Biologia dello sviluppo animale 1

ESPERIMENTO

In sequenza 3 embrioni

1. Mutante omozigote

2. Wild type

3. Mutante eterozigote: doppio mutante Knock out incompatibile con

4. la vita perchè non presenta un sistema circolatorio

Nel sistema circolatorio è importante la formazione morfologica di strutture corrette con conformazione specifica

È importante anche formare un numero sufficiente di vasi.

TF che stimolano la

Fattore di crescita VEGF (fattore di crescita vascolare endoteliale) più è presente più cellule endoteliali si formano. Se

viene ridotto o eliminato il VEGF non si formano i vasi

Tutta la formazione dei vasi sanguigni di formano durante la crescita. Nello stadio adulto si ferma ad eccezione delle

zone tumorali. Viene scoperto il fattore di crescita vascolare e progettato un farmaco che blocca angiogenesi.

Uso di questo farmaco nei pazienti —> tumore primario non cresce ma si formano più metastasi —> impiego in

clinica limitato

Non tutte le cellule sono uguali.

Embrini ed eliminando cellule specifiche. L’eliminazione di alcune di queste cellule non generano malformazioni,

mentre l’eliminazione di altre causano malformazioni patologiche. Questo indica che alcune cellule sono più importanti

di altre.

Cellule staminali

• Cellule in grado di generare più tessuti

• Deve essere in grado di rinnovarsi

• Capacità potenziale di proliferazione. La cellula staminale rigenera un’altra cellula staminale in un unico ciclo

cellulare. Si divide e forma due cellule, una rimane staminale e l’altra si differenzia e prolifera.

Potenziale delle cellule staminali=Capacità di produrre cellule mature

• Totipotente = cellula in grado di generare un embrione intero (tessuti extra embrionali e tessuti organi)

• Pluripotenti = cellule in grado di generare tutti gli organi di un embrione ad eccezione dei tessuti extraembrionali

• Multipotenti= cellule che hanno minore possibilità di sviluppo.

Nell’adulto le cellule staminali che rimangono sono le multipotenti con una specificità rigenerativa. Non ci sono più

cellule totipotenti e multipotenti.

Tessuti:

• Epiteliali contenenti cellule staminali sufficienti per tutto il ciclo vitale

• Connettivali: hanno cellule staminali. Il sangue è il tessuto connettivale con il più alto numero di cellule staminali

poiché è un tessuto con un alto grado di rigenerazione.

• Muscolari con poche cellule staminali insufficienti per sostenere danni muscolari prolungate.

• Scheletrici con poche cellule staminali insufficienti per sostenere danni muscolari prolungate.

Gli altri tessuti non hanno cellule staminali. Non posono rigenerarsi

Efficacia e utilizzo delle cellule staminali in un individuo adulto.

Effetti di chemioterapia in un paziente che ha tumori. Lil problema dell’uccisione delle cellule tumorali è la difficoltà di

non uccidere cellule non tumorali in contemporanea.

La più alta sensibilità di rigenerazione appartiene alle cellule ematopoietiche del sangue.

Cellule ematopoietiche = cellule staminali del midollo osseo. Sono presenti nel midollo osseo delle ossa “rosso”.

Possono dare sia cellule rosse del sangue (piastrine e GB) sia tutte le cellule bianche (GB linfociti e monociti) .

Possono rigenerare completamente la componente sanguigna. Non ci può essere fallimento nella rigenerazione del

sangue. Le altre ossa hanno midollo giallo.

Le cellule staminali emopoietiche possono essere coltivate in laboratorio.

Si estraggono dal midollo osseo, si espandono. Si uccidono tutte le cellule del sangue tramite un condizionamento

(momento critico) e si iniettano le cellule staminali, che svolgono il recovery. Procedura usata frequentemente. Le

cellule staminali vanno nel midollo osseo dove iniziano a ripopolare il sistema circolatorio nel giro di poco tempo.

Quelle importanti utilizzate e coltivate sono le cellule embrionali staminali, derivate dagli embrioni e sono in grado di

proliferare in condizioni ottimali ricreate in laboratorio, senza che differenziano. Possono essere modificate

geneticamente e fatte differenziare a seconda delle capacità tecniche che abbiamo

CELLULE STAMINALI

Le prime cellule staminali identificati sono le cellule staminali embrionali. Sono cellule staminali che derivano dalla

massa interna dall’embrione. Queste cellule sono pluripotenti: possono generare tutti i tessuti di un embrione ma non

possono generare un embrione intero.

Queste cellule possono essere tenute in coltura in condizioni in cui non differenziano ma continuano a proliferare.

Possono essere geneticamente programmate.

Il passaggioo dalle cellule staminali di topo a quello delle altre specie è stato complicato perchè ogni specie ha delle

barriere biologiche distinte.

Le prime cellule staminali embrionali umane sono state ricavate 15 anni dopo rispetto a quelle di topo. Queste non

sono mai state utilizzate per creare organismi geneticamente modificati per questioni etiche. Queste cellule hanno un

potenziale rigenerativo, sono quindi usate per rigenerare organi.

In diverse nazione sono apparse diversi tentativi di regolamentare la loro applicazione.

La ridotta applicazione è dovuta sia a motivi etici che biologici

13 della legge n. 40 del 2004 pone il divieto assoluto di sperimentazione e ricerca sulle cellule embrionali che non

persegua finalità terapeutiche e diagnostiche volte alla tutela della salute e allo sviluppo dell'embrione stesso. In

particolare, non è consentita la ricerca sulle cellule staminali “italiane”.

