Biologia cellulare parte di citofluorimetria

Citometria a flusso

La citometria a flusso è una tecnica che si applica al monitoraggio di molti processi cellulari, quali appunto differenziamento, apoptosi e trasformazione tumorale, attraverso uno studio analitico di diversi parametri. La citometria a flusso è una tecnica fondamentale che ci consente di attuare un'analisi statistica molto accurata; infatti, ogni analisi è applicata a 10,000-20,000 cellule alla volta. È caratterizzata da una sospensione cellulare in un liquido isotonico che viene convogliato forzatamente a passare per un capillare che si restringe sempre più, fino a obbligare le cellule a passare in fila una alla volta per essere analizzate.

Sezione del citofluorimetro

Abbiamo una sezione del citofluorimetro, la parte viola è una camera attraverso la quale scorrono le cellule in sospensione e viene chiamata cella di flusso o fluss cell. Il punto di misurazione è il punto nel quale un laser indirizza il fascio di luce monocromatico (solo una λ) verso la singola cellula, la quale reagirà in diversi modi rifrangendo e rifrattendo la luce in diverso modo. Il citofluorimetro 488nm mono laser ad argon è il più utilizzato perché è in grado di stimolare la maggior parte dei fluorocromi usati. La cellula, in base alla modalità di luce riflessa e rifratta, dà indicazioni sulle sue caratteristiche fisiche ovvero: volume e densità (incompleto- e o complessità citoplasmatica della cellula, rugosità della stessa).

Parametri fisici

I parametri fisici sono:

• Le dimensioni della cellula (volume): Quando il raggio del laser colpisce la cellula, la luce viene difratta; questo fenomeno è detto Forward scatter (FS). L'intensità della luce difratta è proporzionale alla dimensione della cellula. Più una cellula è grande, più luce verrà captata dal Forward scatter detector e verrà quantificata e associata a quella particolare cellula. Il segnale analogico che viene generato dal fotone emesso dalla luce difratta dalla cellula viene convertito in un segnale digitale che è un segnale elettrico (misurabile con l’amperometro).
• La densità (rugosità e complessità citoplasmatica della cellula): È misurabile attraverso la riflessione della luce del laser sulla cellula di nostro interesse. A 90° (ortogonale) misuriamo il Side scatter (SS) proporzionale alla densità.

Immaginiamo che la cellula venga colpita da una luce monocromatica a 450 nm. A seguito di questa luce, viene prodotto il FS detector che fa una conversione attraverso algoritmi che comparano il segnale al volume della cellula. Se invece raccogliamo la luce riflessa con il SS, si converte il segnale in densità e complessità cellulare.

Fluorescenza dei fluorocromi

Oppure può essere misurata l'intensità di fluorescenza dei fluorocromi, molecole che quando vengono colpite da una frequenza d'onda si eccitano, ovvero passano da uno stato di riposo a uno eccitato e successivamente l'energia viene poi rilasciata sotto forma di fluorescenza. Parte di questa energia viene trasformata in calore, perciò l'energia del fotone incidente del fluorocromo è maggiore di quella del fotone che emerge dalla cellula dopo essere stata colpita. Questo, in termini di lunghezza d'onda e quindi di colore, significa che un fotone di lunghezza 2x quando esce dalla cellula sarà solo x, quindi magari colpiamo la cellula con una luce UV ma il fotone che emette è nel visibile UV 400/800 nanometri.

Rendere una cellula fluorescente

Per rendere fluorescente una cellula bisogna che il cromoforo sia all’interno della cellula, o attraverso un’espressione di proteine esogene come per esempio il GFP, che viene espresso da cellule trasfettate con un plasmide. Oppure attraverso cromofori che si legano a strutture cellulari come intercalanti al DNA o cromofori specifici per i mitocondri ecc. E infine con le tecniche di immunofluorescenza, ovvero utilizziamo anticorpi contro antigeni specifici all’interno, o sulla superficie cellulare, coniugati con cromofori.

• Nel caso in cui l’antigene per cui abbiamo l’anticorpo è presente, la cellula diventa VERDE (l’antigene è espresso nella cellula). Es. CD34+, CD14 ecc. sono espressi nel monitoraggio delle fasi cellulari.
• Si può anche verificare l’espressione di varie proteine, evitando di utilizzare metodiche meno costose, ma più lunghe e con bisogno maggiore di apporto cellulare come WB e E.L.I.S.A. Queste metodiche vengono utilizzare per antigeni nucleari che vengono detectati meglio con una lisi nucleo-citoplasma in WB rispetto a una citometria a flusso normale.

