Biologia dei microrganismi

Cosa studia la microbiologia

La microbiologia si divide in: cellulare, ambientale, molecolare; e in: virologia, ecologia microbica, genetica, microbiologia medica. Il poter controllare la crescita microbica ha importanza sulla conservazione di un alimento: se un prodotto è confezionato è obbligatorio indicare la data di scadenza e quindi il numero di microorganismi presenti in quel alimento (carico microbiologico). Ad esempio, tutti i prodotti latteo-caseari hanno una componente microbica, tutti i prodotti freschi ce l’hanno; tutti i componenti biologici presentano microorganismi, non esiste un ambiente naturale sterilizzato. Anche gli alimenti in scatola hanno subito un abbattimento della carica microbiologica per essere conservati. Inoltre, i microorganismi possono essere utilizzati per ottenere prodotti con un determinato sapore/odore selezionandoli.

La microbiologia può trovare applicazioni in diverse aree: industria agro-alimentare, biotecnologie industriali o ambientali, industria chimica, medicina diagnostica, ambiente ed energia. Ad esempio, gli integratori sono ceppi microbici selezionati, con caratteristiche particolari per renderli vivi e vitali fino al consumo; si tratta di una tecnologia bio molto sofisticata. Infine, il microbioma umano è molto importante in termini di salute dell’uomo; il 99% dei microorganismi non sono patogeni, il restante è importante per garantire la salute dell’uomo. Tutti gli esseri viventi presentano un numero elevato di microorganismi che si sono adattati e nel caso dell’uomo hanno un ruolo fondamentale per mantenere la salute.

Classificazione dei viventi

Quando si parla di microorganismi si ha una difficoltà in più: non li si può vedere a occhio nudo. La biologia è molto importante per classificare un animale; la descrizione morfologica non aiuta a identificare i microorganismi: le informazioni a livello genetico sono più accurate. Se si parla di microorganismi unicellulari l’entità fondamentale è la cellula e quindi la sua struttura. La capacità dell’uomo di catalogare si è evoluta molto; tradizionalmente gli esseri viventi erano divisi in piante (funghi alghe batteri piante) e animali (protozoi e animali); nel 1886 è stato poi aggiunto il regno dei protisti che comprende protozoi, funghi, alghe e batteri; successivamente si è avuta la distinzione in procarioti ed eucarioti (1938).

Infine, si è arrivati al 1990 quando è stata proposta la distinzione in batteri, archei, eucarioti grazie alla lettura delle sequenze degli acidi nucleici; è stato Woese a notare la presenza di qualcosa in comune tra soggetti diversi. Da lì si è poi avuta la nascita della classificazione molecolare come disciplina. Il modo in cui i microorganismi sono classificati dipende da come e quando vengono fatte le scoperte; la classificazione più corretta è sicuramente conseguenza della scoperta del DNA e delle informazioni contenute in esso. I viventi sono divisi in tre grossi regni; la chiave di volta di questa intuizione è ottenuta da Woese, il quale ha intuito che poteva essere preso in considerazione un comun denominatore di tutti i genomi potendo così utilizzarlo per fare dei confronti.

Gli alberi filogenetici

Grazie alla classificazione possono poi essere costruiti gli alberi filogenetici che mettono in rapporto organismi diversi; si tratta degli schemi che permettono di stabilire la distanza evolutiva che c’è tra un soggetto biologico e un altro. Ogni ramo è un risultato di un algoritmo matematico che prende in considerazione la distanza che può essere piccola o grande in base all’evoluzione. È il risultato di un calcolo basato su un confronto tra un’informazione comune presente nel genoma di tutti gli organismi viventi e si misura così la diversità.

Dimensioni dei microorganismi

I microorganismi sono tutti piccoli; una cellula di un batterio ha circa un diametro di 10^-6 m = 1 μm. Le dimensioni variano da 0,5 a 2 μm di lunghezza se la cellula ha una forma sferica. Quando si parla di microorganismi si definiscono delle dimensioni e bisogna utilizzare il microscopio ottico. Per poter vedere i microorganismi bisogna ingrandire di un tot con il microscopio; la distanza più piccola tra due punti che l’occhio può distinguere è di circa 0,1-1 mm, quindi per poter vedere un batterio è necessario ingrandirlo di tre ordini di grandezza e quindi di 1000 volte: 1 mm = 10^3 μm. A differenza dei procarioti, le cellule degli eucarioti sono più grandi: di solito vanno da 100 a 50 μm e quindi è possibile utilizzare un microscopio che ha un ingrandimento più basso, circa di 500 volte.

