Wee1 è mutata e non funziona, CDK-ciclina è sempre

attiva e si entra subito in mitosi mentre se vien mutata CDC25 le cellule si allungano e continuano a

crescere senza dividersi mai.

Nei Vertebrati

G1 ciclina D CDK4,6

G1/S ciclina E CDK2

S ciclina A CDK2, CDK1/Cdc2

M ciclina B CDK1/Cdc2

Le concentrazioni delle tre principali classi di cicline

variano durante il ciclo cellulare mentre quelle delle

chinasi dipendenti dalle cicline non variano.

Molti eucarioti pluricellulari possiedono più di una

ciclina per ciascuna classe e molte Cdk

Possibilità di formare un grande numero di complessi diversi nei diversi momenti del ciclo cellulare

Regolazione temporale e spaziale Cicline diverse della stessa classe espresse in localizzazioni cellulari

distinte o in tipi cellulari distinti o in momenti diversi. IL CICLO CELLULARE è SPECIFICO PER OGNI TIPO

CELLULARE. La ciclina non attiva semplicemente la Cdk ma la dirige verso specifiche proteine substrato. Lo

stesso complesso può evocare effetti diversi in momenti diversi del ciclo, in base probabilmente alla diversa

accessibilità/disponibilità dei substrati.

I complessi ciclina CDK possono essere regolati mediante

attacco di proteine inibitrici della CDK (CKI), soprattutto nelle

fasi iniziali del ciclo cellulare.

P27 fa riarrangiare il complesso in modo che CDK con la sua

ciclina diventi inattivo, creando una distorsione del sito attivo.

Ci sono molti altri inibitori, si dividono in due famiglie, P27, P21

e P57 sono la famiglia Cip/Kip, entrano in gioco in fase G1, G1/S

e S. bloccano i complessi:

Ciclina D/Cdk4/6

Ciclina A/Cdk2

Ciclina E/Cdk2

Mentre la Famiglia INK4 (p15, p16, p18, p19) entrano in gioco in fase G1 Bloccano i complessi:

CiclinaD/Cdk4 e Cdk6

I membri della famiglia Cip/Kip formano un complesso con ciclina/Cdk inattivandolo, mentre i membri della

famiglia INK4 si associano con le chinasi impedendo loro la formazione del complesso con le cicline.

DEGRADAZIONE DELLE CICLINE

Le cicline hanno una breve sequenza all’estremità amino-terminale chiamata destruction box che

rappresenta un bersaglio per la degradazione proteolitica ubiquitina-dipendente a livello del proteasoma.

Eliminando infatti queste sequenze sperimentalmente si osserva un blocco in anafase e la mitosi non viene

terminata. Differentemente dalla fosforilazione, la degradazione è un evento irreversibile.

Le proteine destinate ad essere distrutte vengono legate ad un certo numero di ubiquitine a livello di un

residuo di lisina. L’ubiquitina viene trasferita da una proteina carrier costituita da una grande famiglia di E3-

ubiquitina ligasi. E3 presuppone il precedente intervento di E1, enzimi che attivano l’ubiquitina e E2, enzimi

che coniugano l’ubiquitina. Una volta poliubiquitinata la proteina viene riconosciuta dal proteasoma,

complesso macromolecolare presente sia nel nucleo che nel citoplasma, a forma di un cilindro cavo

all’interno del quale avviene la degradazione della proteina grazie ad enzimi proteolitici (anelli centrali,

subunità beta del cilindro).

Il controllo della proteolisi avviene da parte di APC/C

(complesso di promozione dell’anafase/ ciclosoma)

durante il ciclo cellulare. Permette la progressione

metafase/anafase catalizzando l’ubiquitinazione di

securina e delle cicline M e S. APC/C si associa con

subunità attivanti: Cdc20 nella anafase tardiva e

Cdh1 dalla mitosi tardiva fino alla G1 precoce

aiutano APC/C a riconoscere i suoi substrati.

Avviene un controllo della proteolisi da parte di SCF

durante il ciclo cellulare. L’attività di SCF a differenza

di APC/C è costante durante il ciclo cellulare, è

controllata dallo stato di fosforilazione delle sue

proteine bersaglio. Aiuta la progressione G1/S ubiquitinando CKI nella fase G1 tardiva.

Degradazione delle proteine per una ubiquitinazione. Complesso APC ciclosoma che promuove l’anafase, è

un complesso multiproteico che si attivera in anafase e sara responsabile del completamento della mitosi.

Questo complesso promuove l’anafase ed ha un attività E3 ubiquitina ligasi, trasferisce l’ubiquitina sulle

proteine bersaglio, è responsabile della degradazione a livello del protoseoma delle cicline. Se le cicline S

vengono poliubiquitinate e degradate, l’attività chinasica della CDK si spenge. Dall’anafase in poi l’attività

delle CDK viene spente e APC permette di completare la mitosi.

Non è l’unico complesso con E3 ubiquitino ligasi, ma anche SCF è un complesso con le stesse funzioni di

APC ma a differenza di questo, entra in funzione in interfase G1-S e uno dei bersagli sono gli inibitori di

CDK, quindi se sono state sintetizzate gli inibitori di CDK, CKi, è necessario che qualcuno degradi gli inibitori

per far procedere il processo. Quindi SCF perfette l’entrata in S.

Se il proteosoma non funziona le proteine non vengono degradate perché le cellule si bloccano in uno stato

tardivo della mitosi. APC ciclosoma rimane attivo fino alla fine della mitosi e nella G1 della cellula

successiva finché non verranno di nuovo prodotte le cicline.

Quando APC cilosoma è attivo non ci possono essere CDK attive e viceversa. Il complesso SCF è attivo dalla

fine della G1 in fase S e G2e diminuisce alla fine della mitosi.

CONTROLLO DELLA LOCALIZAZIONE DELLE STRUTTURE DELLE CDK E CICLINE.

Facendo stare le cicline nel nucleo o nel citoplasma la cellula può controllare l’attività delle CDK. Sono stati

fatti studi sia negli oociti di anfici che in cellule di mammifero in coltura che hanno dimostrato che esistono

diversi complessi ciclina-CDK che regolano diversi processi della mitosi. La cromatina passa da una forma

rilassata ad una condensata quindi questo deve avvenire dentro al nucleo, mentre l’assemblaggio del fuso o

il disassemblaggio del golgi, sono eventi fuori dal nucleo quindi se la CDK con la ciclina deve render conto di

questi eventi sia dentro che fuori del nucleo, devono esserci complessi differentemente localizzati e la

cellula usa il controllo di questa localizzazione per controllare il ciclo.

La ciclina B umana è stata studiata in cellule Hela ed è stato visto che in interfase e in profase si può vedere

che la fluorescenza verde che indica la ciclina B non è nucleare ma è fuori dal nucleo, passando alla profase

il segnale verde è anche nel nucleo, quindi la ciclina è stata rilocalizzata.

Ci deve essere un trasportatore della ciclina, questa ha una sequenza che si chiama NES ed è responsabile

del trasfoporto nulceare ed è formata da 4 serine che vengono fosforilate. La fosforilazione della ser 113 è

richiesta per prevenire il legame della ciclina B1 al trasportatore CRM1 responsabile per l’uscita dal nucleo.

Gli studi sembrano dimostrare che piu che un accumulo di ciclina nell’interfase nel citoplasma, si tratta di

un’estrema lentezza di trasporto nel nucleo, quindi è la velocita che cambia passando dall’interfase alla

profase. All’inizio della mitosi, l’entrata nel nucleo diventa molto più rapida, in seguito alla fosforilazione di

tutti i 4 residui di serina.