Tipi di immunofluorescenza

L'immunofluorescenza può essere:

• Fluorescenza indiretta: Si utilizza un anticorpo primario specifico per l’antigene da detectare, e un anticorpo secondario specifico per anticorpi di quella specie, ad esempio un mouse anti Human. (N.B. gli anticorpi monoclonali si ottengono da ibridomi in specie differenti da quello che vogliamo ottenere, es. anti human in topo, coniglio... ecc. anti mouse in uomo, coniglio ecc.) In ogni caso si fa un'aliquota di un anticorpo con un'aliquota di 10,000 cell e si lascia incubare per 30’, poi si fanno 10’ di lavaggi che asportano gli anticorpi non legati e poi si legge allo spettrofluorimetro.

Fluorocromi più utilizzati

Analisi grafica

Tipi di grafici

• Istogrammi: Tutte le volte che consideriamo solo un parametro per esempio la quantità del DNA. Rappresenta sull'asse delle x l'intensità di un fenomeno (es. PI), mentre sull’asse delle Y il numero degli eventi. Un altro esempio è l’espressione di un antigene. L’analisi citofluorimetrica è sempre un'analisi comparativa, analizzando la quantità di un determinato antigene rispetto ad un altro, non è una quantizzazione assoluta. Bisogna avere dei campioni di riferimento. Sana vs tumorale: l'antigene è più espresso rispetto a quella sana. Si forma un picco, più esso è spostato verso destra (scala log) più questo tipo cellulare esprimerà l’antigene di superficie. Usando dei marker possiamo quantizzare, dei gate di interesse che possiamo inserire per indicare al citofluorimetro di darci in n di cellule.
• Dot plot: Quando andiamo a considerare due parametri, ed FS o SS o due fluorocromo. L’espressione di due antigeni e la loro espressione relativa. Abbiamo fatto una marcatura sulla stessa popolazione sia di CD4 e CD8 e poi sempre il controllo negativo prima della lettura. Sappiamo che il CD8 è marcato con FICT e CD4PE, ci viene una fluorescenza rossa o verde che vengono rappresentate come punti su un grafico. I Gate si ottengono formando una croce in cui definiamo una zona di doppia negatività.

Citofluorimetria biparamentrica per l'analisi del DNA

Per l'analisi del DNA monitoriamo due parametri attraverso l'utilizzo di proteine fluorescenti, in questo caso:

• Bromodeossiuridina
• Propidio Ioduro

Questa analisi ci dà la possibilità di monitorare la fase S, ovvero la fase di sintesi in cui la bromodeossiuridina, analoga del DNA, viene incorporata al suo posto mentre si sta sintetizzando assieme alla quantità di DNA attraverso l’intercalazione di PI. L’associazione di questi due parametri ci permette di definire meglio la quantità di cellule nelle varie fasi cellulari e in particolare le cellule in fase S. Il grafico che otteniamo è un dot plot dove sull'asse delle x è quantificata l’intensità di PI, mentre sull’asse delle Y abbiamo l’intensità di fluorescenza della bromodeossiuridina. In grafico a punti poi viene diviso in 3 gate significativi.

Gate significativi

• Il primo ha una quantità di DNA diploide 2n dettato da un’intensità di PI di 200 ma è negativo per la bromodeossiuridina; in questo gate stanno le cellule che devono ancora replicare ovvero quelle in fase G0/G1.
• Il terzo gate ha una quantità di DNA pari a 4n dettato da un’intensità di PI di 400 e rappresenta la percentuale di cellule di G2/M, ovvero le cellule che hanno già replicato il DNA e perciò sono anch’esse negative alla bromodeossiuridina.
• Il secondo gate, invece, ha una quantità di PI intermedio tra 200 e 400, a seconda del punto di replicazione del DNA, e positività per la bromodeossiuridina in quanto nella 30’ a contatto con il fluorocromo stavano sintetizzando nuovo materiale genetico e hanno incorporato tale fluorocromo. Ovvero le cellule in fase S. Ovviamente il grafico indica le percentuali di cellule nelle varie fasi.

Studio dell'apoptosi

Un altro esempio di grafico biparamentrico è quello che riscontriamo durante l’apoptosi. In questo caso usiamo due cromofori che hanno diversa permeabilità cellulare: il PI e Hoechst.

• Le cellule vive sono impermeabili ad entrambi i cromofori.
• Le cellule apoptotiche sono permeabili al Hoechst, ma non al PI.
• Le cellule morte sono permeabili ad entrambi.

In questo modo possiamo suddividere la nostra popolazione cellulare. La citometria a flusso viene applicata sia per separare le cellule sia nelle tecniche di immunofenotipizzazione e sia per lo studio delle varie attività cellulari come proliferazione, differenziamento, apoptosi e trasformazione tumorale.

Separazione con il FACS

Un citofluorimetro particolarmente equipaggiato è il FACS, che permette di analizzare sia le cellule che quantizzare la fluorescenza emessa da diversi tipi cellulari e in base a queste di separarle. Questo strumento permette la separazione di diversi tipi cellulari in base alla fluorescenza; l’analizzatore è simile al citofluorimetro, tuttavia il modulo sottostante permette la separazione della popolazione in due contenitori differenti.

