Biologia Cellulare, prof Ferrari

Comunicazione intercellulare

L'evoluzione degli organismi multicellulari dipende dalla capacità delle cellule di comunicare una con l’altra. La comunicazione intercellulare regola:

• Lo sviluppo e l’organizzazione dei tessuti
• Coordina le diverse attività cellulari per il corretto funzionamento degli organi del nostro organismo

La comunicazione intercellulare negli animali superiori è complessa, suggerendo che molti geni in questi organismi siano coinvolti nel suo controllo e coordinazione. Dall’ambiente la cellula riceve segnali che attuano risposte biologiche. Questi segnali determinano programmi:

• Di sopravvivenza
• Di apoptosi (degenerazione cellulare)
• Proliferativi: segnali che determinano se e quando la cellula deve dividersi. Questi segnali sono importanti nell’oncogenesi
• Di differenziamento

Di solito questi programmi sono regolati in modo aggregato e spesso i segnali proliferativi bloccano temporaneamente le attività differenziative. La comunicazione intercellulare serve agli organismi pluricellulari per il loro sviluppo.

Cellula segnalante e cellula bersaglio

La cellula segnalante è quella che produce il ligando (segnale vero e proprio), mentre la cellula bersaglio è quella che presenta il recettore. In alcuni casi i segnali possono rimanere ancorati alla cellula segnalante ma più spesso il ligando viene secreto. Nella cellula bersaglio, il legame segnale-recettore scatena una via di trasduzione del segnale.

In tutti i recettori troviamo tre strutture:

• Sito di legame
• Sito di trasduzione
• Sito di modulazione dell’attività

Ci sono recettori specifici per famiglie di segnali e ogni cellula ha un corredo recettoriale peculiare. Lo stato di differenziamento può far variare il pool di recettori della cellula. La via di trasduzione del segnale è formata da una serie di molecole che interagiscono a cascata portando il segnale dal recettore al bersaglio. Gli effetti biologici principali sono:

• Attivazione proteine (insorgenza rapida)
• Modificazioni citoscheletriche (insorgenza rapida)
• Trascrizione geni (insorgenza tarda)

Risposta cellulare

1. Riconoscimento: dello stimolo mediante il legame ligando-recettore. Può avvenire sia sulla superficie cellulare che nel citosol.
2. Trasferimento: come il recettore fa sì che lo stimolo entri nella cellula.
3. Trasmissione: passaggio da molecola in molecola del messaggio. In questa fase il segnale può essere modulato.
4. Cessazione: tutti i messaggi devono avere una fine.

La comunicazione intercellulare deve essere specifica e modulabile in intensità e reattività della risposta (cinetica). La cinetica della risposta comprende inizio, durata e cessazione della stessa.

Comunicazione a corto raggio

È uno dei due tipi di comunicazione intercellulare. Le comunicazioni a corto raggio si dividono in:

• Da contatto: ligando e recettore sono legati alla membrana. Serve per coordinare rapidamente gruppi di cellule con la stessa funzione come ad esempio le cellule di uno stesso tessuto. Le cellule segnalante e bersaglio si toccano.
  • Gap junction: è un caso particolare di comunicazione da contatto. Le gap junctions sono strutture proteiche che formano un canale che mette in comunicazione i citosol di due cellule adiacenti. Permettono la diffusione di piccole molecole (Ca²⁺ o cAMP) in sincizi funzionali. Le gap junctions collegano di solito più di due cellule; esse condividono quindi parzialmente elementi del proprio citosol.
• Paracrina/Autocrina: i mediatori locali hanno una breve emivita. Il segnale diffonde poco perché poi i ligandi sono degradati e quindi ha un dominio di azione molto corto. La comunicazione è autocrina nel momento in cui la cellula segnalante e bersaglio coincidono. Questi meccanismi sono diffusi nel nostro sistema immunitario e durante l’embriogenesi (i morfogeni sfruttano la comunicazione paracrina). I tumori spesso producono fattori di proliferazione che diffondono in modo paracrino/autocrino.

Comunicazione a lunga distanza

Il sistema endocrino e nervoso utilizzano la segnalazione a lunga distanza.