Sono stati fatti esperimenti con topi KO per Cdk1, ciclina B, ciclina, A, ciclina E muoiono durante lo sviluppo

embrionale. Quelli per ciclina D1 sono piccoli e presentano problemi di proliferazione cellulare a livello

della retina. Quelli per la Cdk2 presentano difetti a livello della meiosi, per la Cdk4 mancano nel pancreas

delle cellule che producono insulina. Studi effettuati su topi KO per le diverse Cdk hanno messo in evidenza

che topi che mancano di Cdk1 muoiono durante la vita fetale, mentre topi che mancano delle altre chinasi

muoiono alla nascita ma si sviluppano fino alla comparsa degli organi. Le cellule ottenute da questi

embrioni proliferano anche se più lentamente in coltura: solo Cdk1/Cdc2 è essenziale per il ciclo cellulare,

per le altre si assiste a un fenomeno di ridondanza.

Entrata in fase M:

MPF è il complesso CDK-Ciclina mitotica.

Per entrare in M, la CDK1 è in una concentrazione costante, quello che si regola è la sua attività. All’inizio è

senza ciclina, quindi per l’attivazione dell’MPF deve essere formata la ciclina. Questo complesso richiede

pero un altro controllo attraverso la fosforilazione attraverso CAK. Questa chinasi fosforila alla treonina 161

attivando la CDK, ma entra in gioco anche la chinasi Wee1 che aggiunge fosfati a treonina 15 e 14 che

hanno ruolo inibitorio e finche sono fosforilati il complesso è inattivo. Deve entrare in gioco Cdc25 che

elimina i fosfati con ruolo inibitorio e rende il complesso attivo.

La ciclina B comincia ad essere sintetizzata in fase G2, la cellula taper entrare in fase M, la piena attivazione

avverra grazie a Cdc25.

La stessa Cdk con la ciclina inibisce Wee1 e fosforila Cdc25 per renderlo funzionante.

Wee1 fosforila Cdc2 in Tyr 15

Myt1 fosforila Cdc2 in Thr 14

CAK fosforila Cdc2 in Thr 161

Sarà MPF stesso che attiva il meccanismo che lo farà distruggere e spengere quando arriverà alla fine della

mitosi.

MITOSI PRECOCE Profase e metafase sono a carico di MPF

MITOSI TARDIVA inibita MPF ed entrata in gioco di APC

MITOSI PRECOCE grazie alla fosfatasi MPF è attivo. Altre chinasi sono POLO e AURORA A e AURORA B sono

aiutanti della MPF che le regola.

Deve condensarsi la cromatina, i cromosomi diventano visibili, si deve formare il fuso, l’apparato del golgi e

l’involucro nucleare saranno frammentati, questi processi vengono controllati da MPF.

FORMAZIONE DEL FUSO MITOTICO.

La segregazione dei microtubuli dipende da una straordinaria schiera bipolare di microtubuli. Nella maggior

parte delle cellule somatiche degli animali i poli del fuso sono localizzati a livello del centrosoma composto

da una nuvola di materiale amorfo (matrice pericentriolare) che circonda una coppia di centrioli. Sono

presenti anelli di g-tubulina, motori proteici dei microtubuli, e proteine strutturali.

Le estremità + sia di quelli interni che quelli che agganciano il centrosoma, si allontana dal centrosoma.

Sono importanti le chinesine e le dineine che permettono il movimento dei microtubuli, accorciamento e

allungamento.

Si è visto che distruggendo il centrosoma , i microtubuli ci sono lo stesso quindi non sono essenziali, il

cromosoma stesso organizza i microtubuli. Quando la cellula entra in fase S, le G1/S-Cdk avviano la

duplicazione dei centrosomi che similmente al DNA vengono duplicati in modo semiconservativo e una sola

volta. All’inizio della mitosi M-Cdk inizia l’assemblaggio del fuso e i due centrosomi si separano lungo

l’involucro nucleare. Prima che la cellula entri in fase M i centrioli vengono duplicati.

Durante la mitosi l’instabilità dei microtubuli (emivita e il numero di catastrofi) aumenta di molto. Il

citoscheletro è caratterizzato da molta dinamicità. Durante la mitosi questa instabilità è data dal fatto che

MPF fosforila le MAP che sono proteine associate ai microtubili, i fattori di catastrofe e i motori proteici.

I microtubuli del fuso sono attaccati ad ogni cromatide fratello a livello del cinetocore, struttura proteica

sull’eterocromatina a livello del cinetocore. Il cinetocore è una piastra a cui si attaccano vari microtubuli.

Le COESINE aiutano a mantenere uniti i cromatidi fratelli, saranno degradate in anafase quando verranno

separati. Sono proteine multimeriche formate da cinque subunitàe funzionano come degli anelli che

circondano i due cromatidi fratelli a livello del centromero.

Le CONDENSINE favoriscono la condensazione della cromatine e sono attivate da MPF. Sono formate da

cinque sub unità che uniscono le anse della cromatina favorendone la condensazione. M-Cdk induce la

fosforilazione della condensina Durante la profase, la coesina viene fosforilata da due importanti chinasi

che coadiuvano le Cdk, Polo-like e Aurora B e si dissocia dai bracci cromosomici. La coesina rimane a livello

dei centromeri per la presenza di una fosfatasi fino all’anafase, a livello del centromero c’è una fosfatasi

che impedisce a polo e aurora di funzionare anche sul centromero.

Nelle cellule animali il completamento dell’assemblaggio del fuso richiede la demolizione dell’involucro

nucleare . M-Cdk fosforila subunità del poro nucleare e componenti della lamina, le lamine che la

compongono vengono fosforilate da MPF provocando una frammentazione in vescicole lipoproteiche

dell’involucro.

La cellula ha raggiunto la metafase e i cromosomi si trovano nella piastra metafisica. Questo passaggio è

piuttosto lungo, poi l’anafase è molto veloce. Ci impiegano più ad essere sistemati sulla piastra che ad

essere separati. Se finora tutti i processi sono stati seguiti da Cdk1-ciclina B (MPF) adesso entra in gioco

APC ciclosoma, che ha un’attività E3 ubiquitino ligasica.

I suoi bersagli sono le cicline. Quando APC ciclosoma viene attivato, attacca molecole di ubiquitina a cicline

B e anche cicline S che vengono indirizzate al proteo soma e degradate. In anafase le coesine che stavano al

centromero devono essere degradate per permettere la separazione dei cromatidi fratelli, e verrà fatto

dalla SEPARASI che rompe le coesine. La SEPARASI deve entrare in gioco solo in anafase, infatti è inibita

dalla SECURINA. Sarà APC ciclosoma che inibisce la securina che a sua volta non potrà inibire la separasi e i

le coesine verranno degradate e potrà avvenire la segregazione dei cromatidi fratelli.

Quando APC si lega a Cdc20 si attiva, infatti fino all’anafase la sintesi di questa subunità regolatoria

aumenta. Cdc20 per associarsi ad APC ciclosoma e renderlo attiva DEVE ESSERE FOSFORILATO e questo

avverrà grazie a MPF. Quindi la stessa attività chinasica di MPF servirà per distruggere il proprio complesso

perché APC distruggerà le cicline.