Quando parliamo di culture cellulari parliamo di linee cellulari formate da cellule omogenee, tuttavia per ottenere queste linee occorre partire da culture primarie eterogenee, ad esempio una cultura di cellule staminali emopoietiche derivanti dal sangue, oppure una cultura di cellule epiteliali derivanti da una biopsia. Le cellule sono molto eterogenee tra di loro, se vogliamo studiarne solo un tipo molto raro all’interno di un tessuto, come per esempio le cellule staminali, è necessario utilizzare un metodo di separazione di questo tipo, sfruttando l’espressione differenziale di un marker di superficie che conosciamo. Un esempio è la presenza di CD34+ nelle cellule staminali emopoietiche, ma non presente sulle cellule già differenziate.

Criteri di separazione

La separazione avviene quando le cellule sospese in un liquido, che scorre all’interno del flusso laminare continuo, a un certo punto, viene interrotto attraverso dei dispositivi (cristallo piezoelettrico) che trasmettono una vibrazione al sistema che causa la formazione di gocce singole con all’interno una singola cellula da analizzare. Il punto dall'analisi al laser all'ultima goccia attaccata viene detto delay e questo deve rimanere costante per tutta l’analisi (t 25°C). Ogni goccia poi viene caricata negativamente o positivamente a seconda dell’equazione di sorting che abbiamo inserito precedentemente grazie a una carica di 3kV. La goccia caricata poi passa attraverso due elettrodi che guideranno a seconda della carica la goccia nel contenitore giusto.

Espressione differenziale di fluorescenza

La fluorescenza superficiale si ha quando incubiamo le cellule con anticorpi anti marker di membrana specifici coniugati con fluorocromo. La fluorescenza intracellulare si ha quando l’antigene è all’interno della cellula; per questo motivo prima di incubare la cultura cellulare con anticorpo, occorre trattare la cultura con sostanze permeabilizzanti. Ad esempio, marcando una ciclina o un fattore di trascrizione.

• Immunofenotipizzazione cellulare in fluorescenza intracellulare: È dovuta alla trasfezione con vettori codificanti per proteine fluorescenti (GFP) o colorazione di DNA o organuli cellulari con proteine fluorescenti come PI, DAPI ecc.
• L’espressione differenziale per fluorescenza è uno dei criteri più importanti: possiamo separare le cellule per espressione differenziale di marker di superficie o marker intracellulari, possiamo separare le cellule trasfettate che esprimono GFP da quelle contrasfettate senza GFP. Possiamo separare le cellule in base alla percentuale di DNA con colorazione per PI o in base a SF e SS.

Il FACS è una macchina molto complessa in quanto richiede una tecnica molto elevata perciò non viene utilizzata da tutti, ma occorre un tecnico specializzato. Tuttavia, come strumento ha una bassa resa, circa il 50%; infatti, su una cultura di 2,000,000 cellule se ne ottengono circa 1,000,000. Anche se la resa è molto bassa, abbiamo una purificazione elevata, circa il 90-95%. Più il campione da sortare è piccolo, maggiore sarà il tempo che impiegherà lo strumento per trovarlo.

Possibilità di sorting

• Possiamo sortare per antigeni specifici come maker emopoietici, ne è un esempio il CD14 dei monociti. Tuttavia, prima di mettere l’intera cultura nel FACS, possiamo utilizzare separazione isotipiche con Ficoll sul sangue periferico in modo da ottenere soltanto l’anello delle mononucleate. Una volta estratto, bisogna separare i monociti dai linfociti utilizzando il FACS.
• Possiamo sortare le cellule staminali emopoietiche CD34+.
• Possiamo analizzare cellule trasfettare con vettori codificanti proteine fluorescenti come il GFP. In questo caso abbiamo trasfettato la nostra cultura cellulare con un plasmide contenente il gene da overesprimere di interesse in tandem o in fusione con il GFP in un unico plasmide. Le cellule che hanno incorporato il nostro gene appariranno fluorescenti, mentre quelle non trasfettate no. Occorre fare un'analisi al citofluorimetro per dare un'idea dell’efficienza di trasfezione, otteniamo un grafico biparametrico con l’intensità di GFP sulle x e sulle Y il SS. In questa figura vediamo tre cumuli cellulari:

1. Gate M: Abbiamo un 69% di cellule non trasfettate (sono nella prima decade, uguale al controllo negativo).
2. Gate N: Abbiamo un 18,7% di cellule che sono state trasfettate e che esprimono moderatamente il GFP.
3. Gate L: Abbiamo un 8,6% di cellule trasfettate che esprimono con elevata intensità il GFP, perciò hanno più plasmidi per cellula.

La trasfezione ha un’efficienza del 80%; per fare studi accurati occorre avere una cultura pura solo di cellule trasfettare, per questo usiamo il FACS. Dopo aver separato la nostra cultura d’interesse, rianalizziamo con il citofluorimetro.