Appunti di Biologia dello sviluppo animale

Biologia dello sviluppo animale

La biologia dello sviluppo

Perché è importante studiare la biologia dello sviluppo? Dato che è figlia della vecchia embriologia, perché ci può far capire come è costruito un embrione. Perché, basandosi sullo studio dei modelli animali, essa può far luce su molte patologie umane. Es. Il piebaldismo è una malattia comune all’uomo e al topo e si manifesta con sterilità, anemia e regioni non pigmentate. È una branca in cui convengono tutte le tecnologie della ricerca.

Le radici della biologia dello sviluppo risalgono ad Aristotele, che era un sostenitore della teoria epigenetica, secondo cui da un uovo senza forma emerge gradualmente una forma. In seguito prese il sopravvento la teoria preformista, secondo cui l’uomo era già presente all’interno dello spermatozoo. Infine si arrivò all’embriologia moderna, con Haeckel e la sua famosa massima: “l’ontogenesi ricapitola la filogenesi”.

Ad ogni modo, facciamo una premessa. Esistono due tipi di sviluppo:

• Diretto: tipico di mammiferi e uccelli; dall’uovo esce un cucciolo che deve solo accrescersi.
• Indiretto: c’è uno stadio larvale, anche molto diverso dall’adulto.

L’unico modo per andare dal genotipo al fenotipo è lo sviluppo embrionale, cioè l’insieme dei processi che permettono la formazione dell’individuo, e tutto nasce con un’interazione specie specifica tra gameti.

Eventi cellulari dello sviluppo

• Divisione cellulare
• Differenziamento cellulare
  • Indirizzamento posizionale
  • Specificazione e determinazione
  • Trasformazione fenotipica della cellula
  • Crescita e maturazione delle cellule
  • Apoptosi
• Interazioni cellula-cellula
• Movimenti cellulari

La DETERMINAZIONE è un commitment (= indirizzamento differenziativo) non fenotipicamente visibile. Tutte le cellule sono uguali fuori, ma diverse a livello molecolare.

Ci sono due momenti molto diversi nell’indirizzamento differenziativo:

• Specificazione: è un commitment debole a cui si può cambiare il destino differenziativo. Un pezzo di embrione specificato messo in ambiente neutro si differenzia in maniera autonoma, ma se gli viene dato un segnale specifico può cambiare tipologia di derivato. Es. Un arto presuntivo specificato può diventare pelle.
• Determinazione: è un commitment forte, non si può cambiare il destino differenziativo. Un pezzo di embrione messo in una regione, anche diversa dalla propria di origine, di un embrione accettore si differenzia autonomamente. Es. Un arto presuntivo determinato diventa arto ovunque venga messo.

Dal punto di vista del DNA tutte le cellule differenziate sono identiche, solo che alcuni geni sono silenziati, ma conservano il loro potenziale. Solo una piccola parte del DNA viene espresso in una cellula differenziata. Così si può vedere lo sviluppo come un progressivo silenziamento dei geni. Questa è l’espressione genica differenziale. Inoltre, se troviamo un gene in un organismo è facile che ce ne sia una versione simile in ogni altro organismo, proprio grazie all’espressione genica differenziale.

Lo zigote è l’unica cellula TOTIPOTENTE, cioè in grado di formare un organismo completamente nuovo (e gli annessi embrionali). Questa è una potenzialità che si perde durante lo sviluppo.

Punti fondamentali dello sviluppo embrionale

• Fertilizzazione
• Cleavage o segmentazione
• Gastrulazione
• Organogenesi

Ci possono essere delle variazioni sul tema, ma stringi stringi e queste fasi sono sempre le stesse.

Nello sviluppo una delle cose più importanti è la definizione dei tre assi embrionali:

• Antero/posteriore
• Destro/sinistro
• Dorso/ventrale

A volte nell’uovo si possono già distinguere le molecole informazionali che programmando la formazione di questi tre assi.