Quando MPF viene spento, come si fa ad attivare Cdc20? Quando non c’è piu MPF entra in gioco un altro

partner che si attiva con la defosforilazione. M-Cdk stimola l’attività di Cdc20-APC/C, la distruzione delle

cicline M inattiva quindi Cdc20-APC/C. APC/C è attivato anche successivamente da Cdh1, inibito da M-Cdk

per fosforilazione. La distruzione della ciclina M dopo la mitosi continua ad opera di cdh1- APC/C.

Inoltre, in G1 aumenta l’espressione di CKI che complessandosi a Cdk le inattiva. (Sic1 in lievito e p27 nei

mammiferi). L’inattivazione di M-Cdk deriva anche da una diminuita espressione di cicline mitotiche.

Si può distinguerà un’anafase A e un anafase B, nella prima c’è un accorciamento dei microtubuli mentre

nella B c’è un allungamento di quelli polari che non toccano i cromosomi che permettono un

allontanamento tra i poli.

Tutto questo è reso possibile dallo spengimento dell’attivita chinasica di MPF.

Nei lieviti entrano in gioco anche delle fosfatasi che contribuiscono a rimuovere i fosfati che aveva messo

CDK.

I cromatidi di una coppia devono essere attaccati ai poli opposti del fuso mitotico. Tale bi-orientamento

avviene per tentativi e genera una tensione molto alta nel cinetocore. La mancanza di tale tensione viene

recepita da sensori (chinasi Aurora B) che disassemblano i microtubuli attaccati non in modo corretto.

Trattamenti con colchicina o vimblastina, possono arrestare la mitosi per ore. Ad una cellula vivente che

deve finire la sua fase M, la colchicina non piace, poiché è un veleno mitotico. L’esistenza di un meccanismo

di controllo del fuso (SAC) assicura che le cellule entrino in anafase se tutti i cromosomi non sono

adeguatamente attaccati al fuso. La cellula in metafase prima di entrare in anafase controlla che il fuso sia

assemblato in modo giusto, senno non passa questo check-point.

Se la cellula ha un problema a livello del fuso, il bersaglio sarà APC, infatti degli studi recenti hanno

identificato una proteina chiamata Mad2 che manda un segnale di blocco ad APC.

Se si parla di meiosi, questo non succede nella prima divisione, quindi ci sara quelacosa che protegge le

coesine che tengono uniti i cromatini fratelli, perche devono rimanere insieme. Questi meccanismi

avverranno nella seconda divisione meiotica.

Poi ci sarà una citocinesi, ma questo non avviene in tutte le cellule, nelle cellule animali si possono anche

formare delle cellule plurinulceate chiamate sincizi.

Normalmente di forma un anello contrattile che è dovuto all’assemblaggio di nuovi filamenti di actina che

dipende dalle formine che nucleano l’assemblaggio di serie parallele di filamenti di actina non ramificati.

Se la cellula deve andare incontro ad una divisione simmetrica, l’anello contrattile deve piu o meno

formarsi in modo che la cellula madre si divida in due cellule uguali, di solito è il fuso mitotico che inidica il

punto in cui la cellula madre deve dividersi. Quando l’anello contrattile si contrae, ciò che rimane del fuso

si chiama CORPO INTERMEDIO, un materiale denso che contiene i microtubuli e spesso riorienta il fuso

nella divisione successiva. Quando la cellula madre va incontro a citocinesi verranno divisi anche tutti gli

organuli. Durante la riassociazione, i frammenti dell’Apparato del Golgi si associano con i poli del fuso

garantendo un’equa ripartizione fra le due cellule figlie.

La divisione asimmetrica puo essere per quanto riguarda le cellule staminali.

Somministrando timidina triziata, precursore radioattivo del DNA, a cellule in coltura asincrone cioè non

tutte in G1 e S ma si ammettono che siano non sincronizzate, che percorrano ognuno la propria fase e

conoscendo l’intera durata del ciclo cellulare TC è possibile dopo somministrazione di timidina triziata per

un breve intervallo di tempo arrivare a determinare la durata delle varie fasi del ciclo. Come si può studiare

il ciclo cellulare?? Metodi (es di conteggio, sullo studio della proliferazione..

CITOFLUORIMETRO

Lo studio sia qualitativo che quantitativo della proliferazione assume sempre maggior importanza sia nella

ricerca di base che in quella clinica e applicata.

A flusso: il citofluorimetro è uno strumento che ci permette di misurare cellule caratterizzate dal fatto che

sono sospese in un liquido, in un mezzo fluido.

A partire da una SOSPENSIONE CELLULARE si possono studiare sia le dimensioni della cellula, la complessità

del citoplasma ed eventuali granulazioni, quindi tutta una serie di proprietà fisiche, sia, grazie all’utilizzo di

marcatori fluorescenti, anticorpi che riconoscono un particolare antigene nella cellula di nostro interesse

oppure nel caso del DNA dioduro di profidio che si intercala nel DNA, le proprietà biochimiche.

Nel citofluorimetro la cellula passa attraverso la camera di flusso dove viene colpita dalla radiazione emessa

dal laser, perciò si analizza ogni singola cellula e in tempi rapidi si analizza un numero enorme di cellule.

E’ possibile effettuare l’ANALISI MULTIPARAMETRICA, cioè sulla stessa cellula si possono ottenere più

informazioni relative a parametri diversi, sia proprietà fisiche che analisi multiparametrica su diversi

parametri.

La sospensione viene portata nel punto di interrogazione, cioè nel punto in cui la radiazione emessa da un

laser colpirà la cellula, a livello della camera di flusso, proprio da un flusso laminare. Un principio da tenere

presente è il principio della FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA.

Nel punto di interrogazione le cellule sono state ordinate e passano allineate grazie alla soluzione salina

isotonica, dove le cellule vengono sospese, che circonda la soluzione cellulare permettendone la

focalizzazione nel punto di interrogazione.

Le cellule allineate vengono trasportate nella camera di flusso dove verranno colpite dalla radiazione.

Dopo il punto di interrogazione e le cellule hanno passato la camera di flusso ci sono dei citofluorimetri in

cui queste cellule vengono poi scartate, ma altri strumenti prevedono il loro recupero e una separazione

sulla base delle proprietà fisiche e biochimiche diverse. Citofluorimetri che hanno un SELL SORTER perché si

parla di SORTING.

Il citofluorimetro deve avere una sorgente di eccitazione, nella maggior parte dei casi si tratta di laser,

sistema ottico che comprende anche un circuito che permetterà di rivelare i segnali.

E’ molto importante per il trasporto e la focalizzazione idrodinamica del campione il sistema fluidico, e per

l’elaborazione dei dati ma anche per la rappresentazione stessa un sistema elettronico.

Sono necessarie anche una serie di lenti per far collimare, convergere la radiazione monocromatica emessa

da laser nel punto di interrogazione, cioè al livello della camera di flusso.

Dopo che la radiazione ha colpito la cellula ci saranno anche dei segnali ottici da raccogliere tramite un

sistema di specchi e filtri ottici che separano le lunghezze d’onda.

Un laser dalla sorgente ottica permette di emettere una radiazione monocromatica molto intensa, in

precise regione dell’UV o del visibile. E’ molto potente, elevate potenza specifica, anche se poco

fluorocromo l’elevata potenza del laser permette di misurarla, ed è anche stabile oltre che molto intenso.

Molto frequentemente è un laser ARGOLL.

Cosa succede quando la radiazione colpisce la nostra cellula a livello del punto di interrogazione?