• Endocrina: gli ormoni attraverso il sangue arrivano alla cellula bersaglio. Essi sono molecole idrofobiche secrete dalle cellule endocrine nel torrente sanguigno e trasportati da proteine carrier peculiari. La cellula bersaglio è molto distante da quella segnalante e quindi è necessaria una elevata specificità tra ormone e recettore. I recettori ormonali riescono a percepire concentrazioni fino a 10^-8 M.
• Sinaptica: abbina fenomeni elettrici a segnalazioni chimiche. Il neurone segnalante possiede l’assone in cui passa il segnale elettrico e che termina con la sinapsi. La sinapsi è vicina al neurone bersaglio. La sinapsi è composta dalle membrane pre e post-sinaptiche separate dallo spazio sinaptico. Le membrane sono delle regioni con struttura proteica peculiare. Ci sono diversi tipi di sinapsi:
  • Assodentritica: Assone-Dendrite
  • Assosomatica: Assone-Corpo cellulare
  • Assoassonica: Assone-Assone

Il ΔV di membrana è il responsabile principale del rilascio delle vescicole presinaptiche che scaricano il neurotrasmettitore verso il neurone bersaglio. Il sistema nervoso sfrutta la polarizzazione dei neuroni per ottenere la specificità. Il sistema endocrino sfrutta l’affinità dei recettori. Il sistema nervoso ha una comunicazione rapida e i suoi effetti si esauriscono rapidamente; il sistema endocrino scatena invece effetti lenti e duraturi. Gli ormoni spesso influenzano la trascrizione dei geni cosa che il sistema nervoso non fa.

Recettori

Sono delle macromolecole (proteine con alto PM) localizzate su membrana plasmatica, nel citosol o nel nucleo della cellula bersaglio. Queste proteine portano spesso numerosi siti attivi con diverse funzioni. Di solito famiglie di ligandi interagiscono con famiglie di recettori; è rarissimo il caso in cui un solo ligando interagisce con un solo recettore. La capacità chiave di queste macromolecole è la loro capacità di trasdurre il segnale. L’interazione ligando-recettore avviene con legami deboli (ponti idrogeni, legami ionici, Van der Waals …) e ciò rende il legame reversibile. La stabilità del complesso è data dalla complementarietà fisica tra recettore e ligando. La K_d varia tra 10^-3 e 10^-12 M a seconda del contesto considerato. Nel momento in cui il ligando si lega ci sono dei cambiamenti conformazionali che fanno subire al recettore delle transizioni allosteriche. Queste modificazioni scatenano la cascata di trasduzione del segnale. I recettori si dividono in recettori di membrana e intracellulari:

• Di Membrana: il recettore ha un sito di legame extracellulare, un sito di legame di ancoraggio alla membrana (idrofobico) e un sito citosolico che consente la trasmissione del segnale. Questi recettori sono attivati da molecole extracellulari idrofiliche (citochine, neurotrasmettitori, fattori di crescita). Le cascate del segnale possono essere mediate da:
  • Proteine G di membrana
  • Canali ionici (permettono l’ingresso di ioni)
  • Attività enzimatiche (chinasi, fosfatasi …)
  • Modulazione della proteolisi

  Il pathway di trasduzione comprende effettori, secondi messaggeri e proteine bersaglio. Il segnale trasdotto è spesso modulato e modificato.

• Trasduzione: trasformazione del legame ligando-recettore in una cascata di interazioni fra proteine e reazioni enzimatiche che si conclude con l’attivazione di una risposta cellulare. La trasduzione decodifica quindi il segnale per produrre un evento biologico.

Effettori

• Proteine impalcatura: proteine che facilitano la trasmissione del segnale grazie alla loro capacità di legare numerose proteine strutturandole in maniera efficiente (coi siti attivi adiacenti)
• Proteine di integrazione: servono per far collaborare diverse vie di trasduzione.
• Proteine di trasmissione: hanno la capacità di amplificare il segnale per rinforzarlo. Possono produrre secondi messaggeri, possono attivare fisicamente altre proteine tramite l’idrolisi di GTP (proteine G) oppure possono avere attività chinasica/fosfatasica.

Secondi messaggeri

Sono piccole molecole come cAMP, Ca²⁺, IP₃ (Inositolo-3P) e DAG (DiAcilglicerolo). Hanno una alta diffusibilità che consente al segnale di propagarsi agevolmente. Attivano proteine tramite l’interazione fisica. Agiscono come “secondo ligando” dato che attivano delle proteine citosoliche. Amplificano il segnale.

Proteine G: hanno un meccanismo On/Off e tendono a spegnere il segnale. GTP è la forma attiva.