I modelli animali più usati, nella biologia dello sviluppo come in tutta la restante biologia, sono:

• C. elegans
• D. melanogaster
• D. rerio
• G. gallus
• M. musculus
• X. Laevis

I metodi della biologia dello sviluppo

I metodi principali di manipolazione dell’embrione sono:

• Marcature
• Trapianti
• Espianti
• Malformazioni genetiche indotte o screening di mutagenesi
• Ibridazioni in situ
• Knock-out

Le marcature

Le marcature consentono di seguire il destino di un gruppo di cellule e di farne una genealogia o fate map: coloro un gruppo di cellule, vedo dove vanno e ne faccio una mappa. In questo modo posso valutare non solo il destino differenziativo, ma anche quali cellule vanno in apoptosi. Inizialmente si usavano dei coloranti vitali, ora invece si usano dei coloranti fluorescenti vitali microiniettati nelle cellule, di modo da poter intervenire senza fare danni sull’embrione. Però si può marcare anche trapiantando in un individuo cellule pigmentate da un’altra specie, come ad esempio accade spesso per pollo e quaglia, o ancora usando dei precursori radioattivi.

Trapianti

Oltre ad essere utili per le marcature, i trapianti danno notizie anche sulla funzionalità di determinati gruppi di cellule: se le cellule sono determinate, anche dopo essere state trapiantate possono indurre determinati fenomeni.

Espianti

Si coltivano i tessuti in vitro con opportuni fattori di crescita e da cellule non differenziate se ne possono ottenere di differenziate.

Mutagenesi

Gli esperimenti di mutagenesi permettono di risalire ai geni che causano determinate mutazioni e al loro ruolo nello sviluppo.

Ibridazione

Si possono fare ibridazioni non in situ con tecniche di blotting (Northern, Southern…) oppure delle ibridazioni in situ, che permettono di vedere dove è espresso fisicamente il gene. Ci vogliono dei frammenti di RNA antisenso (che poi si appaieranno con i complementari) come sonda con un tag di riconoscimento. Spesso come tag viene usata la digossigenina più un anticorpo che la riconosce legato ad una fosfatasi alcalina; in seguito si ha una reazione con la formazione di un precipitato colorato visualizzabile. Questi protocolli vengono applicati su sezioni di embrioni o su embrioni interi dopo aver permeabilizzato la membrana con opportuni detergenti e proteasi.

Manipolazione di embrioni e knock-out

Allo stadio di blastula si può prendere l’embrione, smontarlo e rimontarlo senza conseguenze di sorta, come per esempio avviene per i topi allogenici. In questo modo è stato possibile mettere a punto la tecnica del knock-out. Infatti, la blastocisti è composta da una parte più esterna e da una inner cell mass, cioè la massa delle cellule che effettivamente daranno l’embrione. Ora, io posso mettere in coltura le cellule della inner cell mass, selezionarne alcune, manipolarle e poi rimetterle insieme. Si possono anche fare clonazioni da nuclei di blastociti ad oociti senza nucleo. In questo modo si può ottenere il knock-out di singoli geni, che è l’unico modo di manipolare geneticamente i mammiferi.

I tipi di specificazione

Determinanti citoplasmatici = molecole che agiscono nel citoplasma e sono morfogeni. Lo sviluppo di molti embrioni dipende dall’azione dei determinanti citoplasmatici. Altre volte le cellule risentono dell’attività di cellule adiacenti e quindi della posizione in cui si trovano. Ovviamente questo spesso include molecole messaggere, che permettano il dialogo anche quando le cellule in gioco sono molte.

In tutti i tipi di sviluppo embrionale si assiste alla specificazione, che può essere di tre tipi:

• Specificazione autonoma: Il destino delle cellule è determinato prima della fecondazione grazie a determinanti morfogenetici (per lo più RNA) presenti nell’uovo. Per questo si parla di sviluppo a mosaico.
• Specificazione condizionale: Il destino di una cellula è determinato dalle cellule che le stanno attorno, i condizionanti morfogenetici vengono prodotti dalle cellule e si assiste a fenomeni di signalling. Per questo si parla di sviluppo regolativo.
• Specificazione sinciziale: per gli insetti la blastula è un sincizio, conseguentemente il morfogeno forma un gradiente nel citoplasma sinciziale. Solitamente i morfogeni sono fattori di trascrizione, così possono entrare nei nuclei ed attivare geni diversi a seconda della concentrazione a livello di quel nucleo. Questo grazie alla diversa affinità per il morfogeno che hanno promotori diversi e che quindi permette una loro accensione differenziale.