Quando la luce colpisce la nostra cellula ci possono essere due tipi di fenomeni:

1. LIGHT SCATTERING

2. FLUORESCENZA

1. La diffusione della luce dopo che ha colpito la cellula, i segnali che vengono raccolti e misurati ci

danno informazioni sulle caratteristiche fisiche sulla nostra popolazione cellulare. Considerando questo

fenomeno di LIGHT SCATTERING, possiamo posizionarci: lungo l’asse della luce incidente, guardando in

contro luce la cellula che viene colpita dall’altra parte dalla radiazione emessa dal laser, potendo quindi

misurare quei segnali legati alla DIFFRAZIONE. Ci mettiamo lungo l’asse della luce incidente ed è se

osservassimo la cellula in contro luce. Si parla di FORWARD SCATTER, segnale che ci dice circa le dimensioni

della cellula. Possiamo senno porci anche ortogonalmente all’asse della luce incidente. In questo caso

misuriamo dei segnali che sono legati alla RIFLESSIONE e RIFRAZIONE. Segnali SIDE SCATTER che ci danno

informazioni sul rapporto nucleo-citoplasma, complessità e architettura cellulare, eventuali granulosità

cellulari, irregolarità sulla superficie. Analizzando delle cellule sulla base di questi due fenomeni, la

radiazione colpisce la cellula a livello della camera di flusso, considerando la luce difratta, riflessa e rifratta

otteniamo una serie di informazioni per quella cellula che riguardano le dimensioni e la complessità,

granulosità ecc. Facendo per esempio un citogramma del sangue misurando i segnali di light scattering è

possibile ottenere un diagramma di dispersione a punti, ciascuno dei quali è un evento ovvero una cellula;

ognuno dei puntini è caratterizzato da un preciso valore di side scatter in ordinata e forward scatter in

ascissa. Questo diagramma e tramite il citofluorimetro per lo studio delle caratteristiche fisiche di una

popolazione cellulare, ci permette sulla base di questi segnali derivanti dalla diffusione della luce di

identificare le varie popolazioni: linfociti, monociti e granulociti. I linfociti hanno un volume ridotto

considerando il forward scatter con valori più bassi; hanno una forma abbastanza regolare con bassi valori

di side scatter in base alla irregolarità e granulosità citoplasmatica. Al contrario i granulociti con nucleo

segmentato e granulazione citoplasmatica. I monociti sono voluminosi come i granulociti ma hanno

granulazioni più fini. Arriviamo quindi dopo una certa analisi citofluorimetrica a separare diverse

popolazioni cellulari.

2. Fluorescenza come fenomeno in cui quando una molecola viene colpita da una radiazione di una

precisa lunghezza d’onda ne riemette un’altra di energia inferiore e lunghezza d’onda maggiore. Si sfrutta

questo fenomeno prima di analizzare le cellule al citofluorimetro. Le coloriamo utilizzando degli anticorpi

che riconoscono in modo molto specifico un antigene (qualsiasi molecola presente non solo sulla

membrana plasmatica, ma anche nel nucleo o nel citoplasma). Questi anticorpi devono essere resi

fluorescenti perché coniugati ai fluorocromo. Esistono altre sostanze come intercalanti DNA o RNA a doppia

elica che possono essere colorate con dei fluorocromo che si lega in modo stechiometrico a queste. Es

anticorpo legato a fluoresceina, la radiazione ad una precisa lunghezza d’onda viene assorbita dal

fluorocromo che si eccita e riemette mediante il fenomeno della fluorescenza una radiazione di energia

inferiore e lunghezza d’onda maggiore. Il fluorocromo rilascerà anche parte dell’energia assorbita mediante

emissione di calore. Quello che però andiamo a misurare è l’emissione di una radiazione a lunghezza

d’onda maggiore.

Di fluorocromi ce ne sono molti, ognuno caratterizzato dal suo preciso spettro di eccitazione, spettro di

emissione, da una precisa brillantezza. Utilizzando anticorpi diversi che vanno a legarsi ad antigeni diversi

sulla stessa cellula, purché questi anticorpi siano colorati diversi e siano coniugati a fluorocromi senza

sovrapporsi nello spettro di emissione, è possibile, sfruttando la fluorescenza di queste molecole,

effettuare delle analisi miltiparametriche considerando proprio dei parametri diversi.

L’intensità della fluorescenza dipende dal numero dei siti di legame, l’intensità aumenta proprio passando

da una condizione di pochi siti di legami a una condizione con numerosi siti.

Sulla stessa cellula io posso far un’incubazione prima di passare le cellule al citofluorimetro, le coloro

utilizzando più di un anticorpo tutti diversi, per es l’anticorpo riconosce l’antigene, non necessariamente

sulla superficie cellulare, a seconda del protocollo sperimentale l’antigene che vogliamo studiare possiamo

ritrovarlo nel citosol, dentro al mitocondrio o nel nucleo. Uso un anticorpo che riconosce e si lega in modo

specifico all’antigene, anticorpo coniugato-attaccato direttamente a un fluorocromo verde.

Contemporaneamente io tratto la stessa popolazione cellulare con un altro anticorpo che si lega in modo

specifico ad un altro antigene, e questo anticorpo non è verde, senno non li distinguo. Esso è a questo giro

direttamente coniugato ad un altro fluorocromo. Il mio laser ecciterà entrambi i fluorocromi, rimetterà

fluorescenze diverse che lo strumento mi permetterà di misurare, e posso seguire due o più parametri nella

stessa popolazione cellulare: ecco perché analisi multiparametrica.

es di MARCATURA DIRETTA dell’anticorpo, il fluorocromo di un anticorpo o l’altro è direttamente legato

all’anticorpo primario.

Esiste anche una MARCATURA INDIRETTA, quindi l’anticorpo primario si lega in modo specifico all’antigene

nella cellula, non direttamente coniugato a un fluorocromo, quindi è necessario dopo l’incubazione e dopo

aver opportunamente lavato per rimuovere l’anticorpo primario in eccesso che non si è legato, procedere

con una successiva incubazione in cui un anticorpo secondario legato al fluorocromo, rende l’antigene

rilevabile e fluorescente.

Grazie alla focalizzazione idrodinamica le nostre cellule si allineano nel punto di interrogazione e li vengono

colpite dal raggio luminoso.

Si possono generare dei fenomeni di LIGHT SCATTERING dovuti a diffrazione, rifrazione e riflessione, e

FLUORESCENZA, qualora abbia utilizzato degli anticorpi direttamente o indirettamente marcati con dei

fluorocromo, e di fatto vengono generati tutta una serie di segnali.

E’ chiaro che per procedere con la misura e l’analisi è necessario che i segnali vengano raccolti; ci sono delle

lenti, degli specchi e dei filtri che raccolgono tutti questi segnali ottici che vengono poi inviati a dei sensori

fotomoltiplicatori in grado di amplificarli e misurare loro l’ampiezza.

Il fotomoltiplicatore converte il segnale ottico in dei segnali di intensità di corrente. Trasforma tutti i questi

segnali ottici opportunamente raccolti da lenti e filtri, trasformati in segnali di intensità di corrente

elettrica.

Successivamente questi segnali analogici che variano in maniera continua rispetto al parametro analizzato,

sono digitalizzati, c’è convertitore che trasforma i segnali analogici in segnali digitali.

Questi segnali vengono poi inviati ad un elaboratore.

