Biologia dei microrganismi

EFFETTI DELLE CONDIZIONI AMBIENTALI SULLA CRESCITA MICROBICA

I microorganismi si adattano alle diverse condizioni di coltura:

-Quando si crea un terreno di coltura è necessario tener sotto

controllo il pH; i prodotti fermentati durano mentre quelli freschi no.

I microorganismi neutrofili fanno fatica a crescere pH diversi da quelli

neutri; vi sono poi quelli alcalofili e quelli acidofili.

Un acido organico, a parità di pH, è più battericida di un acido forte

su un microorganismo (es pH = 5): un acido organico si dissocia meno

facilmente, è un acido debole; se bisogna tamponare l’acido è

necessario usare più molecole alcaline. Inoltre, l’acido organico in

soluzione presenta sempre una forma dissociata e una non

dissociata; quando si ha un acido forte invece tutto è dissociato. La

forma dissociata, essendo carica, non riesce a passare la membrana

cellulare; la forma indissociata invece riesce a passare la membrana.

Il pH intra-cellula è più alto rispetto a quello fuori: quando la forma

indissociata entra va in equilibrio con la forma dissociata producendo H+ e abbassando il pH intra-cellulare.

A questo punto la cellula ha ATP-sintasi che può consumare ATP e buttare fuori ioni H+; se molte molecole

di acido organico entrano e producono ioni H+ a un certo punto l’energia finisce e la cellula si trova a un pH

intra-cellulare basso che interferisce su ciò che fa funzionare la cellula, ovvero gli enzimi. La diminuzione

del pH blocca l’attività metabolica; i microorganismi neutrofili continuano a buttare fuori ioni H+ per

tenere il pH prossimo alla neutralità ma prima o poi senza fonti di energia perdono la vitalità. I

microorganismi acidofili invece si adattano al pH acido che si crea al loro interno, non si contrappongono,

fermano il loro metabolismo e non muoiono. Negli acidofili il pH interno è maggiore di quello esterno, si

adattano; mentre per i neutrofili la differenza di pH diventa troppo elevata. (Quando si contano due specie

nello yogurt: si utilizzano due terreni preferenziali e uno dei due pH acido che facilità crescita lactobacillo

rispetto a termofilus; distinzione delle due specie).

-Per quanto riguarda l’ossigeno, esistono microorganismi aerobi obbligati, anaerobi facoltativi,

microaerofili e anaerobi obbligati. L’uomo a livello cellulare è anaerobo facoltativo: si ha la produzione di

acido lattico con la fermentazione quando si fa uno sforzo fisico elevato, ma come individui no. In genere

l’anareobiosi si ottiene con la CO2. In ambito alimentare in assenza di ossigeno ci sono prodotti conservati

in condizioni di anareobiosi. Descrivendo ambiente si possono conoscere quali microorganismi possono

svilupparsi.

-I microorganismi non crescono a qualsiasi temperatura; i microorganismi mesofili crescono a una

temperatura ideale di 10-40°C. I termofili sotto i 40°C-80 non crescono a temperatura ambiente non

crescono. Gli Ipertermofili crescono a temperature prossime all’ebollizione; questi microorganismi

presentano una struttura della membrana particolare (archea) con un doppio strato fosfolipidico fuso per

dare più rigidità. Infine, gli psicrofili crescono in maniera efficiente in temperature prossime allo 0, massimo

20°C.

-La disponibilità dell’acqua è un parametro importante e significa valutare l’acqua libera non legata alle

molecole e che può essere utilizzata dai microorganismi. Quando si parla di optimum si

definisce un range di

temperatura e pH; è

necessario stabilire delle

distribuzioni dove sull’asse

delle y è presente la velocità di

crescita che parte da zero e

sull’asse delle x la temperatura

o il pH: quando si hanno dei

microorganismi mesofili si ha

un range di temperatura, si ha

un intervallo in cui i microorganismi possono crescere. L’intervallo corrisponde all’optimum di crescita a

una determinata temperatura T o un valore di pH; la velocità di crescita è diversa dalla temperatura minima

a quella massima: man mano che si va verso la temperatura ottimale la velocità raggiunge il suo massimo e

successivamente decresce. Si ha una curva simile a quella di crescita; a destra e a sinistra dell’optimum si

ha una diminuzione della velocità (come attività diminuisce rispetto alla crescita). In tutti i fattori usati è

necessario considerare sempre un intervallo e una condizione ottimale, a destra e a sinistra della quale si

ha una diminuzione della velocità di crescita.

Quando si parla di acqua libera si intende il valore aw, ovvero il

rapporto tra la pressione di vapore di aria di una soluzione sulla

pressione di vapore aria su acqua pura. In acqua distillata il valore

dell’acqua libera è pari a 1, il rapporto dei valori è 1. Man mano

che le sostanze disciolte aumentano, il valore di aw diminuisce in

quanto la pressione di vapore della soluzione avrà un valore più

basso della pressione di vapore dell’acqua pura. Quando si scioglie

qualcosa si limita la disponibilità d’acqua per altre attività.

Ad esempio, una marmellata si conserva dallo sviluppo microbico meglio di un succo/spremuta: la

differenza sta che nel succo la concentrazione di zucchero assorbe acqua e la sottrae per l’attività dei

microorganismi; quando si mette un alimento sotto sale, questo sottrae acqua libera al sistema e preserva

l’alimento dallo sviluppo microbico. Quando si mettono gli alimenti sott’olio, il quale è anidro,

automaticamente si tolgono ossigeno e acqua.