I gameti

Spermatogenesi

Nella spermatogenesi ci sono due fasi:

• Fase mitotica, in cui avviene il popolamento di spermatogoni tramite divisioni mitotiche.
• Fase meiotica, in cui avvengono le divisioni meiotiche:
  • 1° divisione: porta a spermatociti di tipo I
  • 2° divisione: porta a spermatociti di tipo II

A questo punto da rotondeggianti le cellule cominciano a mostrare l’abbozzo di una polarità, il nucleo si compatta e il citoplasma spermatogonico viene espulso. Questa tensione all’aerodinamicità è molto importante, perché gli spermatozoi devono essere aerodinamici.

In molti animali è presente un testicolo a tubuli seminiferi, dove avviene la maturazione dei gameti. Poi gli spermatozoi maturi confluiscono nell’epididimo e al momento dell’eiaculazione confluiscono all’esterno.

Cellule di Sertoli = cellule somatiche di supporto alla maturazione degli spermatozoi. Nella parte finale della spermiogenesi ci sono dei cambiamenti importanti:

• Cambia il nucleo per:
  • Forma del nucleo
  • Impacchettamento del DNA
• Cambia il numero e la disposizione degli organelli
• C’è la maturazione dell’acrosoma
• Si forma l’assonema
• C’è una riduzione del citoplasma
• Si assiste a una specializzazione della membrana citoplasmatica per l’interazione di tipo chiave-serratura con la cellula uovo.

Controllo ormonale della spermatogenesi

Nei mammiferi all’inizio della pubertà l’ipotalamo rilascia GnRH, che stimola l’ipofisi a rilasciare:

• LH: stimola le cellule di Leydig a produrre androgeni (→ testosterone), che stimolano la spermiogenesi e hanno anche un feedback negativo su ipofisi ed ipotalamo.
• FSH: stimola le cellule di Sertoli, che hanno un contatto diretto con le cellule germinali e rilasciano verso di esse:
  • ABP (Androgen Binding Protein)
  • Transferrina
  • Inibina (che rientra in circolo e induce il feedback negativo)

Vescicola acrosomiale

La vescicola acrosomiale è dotata di una membrana interna, che per altro la separa dal citoplasma, e di una esterna. Contiene un enzima tripsin-like detto acrosina, che viene attivato solo al momento della reazione acrosomiale con meccanismo Ca²⁺ dipendente. Infatti, dopo il riconoscimento tra spermatozoo e cellula uovo c’è la reazione acrosomiale, che apre un buco nella membrana esterna dell’oocita e permette allo spermatozoo di arrivare alla membrana cellulare.

Già negli spermatidi si registra un’intensa attività del Golgi, che permette la formazione di vescicole che formeranno l’abbozzo dell’acrosoma. Durante la maturazione della cellula, poi, il nucleo viene ingabbiato da una struttura microtubulare detta manchette (= manicotto), mentre la cromatina cambia struttura e comincia la compattazione. Infatti “si smontano” i nucleosomi, il DNA si srotola e gli istoni non lo legano più. Il loro posto verrà preso dalle protammine, delle proteine basiche molto corte con lunghe catene di arginina (circa il 50-70% della proteina). Queste si inseriscono nel solco minore del DNA e formano tra di loro dei legami a ponte S-S, consentendo una maggiore compattazione del DNA e quindi un maggiore idrodinamismo della cellula.

Assonema

È formato da 9 coppie di microtubuli più una coppia centrale. I microtubuli sono formati da 13 protofilamenti di tubulina (anche se solo un microtubulo nella coppia è completo), uniti tra loro da una proteina detta nexina. In questa struttura è presente la dineina, una proteina molto importante, in quanto sfruttando l’energia dell’ATP riesce a causare il movimento dell’assonema. Questo è il motivo per cui allo spermatozoo sono necessari tanti mitocondri. Gli spermatozoi hanno una vita limitata dalla produzione dell’ATP: fin quando ne viene prodotta vivono, quando non sono più in grado di produrne diventano immobili e muoiono.