Motivo biologico e non etico. Se uso la cellula styaminale embrionale umana derivata da un embrione e usata in

medicina rigenerativa può portare al fenomeno del rigetto. Questo avviene se le cellule staminali impiantate sono

riconosciute come estranee dal corpo ospitante.

Esperimento di Yamanaka

Nel 2024 è possibile prelevare dei fibroblasti da un individuo o cellule ematopoietiche dal sangue e convertirle in

cellule pluripotenti che hanno los tesso identico potenziale delle cellule staminali embrionali.

Il problema biologico del rigetto non si presenta se le cellule staminali vengono indotte nello stesso individuo da cui

sono state prelevate.

Cellula differenziata e farla tornare indietro a uno stadio di pluripotenza. Questa conversione da cellula adulta a

cellula staminale richiede un basso numero di geni.

Sono sufficienti 4 geni (KLF4, SOX2, c.Myc e Oct3/4) per riconvertire un fibroblasto adulto in una cellula staminale

embrionale indotta: IPS (Induced Pluripotent StemCell).

Se posso convertire una cellula staminale in una differenziata quindi posso utilizzare questi quattro geni.

Dove sono espressi questi geni?

Problema scientifico: inserimento di un gene all’interno di una cellula.

Abbiamo meccanismi potenti per eliminare DNA esogeno.

In parallelo al lavoro di Yamanaka molti reparti scientifici si occupavano di tale problema.

Sono stati sfruttati i Virus poichè in grado di infettare e integrarsi nel genoma di un individuo ospitante.

Generare virus ricombinanti ognuno dei quali esprime un gene del genoma. Retrovirus (virus a RNA ) sono molto

efficaci nell’infettare una cellula e integrare il proprio genoma al suo interno.

Una volta risolto il problema dell’inserimento di un gene all’interno di una cellula, è necessario osservare il

cambiamento indotto dal l’inserimento di tale gene nella cellula.

È facile osservare se il gene di interesse è riuscito a convertire un fibroblasto in una cellula staminale, poiché queste

ultime acquisiscono una capacità proliferativa nettamente maggiore.

Trasduco le cellule con virus e se osservo cambiamento morfologico vuol dire che soo riuscito a indurre una

riconversione a cellule staminali.

Se assumo che basta una combinazione di geni per dare staminalità è ok

Se la staminalità è controllata in maniera repressiva, è repressa da un gene, facendo combinazioni non riesco a

ottenere cellule staminali.

Il gene per la staminalità viene espresso allo stadio embrionale non adulto.

Infezioni di cellule con combinazioni di 100 geni per volta. Questo riduce il numero di infezioni. Nel momento in cui

una combinazione di geni da un risultato possono provare con 50 geni.

Andando avanti cosi arrivo all’esperimento finale in cui vennero identificati 4 geni sufficienti per ritrasdurre in una

cellula staminale.

Questi 4 geni sono stati utilizzati per creare in laboratorio tessuti embrionali —> topo trasgenico.

Questa scoperta ha u grosso difetto applicativo.

Il gene c-Myc codifica per una proteina che funge da oncogene: la sua amplificazione genera un tumore perchè ha

un’elevata attività proliferativa e spinge le cellule nel ciclo cellulare.

Gli altri tre geni codificano per 3 fattori che cambiano la disposizione della cromatina: aprono la cromatina e indicano

che rendendo più accessibile il DNA permettono la riconversione in uno stato embrionale. Sono importanti perchè

nello sviluppo e nel differenziamento si parte da una cellule amebrioanle che trascrive facilmente tutto il genoma. E

andando a differenziarsi, le parti di genoma non utile a quella cellula differenziata vengono compattate. Nelle cellule

staminali invece tutto il genoma deve essere accessibile

Le iPS superano il problema etica e immunologica superando la barriera applicativa.

Nell’ultimo anno sono stati curati i primi pazienti con diabete di tipo I utilizzando le proprie cellule staminali per

ricostituire il pancreas

Cosa rende una cellula embrionale?

Yamanaka sfrutta la conoscenza della riprogrammazione nucleare definita come la capacità di indurre nel nucleo una

riprogrammazione genetica che nel caso specifica dell’embriologia significa staminalità.

Gli studi sulla riprogrammazione nucleare hanno u vantaggio rispetto a quelli di Yamanaka. Lui ha potuto fare studi

grazie alle scoperte dei virologi riguardo l’utilizzo di virus per l’infezione di cellule.

Esperimento di Gurdon: “l’uovo e il nucleo: la battaglia per la supremazia”

Nuclear transfer: processo di sostituzione del nucleo di un embrione recipiente fecondato con il nucleo di una cellula

adulta porta comunque allo sviluppo dell’embrione.

Nella conoscenza comune il DNA contenuto nel nucleo trascrive geni e fornisce informazioni sullo sviluppo e

sull’espressione genica . Ma se la sostituzione del nucleo di un embrione fecondato con il nucleo di una cellula porta

comunque al suo sviluppo vuol dire che le informazioni possono essere contenute nel citoplasma.

Più avanti andiamo con lo sviluppo embrionale meno efficiente sarà questo trasferimento.

La pecora Dolly è stata generata con questa tecnica di nuclear transfer.

Le mutazioni che un nucleo acquisisce durante la vita sono deleterie per l’organismo che si sviluppa a partire da quel

nucleo.

Fusione cellulare è usata per immortal