In tempo reale analizziamo milioni di cellule, e il sistema elettronico, dopo aver raccolto i segnali,

riconvertiti e digitalizzati, li elabora e li analizza anche da un punto di vista statistico. E’ possibile per via di

numerosi eventi analizzabili in tempo breve.

Ogni singolo valore relativo a un preciso parametro che viene misurato, dopo che è stato convertito,

amplificato ecc, viene chiamato EVENTO. I vari eventi si accumulano in una serie di canali che mi

permettono di misurare quel parametro.

I dati come possono essere rappresentati??

Nella presentazione più semplice per un evento citometrico, è un diagramma di distribuzione di frequenze,

di fatto un istogramma, che mi rappresenta la misura di un singolo parametro.

Ho in ordinata il numero di cellule, di eventi, e in ascissa ho una scala discreta della grandezza che viene

misurata.

Nel citogramma del sangue precedente avevo in ordinata il side scatter e in ascissa il forward scatter. Per

ogni cellula, evento, avevo un valore di entrambi gli scatter.

Adesso ho la grafica rappresentazione di un singolo parametro.

Vengono correlati due parametri. Ogni punto è un evento caratterizzato da un preciso valore riportato un

ordinata e in ascissa. Rappresentazione BIDIMENSIONALE di parametri.

La citofluorimetria è molto potente, permette un’analisi multiparametrica; posso seguire parallelamente

parametri diversi nella mia popolazione cellulare, posso in tempi relativamente brevi analizzare una

enorme quantità di eventi, numero di cellule. Le misurazione sono affidabili e riproducibili dal punto di vista

statistico, e data la memoria dello strumento delle acquisizioni, posso riproporli per ulteriori analisi.

Esistono dei FLUOROCROMI come IODURO DI PROPIDIO o BROMURO DI ETIDIO che si legano in modo

stechiometrico al DNA. Sono dei fluorocromi INTERCALANTI.

Quando sono liberi nel solvente non sono fluorescenti, quando invece sono legati al DNA, la loro efficienza

aumenta notevolmente.

Poiché si legano in modo stechiometrico al DNA è chiaro che la fluorescenza emessa dallo ioduro di

propidio è direttamente proporzionale alla quantità di DNA. Lo ioduro di propidio viene eccitato, assorbe

nel verde ma anche nel blu e nell’UV, e riemette ad una lunghezza d’onda di 620nm.

Si può usare un’analisi multiparametrica con degli anticorpi coniugati per es a FITH o FICOERITRINA FE, altri

fluorcromi.

E’ possibile, grazie al citofluorimetro a flusso, fare una misura del contenuto del DNA di una popolazione di

cellule. Con la citofluorimetria possiamo misurare e stimare in modo affidabile e preciso la percentuale di

cellule in G1/G0, in G2/M e in S.

Questi fluorocromi intercalanti si legano in modo stechiometrico al DNA e la fluorescenza che viene emessa

è direttamente proporzionale al contenuto di DNA. Avendo una popolazione di cellule, chi in G2, chi in S

che sta duplicando il DNA, chi in fase M, il contenuto del DNA di tutte queste cellule varia, la fluorescenza di

ioduro di propidio. Le cellule in G1 hanno una quantità di DNA minore rispetto a quelle in G2 e M che

presenteranno una quantità doppia di DNA.

Si può fare un’analisi del contenuto del DNA che permette di valutare la percentuale di cellule in G1, S, G2 e

M integrando le aree sottese al mio grafico, istogramma. Da questa analisi si può stimare la percentuale di

cellule in fase S denominata SPF, FRAZIONE DELLE CELLULE IN FASE S, S phase fraction.

Oggi la citofluorimetria viene utilizzata tantissimo per la fenotipizzazione delle cellule, capire tutta una serie

di antigeni; questa tecnica è strettamente correlata all’analisi del DNA.

L’analisi citofluorimetrica del contenuto di DNA ci da anche delle informazioni sul grado di PLOIDIA. Non

soltanto ci da una stima della percentuale di cellule nelle varie fasi, ma ci da anche informazioni sul grado di

ploidia. Questo aspetto è importante per lo studio di tumori, dove abbiamo una serie di mutazioni e

alterazioni nel contenuto di DNA.

Fra i parametri considerati, vi è un parametro derivante proprio dalla determinazione del contenuto di DNA

che prende il nome di DI, DNA INDEX. E’ il rapporto fra il contenuto di DNA nelle cellule tumorali in G0/G1,

e quello di un controllo normale diploide nella stessa fase del ciclo. Se non c’è aneupolidia, quindi queste

cellule tumorali sono sempre diploidi il DI sarà 1, viceversa se il rapporto è diverso da 1 mi indica la

presenza di aneuploidia.

Approcci metodologici per studiare la proliferazione cellulare e il ciclo, conteggio cellulare che ci da

informazioni sui trattamenti che hanno promosso o meno la proliferazione cellulare, quindi la progressione

in ciclo. Dosaggio di DNA, RNA e PROTEINE, e alle tecniche IMMUNOSTOCHIMICHE utilizzando quegli

antigeni della proliferazione.

Potenza della tecnica citofluorimetrica per l’analisi del ciclo, e utilizzando anticorpi legati a un qualsiasi

antigene purché l’anticorpo sia disponibile, sfruttando il fenomeno della fluorescenza posso analizzare

proprietà biochimiche.

Riferiti al ciclo e alla proliferazione cellulare analisi del contenuto di DNA, fluorocromi intercalanti, ioduro di

propidio, caratteristiche e fluorescenza (nulla se liberi nei solventi).

In una cellula intatta non penetrano, ecco che quindi si effettua una sospensione isotonica per provocare

una lisi osmotica della cellula e questo punto si fa una breve incubazione con il fluorcromo intercalante che

si intercala nella doppia elica del DNA.

Sia lo ioduro di propidio PI che il bromuro di etidio EB si intercalano con il DNA, ma anche quando l’RNA

forma una doppia elica. Dopo la lisi osmotica, prima di colorare con PI o EB, si fa una digestione enzimatica

che elimina l’RNA, per misurare la fluorescenza relativa solo al DNA.

A questo punto tramite un istogramma che mi considera il contenuto del DNA, è chiaro che posso

facilmente studiare il ciclo cellulare ottenendo per quella popolazione cellulare un cambiamento con

l’aggiunta di un fattore mitogeno. Il contenuto di DNA a questo punto prevede un abbassamento in fase

G1, e deve aumentare la quantità di cellule in fase S, e se aumenta la velocità di progressione nel ciclo

aumenta anche il quantitativo in M e cosi via.

Citofluorimento con sistema elettronico con lenti, filtri, specchi, è in grado di raccogliere questi segnali

ottici convogliarli al fotomoltitplicatore che poi li amplificherà e convertirà in intensità di corrente ecc, al

fotomoltiplicatore arrivano dei segnali anche indesiderati; è necessario fare la COMPENSAZIONE, cioè

effettuare una sorta di correzioni, quando è necessario. Correzione derivata da sovrapposizioni di segnali.

ESPERIMENTO DI Procedendo con una marcatura per un breve periodo di tempo, cioè somministrando ad

una coltura asincrona di cellule un precursore assunto solo nella fase S, come è possibile misurare la durata

delle varie fasi del ciclo?

Una via di segnalazione attivata dai fattori di crescita è la via di segnalazione della fosfatil inositolo 3-chinasi

(PI3K), è una chinasi che ha come substrato il fosfatil inositolo. Una chinasi che aggiunge gruppi fosfati al

fosfatil inositolo, un glicero fosfolipide che ha il glicerolo nella testa polare.