Oogenesi

Anche nell’oogenesi ci sono due fasi di divisione:

• Fase mitotica: aumenta il numero di cellule progenitrici (= oogoni) e avviene solo nei primi stadi di crescita.
• Fase meiotica: si differenziano gli oociti.
  • Meiosi I: si ha un oocita primario con l’espulsione del I globulo polare.
  • Meiosi II: si ha un oocita secondario con l’espulsione degli altri globuli polari.

Solo gli cnidari completano le due fasi della meiosi prima della nascita dell’individuo, mentre tutti gli altri animali rimangono come ibernati in uno stadio della meiosi II fino all’ovulazione. Questo stadio per i mammiferi è la metafase II, per tutti gli altri la profase II.

La cellula uovo

Essendo un gamete, la cellula uovo è ovviamente aploide; essa permette l’ingresso di un solo spermatozoo e fornisce al nuovo organismo tutti i nutrimenti e i mezzi di cui ha bisogno fino all’autonomia, in forma di vitello, corpi balbiani ed RNA materni. Ha un nucleo molto grosso detto vescicola germinale e già nell’uovo si possono individuare i tre assi, il polo animale e il polo vegetativo, che costituisce il 95% del citoplasma. Nel citoplasma sono presenti i granuli corticali, importanti per la reazione corticale, cioè il blocco lento della polispermia. L’uovo è ricoperto dalla membrana vitellina, cioè l’involucro primario, fatto da glicoproteine e proteine; nell’uomo si chiama zona pellucida.

Formazione dell’oocita

Ogni cellula germinale capostipite, cioè ogni oogone, ha a disposizione un numero definito di mitosi che porta a un certo numero definito di oociti, che non cambia per tutta la vita dell’organismo. Attraverso divisioni mitotiche asimmetriche si creano una cellula staminale, che rimane in parete, e l’oocita primario diploide.

L’oocita primario, una volta formato, non entra subito in meiosi II, ma prima procede a diversi stadi di crescita e maturazione:

• Crescita primaria: Durante la crescita primaria appaiono i cosiddetti nucleoli (diversi dal nucleolo del nucleo), sede dell’rRNA materno, perché nel primo stadio dello sviluppo embrionale lo zigote non trascrive e quindi ha bisogno di usare gli RNA materni. Questo processo si chiama amplificazione dei geni ribosomiali, cioè dei geni che contribuiscono a tenere in vita lo zigote permettendo la sintesi di proteine. Durante questa fase si assiste anche alla formazione dei corpi balbiani e alla sintesi dei precursori dell’involucro dell’oocita. I corpi balbiani sono componenti citoplasmatici di materiale elettrondenso, RNA e mitocondri. Poco prima della fecondazione, quando l’oocita è maturo, vanno in tutto l’uovo in forma di masserelle e contengono i determinanti citoplasmatici.
• Crescita secondaria: Durante questa fase si ha l’accumulo del vitello e la formazione dei granuli corticali, strutture delimitate da membrana omologhe alla vescicola acrosomiale dello spermatozoo, contenenti enzimi proteolitici; dopo l’entrata del primo spermatozoo vengono rilasciati ed impediscono la polispermia.
• Maturazione: In questa fase c’è la ripresa della meiosi con espulsione del primo globulo polare, cui segue l’idratazione della cellula uovo. A questo punto inizia la meiosi II che si blocca nella fase tipica della classe.

Il precursore del vitello è la vitellogenina, che nella maggior parte dei casi è eterosintetica, cioè viene sintetizzata da cellule diverse dalla cellula uovo, come il fegato per i pesci e gli anfibi o il follicolo di Graaf per i mammiferi. La vitellogenina viene poi tagliata proteoliticamente in due proteine: ipovitellina e fosvitina, che vengono montate a formare il vitello.

Nei mammiferi l’oocita si trova dentro il follicolo di Graaf e sia l’oocita sia il follicolo formano microvilli che permettono lo scambio di nutrienti. In Drosofila, invece, gli oociti si trovano all'interno di un sistema diverso.