Chinasi: il legame covalente di un gruppo fosfato alla catena laterale di un aminoacido è la modificazione post-traduzionale più utilizzata per modulare l’attività delle proteine poiché è un legame prontamente reversibile e utilizza ATP e GTP che sono facilmente reperibili. Le fosforilazioni avvengono su residui di Ser, Thr, Tyr (tutti con gruppi -OH). Le chinasi di solito lavorano su Ser/Thr mentre una piccola percentuale lavora sulla Tyr. Le proteine fosforilate su Tyr svolgono ruoli chiave nel controllo della proliferazione cellulare. Il gruppo fosfato porta due cariche negative e può indurre cambiamenti conformazionali nella proteina. La fosforilazione è utilizzata per:

• Attivare/Inattivare la proteina
• Variare l’affinità tra proteine
• Variare la stabilità della proteina
• Indurre la degradazione della proteina

Le chinasi si suddividono in:

• Chinasi Ser/Thr: attivate da modificazioni allosteriche date da secondi messaggeri o da modificazioni covalenti
• Chinasi Tyr: attivate da ligandi extracellulari (si comportano come recettori)
• Chinasi a doppia specificità (MAP Chinasi): attivate per fosforilazione

Le chinasi sono proteine ubiquitarie all’interno della cellula. È importante la sequenza consenso che sta attorno alla serina da fosforilare. La struttura di una chinasi è la seguente:

• C: dominio catalitico (sito di legame per il substrato e per l’ATP). In questa regione sequenze specifiche determinano la selettività del substrato. Può variare a seconda della specificità della chinasi.
• R: dominio regolatorio (in condizione di inattivazione interagisce con il sito catalitico fungendo da pseudosubstrato). È il sito di legame per i secondi messaggeri. Quando la chinasi è inattiva il dominio R comporta un ripiegamento della proteina che maschera il sito C; il secondo messaggero serve a far riaprire la proteina. A volte la subunità R è distinta da quella C.
• A: regione di variabilità che può servire come sito di ancoraggio o di interazione con altre proteine.

Fosfatasi: hanno la stessa suddivisione delle chinasi. Le fosfatasi che agiscono su Ser e Thr sono formate da più catene polipeptidiche che formano un dominio catalitico e una subunità regolatoria. Quelle specifiche per la Tyr (PTP) sono simili a recettori ed un esempio importante è la CD45 che agisce nei linfociti T e B. Per quanto riguarda le fosfatasi a doppia specificità si ricorda la Cdc25 che ha un ruolo nella regolazione delle chinasi CDK (ciclina dipendenti). C’è un’attività fosfatasica di base aspecifica in ogni cellula. Quando si deve spegnere il segnale c’è un aumento di attività fosfatasica. La specificità è spesso assicurata dalla loro localizzazione.

• Intracellulari: sono recettori localizzati nel citoplasma o nel nucleo dove sono associati a complessi proteici che li mantengono inattivi. Gli attivatori sono molecole idrofobiche piccole (ormoni, vitamine …). Riconoscono sul DNA le sequenze HRE (Hormon Responsive Elements) presenti nel promotore di alcuni geni e ne inducono la trascrizione. In quasi tutte le risposte ormonali c’è una fase precoce lenta (produzione di fattori di trascrizione) che precede una fase tardiva.

Molto spesso lo stesso segnale attiva una via e contemporaneamente un meccanismo di stop della stessa (in maniera ritardata).

Specificità dei recettori

È necessario che il segnale produca un effetto specifico. In realtà rispetto ai possibili effetti biologici le molecole e i recettori sono pochi. Il primo meccanismo di specificità è dato da recettori diversi che legano lo stesso ligando. L’altro elemento fondamentale è la cascata del segnale: stesso recettore e ligando su cellule diverse provocano cascate di reazione diverse. La specificità è dunque data dalla modularità del sistema.

Cooperazione

Il risultato finale è sempre dato dalla cooperazione di segnali diversi. La cooperazione vale soprattutto per le funzioni più complesse delle cellule (apoptosi, proliferazione, differenziamento). Spesso diverse vie sono coinvolte nello stesso effetto.

Ridondanza

Le funzioni principali non sono mai a carico di un unico sistema ma spesso due diversi segnali permettono il mantenimento di uno stesso programma (sistemi backup).

Modulazione

L’amplificazione del segnale avviene grazie ai 2° messaggeri che vengono prodotti in gran quantità a partire da una sola molecola segnale. Anche l’attività enzimatica è un mezzo di modulazione del segnale.