Eucarioti-procarioti

Si può fare una discriminazione tra eucarioti e procarioti (batteri e archea); le principali differenze sono:

• Le dimensioni sono sostanzialmente diverse: le misure dei procarioti vanno da 1 a 10 μm, quelle degli eucarioti da 10 a 100 μm.
• La compartimentalizzazione: la cellula eucariotica contiene organelli, possiede un nucleo, il reticolo endoplasmatico, i mitocondri, le funzioni sono dislocate nei vari compartimenti, è una cellula compartimentata; quella procariotica ha membrana cellulare ma è una cellula non compartimentata, la dislocazione delle funzioni è più semplice.
• Negli eucarioti c’è una membrana nucleare che contiene al suo interno il materiale genetico; nei procarioti il materiale è sparso nella cellula, il DNA è all’interno ma non è separato.
• Gli eucarioti possiedono degli organelli (es. plastidi, cloroplasti, mitocondri);
• I procarioti hanno una struttura di rivestimento esterno detta parete cellulare, molto robusta.
• La differenza di ribosomi (=macchina di proteine e materiale genetico che serve per costruire proteine, assembla la componente proteica della cellula): hanno dimensione diversa che per i procarioti è di 70S, mentre negli eucarioti pesano 80S, sono leggermente più grossi. Il peso dei ribosomi è stata una delle prime differenze evidenziate tra le cellule di un tipo e dell’altro; si è scoperto che quelli dei procarioti sedimentano con più difficoltà perché sono più leggeri. S è l’unità di misura che si utilizza e dà un’indicazione sulla velocità di sedimentazione.
• Negli eucarioti i cromosomi possono essere due o più, mentre nei batteri è uno (?), si ha un’unica copia, alcuni ne hanno un paio ma non di più.
• Il meccanismo di duplicazione: negli eucarioti si può avere la meiosi o la mitosi; la meiosi, che sottintende la riproduzione sessuata, non esiste nel mondo dei procarioti. Nei procarioti le cellule si dividono solo per mitosi.

Tutte le cellule, che siano procariotiche o eucariotiche, sono separate dall’ambiente esterno dalla membrana cellulare, la quale ha un’importanza fondamentale: la membrana non distingue ma identifica la presenza di una cellula. Nella cellula batterica al di sopra della membrana cellulare c’è la parete cellulare.

Crescita dei microorganismi

Un procariote può fare varie mitosi per fare la divisione cellulare; uno dei parametri oggettivi che è necessario misurare è come gli organismi crescono. Per misurare la crescita di una popolazione si usa il numero di individui (per singolo soggetto il peso). Nel caso dei microorganismi la crescita si misura contando il numero di microorganismi; si parla di organismi unicellulari che si dividono per mitosi, la quale è una divisione che aumenta il numero degli individui in modo esponenziale. Negli eucarioti si può avere la mitosi da una cellula a due, ma anche la meiosi, la quale genera cellule di tipo sessuato diverse da quella iniziale, arricchendo così il materiale genetico delle generazioni successive. Con la mitosi difficilmente si ha una diversificazione: l’evoluzione, un miglioramento è possibile con lo scambio dell’informazione genetica.

La teoria evolutiva

La teoria evolutiva è una teoria che si basa su un concetto: le cellule più complesse (eucariotiche) sono cellule che sono semplicemente derivate dall’unione di due cellule più semplici, ovvero con processo di simbiosi; una cellula è entrata nell’altra generando un organismo nuovo più efficiente e vincente dal punto di vista evolutivo. È possibile notare che gli organelli degli eucarioti sono delimitati dalla membrana cellulare nell’interno della cellula, il materiale genetico si trova nei mitocondri: la teoria ipotizzata ha come base il fatto che quando si separano i mitocondri dal resto della cellula si nota che in essi c’è del DNA che assomiglia molto a quello delle cellule procariotiche e quindi diverso da quello presente nel nucleo. La teoria simbiotica è così stata accettata e sostenuta: la simbiosi è alla base dell’evoluzione degli organismi superiori.