L’arrivo di un fattore di crescita, come l’ormone insulina che tra gli stimoli che suscita c’è anche la

stimolazione della crescita e delle vie biosintetiche. L’arrivo di uno stimolo extracellulare porta alla

formazione di un complesso tra fattore e recettore. Dopo che la formazione del complesso, l’enzima viene

attivato e aggiunge alla testa polare dei lipidi di membrana un gruppo fosfato in posizione tre.

Il fosfatidil inositolo ha gia due fosfati in posizione 4 e 5 PI(4,5)P2, l’enzima ne aggiunge uno al 3,

PI(3,4,5)P3

Questo attiva nella cascata di segnali un’altra chinasi, TOR (target of rapamycin) chiamata cosi perche viene

bloccata da una tossina batterica usata con scopo antitumorale.

TOR stimola processi anabolici che hanno a che fare con la sintesi proteica, infatti questo attiva 4E-BP (per

la regolazione della sintesi proteica, si legano e competono ma solo quando non sono fosforilate) e S6K,

una chinasi della proteina S6, la sub unità numero 6 ribosomiale aumentano la capacità ribosomiale.

Si deve agli esperimenti condotti nel 1953 da A. Howard e S.R. Pelc la dimostrazione che il ciclo cellulare è

suddiviso in fasi distinte e che la duplicazione del DNA è limitata ad una sottofase dell’interfase, la fase S.

Utilizzarono come modello delle cellule prelevate da l’apice radicale di una pianta(Vicia Faba), che è

costituito da cellule meristematiche, cioè indifferenziate e continuamente in ciclo, capaci di dividersi e che

producono cellule che vanno a differenziarsi, prevedono una divisione asimmetrica che prevede un

mantenimento di un pool indifferenziato. Le coltivarono somministrando del fosfato radiattivo, quindi

voleva capire in questo modo se il ciclo avesse fasi distinte e capirono che l’interfase non è uguale. Adesso

si usa la timidina terziata. Lo somministrarono per un breve periodo di tempo (“pulse”) di circa un’ora, poi

le cellule vengono lavate e osservate tramite un autoradiografia e notarono che solo una limitata

percentuale di nuclei è radioattiva. Quindi il fosfato radioattivo veniva incorporato in una sola fase della

vita di una cellula a cui dettero il nome di fase S. in qull’ora di tempo era stato incorporato solo dalle cellule

che erano in fase S.Nessuna delle cellule mitotiche ha incorporato il radioattivo, perché non ha iniziato il

processo di replicazione durante il periodo di marcatura. Analizzando cellule in un periodo da una a poche

ore ( 6-10 ore nell’esperimento di Howard e Pelc) dopo il pulse ci sono ancora cellule con DNA non

marcato. Esiste dunque un periodo di intervallo (Gap G2) fra la fase S e la fase M. Per determinarne la

durata, si monitorano campioni raccogliendoli finché si trovano cellule con cromosomi marcati. Queste

sono le cellule che al momento della marcatura erano alla fine della fase S. La durata della fase S può essere

determinata direttamente in una coltura asincrona conoscendo la durata dell’intero ciclo cellulare (Tc) e

determinando la percentuale dei nuclei marcati durante una breve somministrazione, un pulse, di timidina

radioattiva. In modo analogo si può determinare la durata della fase M, considerando le cellule che si

trovano in mitosi o in citocinesi. IMM indice di mitosi marcate: la percentuale di cellule in mitosi marcate

rispetto alla percentuale totale di cellule in mitosi. Addizionando G2+S+M risulta evidente che bisogna

tenere conto di una ulteriore fase di intervallo fra la fase M e la fase S, Gap G1.

CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO

Si misurano e si caratterizzano delle cellule che sono sospese in un mezzo liquido. Per poter studiare tutte

le caratteristiche delle cellule dobbiamo aver a che fare con sospensioni cellulari. Si puo osservare le

dimensioni, il citoplasma, le granulazioni… ma anche grazie all’utilizzo di marcatori fluorescenti o anticorpi,

è possibile studiare le proprietà biochimiche.

Nel citofluorimetro la cellula passa dalla camera di flusso dove viene passata dal laser, quindi si possono

studiare molte cellule tutte insieme. È possibile condurre un ANALISI MULTIPARAMETRICA, cioè sulla stessa

cellula si possono ottenere più informazioni relative a parametri diversi. IL PRINCIPIO SU CUI SI FONDA

L’ANALISI CFM È QUELLO DELLA FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA. Le cellule sono trasportate in una

camera di flusso dove incontrano la radiazione circondate da una serie di cilindri fluidici concentrici, il più

interno dei quali è costituito dalle cellule allineate. Le cellule passano una di fila all’altra, grazie ad una

soluzione salina isotonica che viene messa nei capillare dello strumento che circonda e allinea la

sospensione cellulare. Il campione analizzato viene scartato, alcune macchine permettono il recupero delle

cellule secondo certe caratteristiche dopo la separazione (sorting).

C’è un sistema ottico che è formato da una sorgente di eccitazione e da un circuito di rivelazione, il sistema

fluidico serve per il trasporto del campione e il sistema elettrico serve per l’acquisizione, l’eleborazione e la

rappresentazione dei dati.

Il SISTEMA OTTICO

L’ottica di eccitazione consiste in è una serie di lenti di focalizzazione e uno o piu laser come sorgente

luminosa. Il laser è in grado di emettere luce monocromatica e unidirezionale di notevole intensità in

determinate regioni spettrali del visibile e dell’ultravioletto, spesso è un laser a ioni argon.

Quando la luce colpisce la cellula nel punto di interrogazione ci sono due venti possibili:

LIGHT SCATTERING e FLUORESCENZA.

LIGHT SCATTERING

I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche fisiche delle popolazioni cellulari sono

correlabili: alle dimensioni delle cellule. Se si osserva una cellula in controluce, si misura un segnale legato

alla diffrazione che è in relazione al diametro cellulare (Forward Scatter o scatter lineare = FSC), rilevato

lungo l’asse della luce incidente. alla granulosità cellulare, al rapporto N/C e alla irregolarità della superficie

cellulare. Se ci si pone ortogonalmente al fascio, si misura un segnale legato sostanzialmente alla riflessione

e alla rifrazione (Side Scatter o scatter a 90° = SSC).

La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma di dispersione a

punti denominato CITOGRAMMA nel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni

cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche. Ogni cellula è identificata da un preciso valore di FSC e SSC.

Ogni punto rappresenta una cellula, conoscendo le dimensioni e l’architettura cellulare possiamo separare

diverse popolazioni cellulari.

FLUORESCENZA

È il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa di definita lunghezza d’onda ne

emette un’altra a lunghezza d’onda maggiore e ad energia inferiore. Molte molecole biologiche posizionate

sulla membrana plasmatica, nel nucleo o nel citosol, possono venire identificate con ligandi fluorescenti o

con specifici anticorpi monoclonali marcati con fluoro cromi che riconoscono un antigene all’interno della

cellula. Altre sostanze (DNA, RNA, proteine, ioni citoplasmatici) possono essere colorate direttamente con

fluorocromi che si legano ad esse stechiometricamente.

L’anticorpo legato ad una fluoresceina, attraversato dal laser, emette una radiazione di lunghezza d’onda

maggiore. Il nostro strumento misura la radiazione che viene riemessa e darà informazioni riguardo la sua

proprietà biochimica.