I microorganismi sono in grado di crescere anche con poca acqua; in funzione del parametro aw si

distinguono microorganismi che tollerano valori di acqua libera alti/bassi/medi: si hanno quindi quelli non

alofili, moderatamente alofili, alofili estremi. Ci sono poi microorganismi adatti a crescere in condizioni di

acqua libera bassa, come ad esempio le muffe sul pane non hanno tanta acqua libera a disposizione; in

questo modo nelle derrate alimentari, conoscendo le condizioni ambientali dell’alimento, si può sapere

quale tipo di microorganismi possono crescere/sviluppare. Ridurre la velocità di crescita in un alimento

fresco vuol dire allungare la shelf-life e conservare maggiormente la qualità dell’alimento.

Quando si parla di rapporti con l’ossigeno bisogna

tenere conto del fatto che quando si ha ossigeno si

hanno anche altre forme nel sistema: l’O2 causa

diverse reazioni in cui sono presenti molecole

altamente reattive che reagiscono con altre molecole

della cellula cambiandone la struttura e la forma,

come ad esempio l’acqua ossigenata. Si ha uno

sviluppo di radicali che possono essere tossici per la

cellula; i microorganismi aerobi devono essere

protetti dall’eventuale sviluppo dei radicali

dell’ossigeno grazie alla presenza di due enzimi: una

catalasi e una superossidodismutasi; in questo modo

l’anione superossido viene convertito in acqua

ossigenata e ossigeno (acqua ossigenata usata per

biocida) dalla superossidodismutasi e successivamente

la catalasi libera da due molecole di acqua ossigenata due molecole di acqua e ossigeno. La catalisi è una

molecola che deve proteggere la cellula dallo sviluppo di molecole reattive; questo enzima ha un’attività

altissima e reagisce immediatamente perché altrimenti la cellula va incontro a danni per lo stress

ossidativo. Se il microorganismo è anaerobio non è dotato degli strumenti di protezione in quanto non

necessita di ossigeno e se gli viene somministrata una goccia d’acqua ossigenata essa rimane tale, non

succede nulla; invece i microorganismi aerobi sono armati nei confronti delle molecole tossiche, hanno gli

enzimi che funzionano immediatamente che determinano la formazione di acqua e di ossigeno e quindi di

bollicine/schiuma: questo è simbolo che il microorganismo è catalisi-positivo. L’aggiunta di acqua

ossigenata è un test che consente di differenziare i microorganismi aerobi da quelli anaerobi.

CONCETTO DI STERILITA’

Per poter coltivare dei microorganismi è necessario lavorare in sterilità: non bisogna contaminare il

campione con altri microorganismi e allo stesso modo l’uomo non deve essere contaminato dai

microorganismi patogeni studiati. Le condizioni di sterilità sono generate da fiamme del fornelletto bulsen

o da dalle cappe a flusso laminare dove l’aria viene spinta dall’alto verso il basso passando attraverso filtri,

immettendo così dell’aria sterile che permette di lavorare in modo agevole. Vi è poi la necessità che i

contenitori dove sono messi i microorganismi, i terreni siano sterili; il concetto di sterilità deve essere

assoluto, non bisogna prevedere una concentrazione di microorganismi minima tollerabile in quanto deve

essere zero. In un laboratorio di microbiologia deve essere assoluta; nelle industrie alimentari è un

concetto statistico (tempi di riduzione decimale). Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il

calore principalmente perché le proteine denaturano; la sterilità è mantenuta nei terreni grazie a dei

processi di sterilizzazione che avvengono sotto la pressione di vapore perché il calore umido sterilizza di più

del calore secco: se si porta un ambiente a 100°C in assenza di vapore si ha effetto di sterilizzazione minore;

le goccioline d’acqua trasmettono vapore in modo molto più efficace. Ecco perché si utilizzano delle auto-

clavi, ovvero dei contenitori che a seguito di una somministrazione di energia scaldano una resistenza che

scalda l’acqua distillata (per evitare incrostamenti); essi sono costituiti da un coperchio di acciaio, da una

valvola e da due uscite, una in basso e una in alto. La valvola serve per far uscire il vapore affinché lo spazio

di testa sia saturo di vapore; inizialmente si apre la valvola sotto, la si chiude e quando il vapore esce

dall’alto si è sicuri che lo spazio dell’autoclave sia pieno di vapore. Se si continua a offrire energia, si ha un

aumento temperatura sopra i 100°C e un aumento di pressione; in genere si lavora in condizioni standard

per 20 min per ¾ atm a 116 °C o per 30 min a ½ atm a 111°C. I parametri da tenere sotto controllo sono

quindi la pressione, la temperatura e il tempo e per questo l’autoclave è dotata di termometro, di un

manometro e di un cronometro. La temperatura e la pressione seguono un andamento prevedibile; il

tempo è fondamentale perché se non è corretto non si riesce a sterilizzare tutte le cellule presenti. Non

tutti i prodotti possono essere sterilizzati in questo modo: per le soluzioni va bene ma per la vetreria di

laboratorio si utilizza una stufa a temperatura molto più alta. Se bisogna sterilizzare degli strumenti p