Forme dei microorganismi

I microorganismi hanno varie forme: bastoncini, catene di bastoncini, bastoncini ricurvi, cocchi a catenelle, tetradi, sarcine, masse ecc. Avere delle cellule singole o in catenelle significa che la cellula singola quando si divide in due rimane unita e così via. In caso di cellule sferiche/ovali quando si dividono danno diplococco oppure tetradi. Il fatto di avere cellule unite non significa avere organismi pluricellulari in quanto non c’è comunicazione tra le cellule, sono semplicemente unite. Inoltre, avere una crescita a catenelle significa avere delle unità più pesanti di quelle singole: nel caso di un habitat naturale lontano dall’ossigeno, avere una cellula singola aumenta la difficoltà di scendere verso il fondo e quindi allontanarsi dall’ossigeno; se invece si ha una cellula più pesante si riesce a sedimentare più velocemente e ad allontanarsi dall’ambiente non adatto.

Il microscopio

Il microscopio è lo strumento principale per chi fa microbiologia. Un microscopio è fatto da diverse componenti: le lenti per ingrandire, gli obiettivi e gli oculari per l’ingrandimento. Per sapere quanto si sta ingrandendo bisogna vedere cosa c’è scritto sull’obiettivo, che può essere da 10x a 100x, e sugli oculari che sono 10x. L’ingrandimento totale si ottiene moltiplicando quello dell’oculare per quello dell’obiettivo: es. 1000= 10 x 100. La luce viene fornita da una lampana alogena o a led che passa attraverso un’apertura regolabile (diaframma) ed è convogliata con il condensatore nel punto più piccolo possibile, ovvero il punto in cui si appoggia il vetrino su cui si depone il campione: bisogna fare in modo che la luce sia molto intensa e concentrata; la luce è poi raccolta dal sistema di lenti che ingrandiscono. Il fascio di luce finisce a livello dell’oculare.

Il microscopio ottico è basato sul posizionamento delle lenti, quello elettronico possiede livelli di ingrandimento superiori. L’ingrandimento massimo per un microscopio ottico è di circa 1000/2000 volte. La base del microscopio contiene la fonte di luce che deve essere trasmessa alla parte superiore dello strumento. La condizione di quanta luce passa è data a livello del diaframma; il piano di appoggio del vetrino si può muovere con regolazioni per spostarlo sull’asse delle x o delle y grazie a delle viti; gli spostamenti sono regolabili abbastanza finemente. Sopra il vetrino è posizionato l’obiettivo opportuno che consente di vedere cosa è posizionato sul vetrino (di solito 100x); la luce passa attraverso un sistema di specchi ai due oculari che ingrandiscono ulteriormente.

Obiettivi a secco o a immersione

L’obiettivo è la parte più costosa del microscopio, è quello che garantisce la qualità. Se si visualizza la sezione dell’ultima lente dell’obiettivo si nota la presenza di due vetri appoggiati: il vetrino porta-oggetto, per vedere le culture batteriche quando queste sono in sospensione, e il vetrino copri-oggetto; la lente dell’obiettivo non è fisicamente a contatto con il vetrino: la continuità può essere garantita con un olio minerale. Gli obiettivi a secco sono senza olio, quelli a immersione ce l’hanno. La differenza principale tra questi due obiettivi è data da come si dirigono i raggi di luce: la luce passa dall’aria al vetro e viene rifratta colpendo i microorganismi e subisce un’ulteriore deviazione quando attraversa il vetro.

Nel caso dell’obiettivo a secco, alcuni raggi di luce vengono persi e non vengono raccolti dal vetro superiore; con quello a immersione invece non c’è la perdita dei raggi, nel passaggio di uscita dal vetro all’olio e di nuovo nel vetro, che ha lo stesso indice di rifrazione, il raggio non viene deviato e viene poi raccolto dalla lente di ingrandimento. Con l’obiettivo a immersione si raccolgono quindi più informazioni. Il dato che indica la capacità di raccogliere informazioni è dato dall’angolo compreso fra l’asse ottico e il raggio più esterno, ovvero l’apertura numerica della lente. In un obiettivo a secco la distanza fra il vetrino e la lente è maggiore che in quello a immersione; la lente di quello a immersione può avvicinarsi all’oggetto che si vuole ingrandire. Il potere risolutivo è la capacità di distinguere due punti vicini. Nelle condizioni ottimali l’oggetto è visto in modo nitido; man mano che il potere risolutivo diminuisce, la nitidezza peggiora. Avere un valore di apertura numerica alta vuol dire raccogliere più informazioni e quindi aumentare il potere di risoluzione.