FLUOROCROMI

Ognuno è caratterizzato da uno spettro di eccitazione ed emissione. Usando anticorpi diversi che si legano

ad antigeni diversi all’interno della cellula, è possibile fare delle analisi multiparametriche di una stessa

cellula e fare analisi su parametri diversi.

Esiste anche una marcatura di tipo indiretta, quindi dopo l’incubazione e il lavaggio per eliminare

l’anticorpo in accesso c’è bisogno di una seconda incubazione con un anticorpo secondario legato al fluoro

cromo che rende l’antigene fluorescente.

SISTEMA DI RILEVAZIONE E’ costituito da sensori denominati fotomoltiplicatori (PMT) o detectors che

trasformano i segnali ottici in intensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in

maniera lineare o logaritmica. I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici ossia proporzionali in

maniera continua alle dimensioni del parametro analizzato. Un convertitore spezzetta i valori continui

rendendoli discreti.

I segnali provenienti da ogni sensore sono digitalizzati, associati fra loro ed inviati ad un elaboratore che

provvede alla presentazione dei dati ed alla loro definizione statistica. La statistica si basa sull’impostazione

di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli eventi che cadono al loro interno.

Ogni singolo valore riferito ad un parametro che viene misurato, viene chiamato evento, i vari eventi si

accumulano in una serie di canali che mi permettono di misurare quel parametro. DIAGRAMMA di

distribuzione di presenze, un istogramma che rappresenta la misura di un singolo parametro.

La rappresentazione più semplice di un dato citometrico è la creazione di un istogramma, in cui gli eventi

accumulati nei diversi canali forniscono un diagramma di distribuzione delle frequenze. Il diagramma ad

istogrammi rappresenta graficamente la misura di un singolo parametro.

Gli eventi nell’ordinata in funzione del parametro che voglio misurare.

Un’altra rappresentazione è quella detta bidimensionale a parametri correlati, il cui diagramma è definito

dot-plot.

Il diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta la correlazione fra due parametri, in cui ogni

punto rappresenta un singolo evento dotato di un particolare valore per ciascuno dei due parametri.

All’interno dei dot plot si possono definire quadranti e finestre di diverse dimensioni.

La rappresentazione è bidimensionale e si possono definire dei quadranti, delle finestre e poter individuare

anche 4 distinte sottopopolazioni.

La citoforimetria è molto importante ci permette di analizzare molti eventi in poco tempo e i dati vengono

conservate quindi posso analizzare più volte la stessa popolazione di cellule.

Ci sono fluoro cromi che si legano in modo stechiometrico al DNA, la fluorescenza emessa sarà

proporzionale al contenuto di DNA. Si chiamano FLUOROCROMI INTERCALANTI, sono praticamente non

fluorescenti quando liberi nel solvente ma aumentano notevolmente la loro efficienza quantica quando

legati al DNA.

Ioduro di propidio (PI) ha una larga banda di assorbimento nel visibile con massimo nel verde, ma anche nel

blu ed un’altra in UV. L’emissione avviene nel rosso con un massimo a 620 nm.

Si può quindi usare in multiparametrica con altri fluorocromi (FITC e PE) anche se vi è sovrapposizione

parziale con l’emissione di PE.

Ai può vedere la quantità di DNA che si trova dentro una popolazione di cellule. Possiamo stimare la

percentuale di cellule che sono in G1/G0, in G2, in M o in S. i fluoro cromi legandosi in modo stechiometrico

emettono una fluorescenza direttamente proporzionale alla quantità di DNA, quindi il contenuto di DNA

nelle varie fasi può cambiare, infatti Le cellule che hanno un DNA non replicato sono in fase G1/G0 Le

cellule che hanno replicato il proprio DNA hanno un contenuto doppio di DNA rispetto alle cellule che si

trovano in G1/G0 Le cellule che hanno un contenuto intermedio di DNA sono in fase S.

La misura del contenuto di DNA fornisce anche informazioni di tipo citogenetico (il grado di ploidia per

singola cellula) oltre che sullo stato proliferante del clone in esame determinando con esattezza la

distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo.

DNA index (DI) è il rapporto fra il contenuto in DNA delle cellule neoplastiche in fase G0/G1 e quello delle

cellule diploidi normali nella stessa fase del ciclo cellulare. Il DNA index è uguale a 1 nel caso di una

popolazione neoplastica diploide e diverso da 1 in caso di aneuploidia. DNA-index DI esprime il rapporto tra

il canale modale del picco G0/G1 del campione in esame ed il canale modale dello stesso picco dello

standard diploide. La sua valutazione rivela la presenza di anomalie del contenuto di DNA

Determinare la durata delle fasi del ciclo cellulare. L’analisi del contenuto del DNA ci permette in maniera

rapida, efficace di capire la durata del ciclo cellulare. Non ci permette di dire niente pero sulla cinetica del

ciclo cellulare.

TECNICHE PER LA CINETICA CELLULARE con precursori radioattivi di DNA.

Somministrarono un fosfato inorganico per un intervallo di un’ora quindi soltanto le cellule che erano in

fase S in quel momento incorporavano il fosfato radioattivo nel filamento di nuova sintesi. Dopo aver

aspettavo e lavato il fosfato non incorporato ad intervalli di tempo prendono una frazione di queste cellule

e ne osservano le mitosi marcate sul totale (IMM). Videro che devono aspettare un certo intervallo di

tempo prima di trovare una mitosi marcata, questo perché prima di entrare in M, le cellule dovevano

terminare S e superare il GAP.

La prima mitosi marcata appare dopo circa 6 ore che era stato somministrato il fosfato marcato. Nella fase

S che la cellula duplica il suo DNA, questa è separata dalla mitosi da un intervallo di tempo a cui fu dato il

nome di fase G2 (GAP), tra la fase M ed S era interposto un intervallo che fu chiamato fase G1.

PARAMETRI CLASSICI DELLLA CINETICA CELLULARE.

Consideriamo una popolazione teorica in cui tutte le cellule sono uguali e si dividono, percorrono il ciclo

cellulare senza variabilità. Il TEMPO DI CICLO CELLULARE è la somma della durata Tc delle fasi del ciclo

cellulare. Tc è perciò TG1+TS+TG2+TM

IL TEMPO DI DUPLICAZIONE (TD) corrisponde al tempo di ciclo cellulare (Tc) nel caso in cui si consideri una

popolazione teorica.

Passando ad una situazione non teorica in cui alcune passano in G0, alcune iniziano a differenziarsi e non

duplicano, alcune vengono distrutte ecc… questo tempo di duplicazione si allunga.

Metodi per valutare la durata del ciclo cellulare:

si impiegano precursori marcati del DNA che sono incorporati nel DNA di nuova sintesi durante la fase S.

il dna viene marcato radioattivamente solo in quelle cellule che sono in fase S.

si descrivono tre metodi diversi che si distinguono per il tempo con il quale il precursore marcato viene

lasciato a contatto con le cellule e anche in base al tipo di tracciante:

1. MARCATURA A IMPULSO, un tempo breve, un impulso di precursori radioattivi

La popolazione cellulare è messa in contatto con la H-Timidina (marcata con il trizio) per un tempo

limitato e fissata. I campioni della popolazione cellulare sono analizzati con l’auto-radiografia.