Cinetica di insorgenza

Si intende la tempistica di apparizione dell’effetto e la sua durata. Effetto soglia: oltre una certa concentrazione del segnale quasi il 100% delle molecole bersaglio è attivata, a concentrazioni inferiori l’effetto risulta quasi impercettibile. L’effetto soglia si attiva attraverso la cooperatività o feedback positivi.

• Cooperatività: gli enzimi per poter attivarsi devono formare dei complessi proteici. Per potersi unire le singole unità devono essere attivate dal ligando.
• Feedback positivo: l’enzima ha un sito di attivazione che lega il segnale ma l’attività enzimatica massima si raggiunge quando il prodotto dell’azione dell’enzima interagisce con l’enzima stesso attraverso delle tasche di modulazione aumentandone la velocità di catalisi.

Desensitizzazione e downregulation servono nei casi in cui il segnale è in eccesso, mentre se è in difetto si attivano i meccanismi di upregulation. La desensitizzazione si attiva nei soggetti con dipendenza da stupefacenti.

Desensitizzazione e downregulation

La desensitizzazione prevede uno shutdown reversibile del sistema, la downregulation sopraggiunge con la persistenza anomala del segnale. A livello del recettore si ha il suo uptake in vescicole citosoliche, il numero di recettori sulla membrana quindi diminuisce. Questo uptake è facilmente reversibile. Se il segnale persiste la downregulation muove il recettore ai lisosomi per distruggerlo. Questi meccanismi prevedono la rimozione fisica del recettore. Altri meccanismi di desensitizzazione sono l’inattivazione del recettore o della proteina segnale. Un ulteriore meccanismo prevede la sintesi di proteine extra inibitrici.

Recettori connessi a proteine G

Il primo effettore è una proteina G. Sono detti recettori 7TM (7 transmembrane) o a serpentina. Sono recettori monomerici autonomi con l’N-terminale extracellulare lungo e il C-terminale citosolico. Il recettore attraversa per sette volte la membrana formando 3 loop esterni e 3 interni. I domini di membrana sono composti da aminoacidi idrofobici e si dispongono a cerchio. Il sito di interazione è dato dai loop esterni. I domini di membrana non presentano molta variabilità tra i diversi recettori. I loop citosolici attivano le proteine G e il terzo di essi assieme alla coda C-terminale è predisposto al contatto con la proteina G e per questo sono elementi molto variabili.

I principali ligandi sono:

• Neurotrasmettitori
• Fotoni
• Ormoni peptidici (FSH, TSH)
• Eicosanoidi: molecole legate a processi infiammatori con diffusione paracrina/autocrina

Sui loop interni ci sono residui che vengono fosforilati da chinasi regolatorie durante i fenomeni di desensitizzazione. La fosforilazione impedisce stericamente l’ingresso della proteina G.

Proteine G

Sono di due tipi: eterotrimeriche e Small G-Protein (disaccopiate)

• Eterotrimeriche: composte da catene α, β, γ tra loro diverse. Le subunità α e γ si legano alla membrana mentre la β è interna a queste due. Vengono classificate in base al tipo di subunità α (in totale circa 20 diverse)
  • α: contiene il dominio catalitico (GTPasico). Le regioni variabili sono le regioni responsabili dell’interazione col recettore e che interagiscono con l’effettore a valle.
  • β/γ: sono associate a dimero. Regolano α tenendola inattivata dato che trattengono GDP. Come dimero possono interagire con gli effettori (in questo caso la via si biforca).

Attivazione/Disattivazione

1. Il recettore è isolato dalla proteina G inattiva. La subunità α è legata al GDP e ha alta affinità per le altre due subunità.
2. Il ligando si lega al recettore.
3. Il recettore subisce una transizione conformazionale del 3° loop e della coda C-terminale.
4. La subunità α interagisce col recettore.
5. La tasca della subunità α libera il GDP subendo una modificazione conformazionale.
6. Ingresso del GTP.
7. Il sito di interazione di α si modifica, essa si distacca dalle altre due subunità.
8. α risulta affine alla proteina effettrice a valle.
9. La proteina effettrice si attiva e prosegue la via.
10. Idrolisi di GTP.
11. α-GDP torna a legarsi con le subunità βγ.

Le proteine G sono degli amplificatori del segnale perché all’interno di uno stesso ciclo il recettore può attivare diverse proteine G; esse possono inoltre attivare diverse proteine effettrici. Le proteine G passando dallo stato ON a OFF influiscono sulla cinetica della trasduzione. La proteina G può essere modulata dalle proteine GAP che interagendo con le subunità α accelerano l’idrolisi di GTP. Le proteine...