Gli obiettivi a immersione riportano la scrittura “OEL” e di solito hanno la parte finale telescopica; si ha la possibilità di toccare il vetrino con l’obiettivo in quanto il sistema molla-vetrino si può contrarre leggermente: si tratta di un sistema di sicurezza. Con un obiettivo a secco non si ha bisogno di andare a toccare il vetro. Il diaframma è posto dopo la sorgente di luce e regola quanta luce entra nel sistema; se si chiude il diaframma si riduce molto la luce. Nel momento in cui ci si avvicina molto si ha la necessità di molta luce e quindi il diaframma aperto; se ci si distanza il diaframma deve essere regolato verso la chiusura.

Preparato colorato-a fresco

I microorganismi sono fatti di sostanza organica, hanno una membrana e una parete cellulare robusta. Se vengono messi in una sospensione acquosa appoggiata su un vetro e posta a una sorgente luminosa non si vede nulla. Per poter vedere microorganismi con un microscopio ottico bisogna rendere le cellule meno trasparenti colorandole, bisogna aggiungere delle molecole inorganiche coloranti che si legano alla cellula e la rendono meno trasparente, bisogna aumentare il contrasto tra cellula e acqua. Le colorazioni hanno il vantaggio di permettere di vedere la cellula, tuttavia il modo in cui il colorante viene fatto aderire alle cellule è “brusco” perché le uccide; il difetto di utilizzare un microscopio ottico è il fatto che bisogna uccidere i microorganismi.

Dal punto di vista ottico i microorganismi possono essere definiti degli oggetti di fase. Si distinguono oggetti di ampiezza e oggetti di fase: gli oggetti di ampiezza causano una deviazione del raggio luminoso; l’onda luminosa che attraversa gli oggetti di fase non subisce deviazioni.

Il microscopio a contrasto

Esistono dei microscopi ottici a contrasto di fase che consentono di vedere microorganismi preparati a fresco senza colorarli. Il microscopio a contrasto di fase funziona sfruttando una caratteristica della luce: se due onde luminose sono mantenute nella stessa fase e vengono fatte convergere si sommano e danno una luminosità; se invece si sfasano e poi si riuniscono il risultato è un’assenza di luce. Nei microscopi ottici a contrasto la luce va dalla sorgente agli oculari: dalla sorgente la luce incontra il diaframma, il quale è anulare, ovvero il fascio passa nello spessore della regione bianca; il condensatore condensa luce che arriva verso il punto di osservazione (vetrino), poi i raggi luminosi attraversano il vetrino e quando escono possono prendere due vie: se non hanno intercettato nulla, escono mantenendo la stessa inclinazione e sono raccolti dalla lente; se intercettano qualcosa subiscono una deviazione e intraprendono un percorso diverso passando al centro della lente.

Si parla così dell’anello di fase: se i raggi passano di lato devono attraversare uno spessore maggiore e vengono sfasati di ¼ della lunghezza d’onda e generano l’assenza di luce; nel punto dove ci sono le cellule si ha un punto più scuro dato dalla somma delle onde. Il risultato è un’osservazione contrastata senza dover colorare le cellule. La luce sta dove non c’è niente, mentre l’assenza di luce simboleggia la presenza di cellule. Con questo microscopio il guadagno di informazione è estremamente alto. La tecnologia dei microscopi di fase deve essere tale da mantenere l’allineamento: ci sono delle viti che servono ad allineare l’anello con il condensatore.

Le membrane cellulari

La cellula è tale perché è fisicamente separata dall’ambiente esterno grazie alla membrana cellulare: essa ha una natura organica in quanto è caratterizzata da un doppio strato fosfolipidico; ogni fosfolipide ha una testa e una coda. Le teste polari si espongono all’interno della cellula nello strato interno e verso l’esterno nell’altro strato; le code apolari invece si guardano reciprocamente. Questa disposizione è la conseguenza della natura delle molecole che costituiscono i fosfolipidi: la molecola base è il glicerolo; la testa è una molecola caratterizzata dalla polarità (che può quindi interagire con l’acqua).