L’autoradiografia sfrutta il normale processo fotografico, il mezzo rivelatore è un’emulsione fotografica

costituita da una matrice di gelatina in cui sono dispesi cristalli di bromuro di argento. Esistono

emulsioni sotto forma di gel ed emulsioni solide montate su lastre di vetro. Le radiazioni beta della

Timidina triziata riducono gli alogenuri ad argento metallico. Il parametro che analizza è la percentuale

di cellule in mitosi che risulta marcata rispetto alle mitosi totali, INDICE DI MITOSI MARCATE (IMM).

Si ipotizza che il Tc e la durata delle fasi del ciclo siano costanti e che le cellule siano asincrone e

distribuite in modo uniforme nel ciclo cellulare, cioè in numero proporzionato alla durata di ciascuna

fase.

Si dice che le cellule sono asincrone, cioè che non sono tutte nella stessa fase nel ciclo ma sono

distribuite nelle varie fasi del ciclo in modo uniforme. Le prime cellule che entrano in mitosi con il DNA

marcato sono quelle che quando è aggiunta la Timidina erano alla fine della fase S.

Quelle che erano in G1 non avranno il DNA marcato, quando arrivano in fase M anche se saranno in

mitosi non avranno il DNA marcato.

Durate il PULSE, solo la frazione in fase S incorpora il radioattivo. Durante i primi punti di osservazione

si vedono solo mitosi non marcate. Dopo un tempo uguale a G2 in M compaiono le prime mitosi

marcate in proporzione minima rispetto alle mitosi non marcate.

La proporzione di mitosi marcate iniziate ad aumentare mano a mano che arrivano in fase M quelle

cellule che avevano incorporato il nucleoside marcato in fase S. finche arrivano in fase M solo cellule

marcate le mitosi sono marcate, successivamente cominciano ad entrare in fase M le cellule che al

momento della marcatura erano in fase G1 quindi non avremo mitosi marcate.

Quando tutte le cellule marcate in fase S escono dalla mitosi, io continuo a vedere che entrano cellule

non marcate in fase M. quando le figlie delle cellule marcate ripercorrono il ciclo cellule, rivedo

comparire le mitosi marcate, quindi avremo una seconda generazione di mitosi marcate.

Il tempo che percorre tra l’inserimento del marcatore e la visualizzazione di mitosi marcate, indica il

tempo della G2. Quando l’indice di mitosi marcate inizia a diminuire, vuol dire che tutte le cellule

marcate hanno finito la fase M e si torna a zero. Il grafico si ripete quando inizia la seconda generazione

di cellule marcate.

Dal grafico risulta un trapezio isoscele. La fase ascendente della curva è in relazione alla comparsa della

prima mitosi marcata. L’inizio del plateau 100% di mitosi marcate avviene quando la prima mitosi

marcata passa alla fase G1 del successivo ciclo cellulare in quanto si è ipotizzato che le cellule fossero

distribuite in modo uniforme nel ciclo

l’inizio del tratto discendente avviene quando l’ultima cellula marcata entra in mitosi

l’azzeramento dell’IMM si verifica quando l’ultima cellula marcata termina la mitosi

Il secondo trapezio (seconda generazione di mitosi marcate) si presenta dopo un tempo pari alla durata

di G1 più G2

Se consideriamo una popolazione reale, non abbiamo un preciso trapezio isoscele, perché ci sono

tantissime varianti e le cellule non affrontano il ciclo tutte nello stesso modo. Sperimentalmente io

trovo una curva dove la fase s salita è una curva che dipende dalla variabilità della fase G2 e poiché le

cellule procedono in modo non uniforme, non raggiungo il cento per cento inoltre la fase S dura in

modo diverso per le varie cellule e la fase discendente non è uguale all’ascendente e il ciclo cellulare

varia, il secondo picco è diverso dal primo picco e tutti gli altri successivi saranno sempre diversi, inoltre

non si torna mai a zero poiché alcune mitosi marcate.

Nel caso limite di una popolazione sincrona la curva passa istantaneamente da 0 a 100% poiché tutte le

cellule della popolazione entrano in mitosi allo stesso tempo. La determinazione di TC si ottiene senza

ricorrere al precursore marcato: essendo le cellule sincrone, sarà sufficiente osservare l’ingresso delle

cellule in mitosi. Il plateau AB è il TM e il tempo tra due punti simmetrici (LM) è il TC.

Le curve sperimentali differiscono da quella teorica, non si ottiene un trapezio isoscele ma una curva.

La durata delle fasi, la frazione di cellule presenti nell’unità di tempo lungo il ciclo e la durata di TC sono

variabili.

2. MARCATURA CONTINUA

La popolazione cellulare viene marcata per un tempo indefinito con il nucleoside 3H-timidina. Metodo

più adatto per cellule in coltura che per tessuti di un animale. Nella marcatura continua occorre fare un

numero minore di prelievi ma ci sono più parametri da osservare: IMM, indice di marcatura e

conteggio dei grani.

La curva è simile a quella a PULSE ma non riscende. Se considero la frazione di cellule marcate, quelle in

fase S o indice di marcatura, il valore iniziale dell’indice corrisponde alla frazione di cellule che erano in

fase S all’inizio della marcatura continua. Poi la curva aumenta linearmente, il 100% è raggiunto quando

tutte le cellule sono marcate e cioè dopo un tempo pari a TG1+ TM+ tg2

L’ultimo parametro da misurare lo misuro contando i grandi d’argento, questo numero aumenterà nel

tempo, aumenta quando il tempo di contatto tra precursore e cellula è uguale a TS. Con questo metodo si

determinano separatamente i tre parametri:

TG2 + ½ TM indice IMM

TG2 + TG1 + TM indice di marcatura

TS numero grani Ag

3. DOPPIA MARCATURA

Il metodo consiste nel dare un primo “pulse” di 3H-Timidina seguito da un secondo di 14CTimidina dopo un

tempo prefissato Ta. Il valore di questo intervallo è arbitrario, purché minore di TS, in genere è un’ora.

Si valuta la durata della fase S.

La marcatura dei due traccianti è facilmente distinguibile per le dimensioni dei grani di Ag più grandi nel

caso di 14C-timidina, dovuti alla maggiore energia delle particelle beta emesse da questo radionuclide.

La valutazione della radioattività può essere fatta mediante conteggio in scintillatore liquido dopo

trattamento con adatte molecole dissolventi.

Si distinguono in teoria 3 tipi di cellule marcate:

Quelle che al momento del secondo pulse hanno già completato la S sono marcate solo con 3H.

Le cellule che al tempo del secondo pulse sono ancora in S assumono anche 14C-Timidina e quindi sono

doppiamente marcate.

Le cellule marcate solo con 14C sono quelle che hanno iniziato la S dopo il pulse di 3H.

Se la popolazione cellulare è distribuita in modo uniforme nelle fasi del ciclo e si conosce Ta

si calcola

TS = Ta x C 14C totali/C 3H

Bisogna considerare un parametro che è la FRAZIONE DI CRESCIA poiche non ho mai popolazioni ideali di

cellule. Con l’introduzione di questo fattore il tempo impiegato dalla popolazione per raddoppiare è piu

lungo di TC e prende il nome di tempo di raddoppiamento potenziale, TP.

Nelle popolazioni cellulari reali vi sono poi fenomeni di morte e differenziazione che ne condizionano la

crescita e nel loro complesso sono indicati come FATTORE DI PERDITA CELLULARE O CELL LOSS (CL).


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Petrina08 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia cellulare con laboratorio e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Donati Chiara.

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