Biologia cellulare parte di citofluorimetria

CRITERI DI SEPARAZIONE

L’espressione differenziale di fluorescenza

La fluorescenza superficiale si ha quando incubiamo le cellule con anticorpi anti maker di

membrana specifici coniugati con fluorocromo.

La fluorescenza intracellulare si ha quando antigene è all’interno della cellula, per questo motivo

prima di incubare la cultura cellulare con anticorpo, occorre trattare la cultura con sostanze

permeabilizzanti. Ad esempio marcando una ciclina o un fattore di trascrizione.

A. L’immunofenotipizzazione cellulare in fluorescenza intracellulari è dovuta alla trasfezione

con vettori codificanti per proteine fluorescenti (GFP) o colorazione di DNA o organuli

cellulari con proteine fluorescenti come PI, DAPI ecc.

B. L’espressione differenziale per fluorescenza è uno dei criteri più importanti possiamo

separare le cellule per espressione differenziale di marker di superficie o marker

intracellulari, possiamo separare le cellule trasfettate che esprimono GFP da quelle con

trasfettate senza GFP. Possiamo separare le cellule in base alla percentuale di DNA con

colorazione per PI o In base a SF e SS.

Il FACS è una macchina molto complessa in quanto richiede una tecnica molto elevata perciò non

viene utilizzata da tutti, ma occorre un tecnico specializzato.

Tuttavia come strumento ha una bassa resa, circa il 50% infatti su una cultura di 2000000 cellule

se ne ottengono circa 1000000. Anche se la resa è molto bassa, abbiamo una purificazione

elevata circa IL 90-95%. Più il campione da sortare

è piccolo maggiore sarà il tempo che impiegherà lo

strumento per trovarlo.

A. Possiamo sortare per antigeni specifici come

maker emopoietici, ne è un esempio il CD14

dei monociti. Tuttavia prima di mettere l’intera

cultura nel FACS, possiamo utilizzare

separazione isotipiche con ficoll sul sangue

periferico in modo da ottenere soltanto l’anello

delle mononucleate. Una volta estratto,

bisogna separare i monociti dai linfociti

utilizzando il FACS.

B. Possiamo sortare le cellulle staminali emopoietiche CD34+

C. Possiamo analizzare cellule trasfettare con vettori codificanti proteine fluorescenti come il

GFP. In questo caso abbiamo trasfettato la nostra cultura cellulare con un plasmide

contendente il gene da overesprimere di interesse in tandem o in fusione con il GFP in un

unico plasmide. Le cellule che hanno incorporato il nostro gene appariranno fluorescenti,

mentre quelle non trasfettate no. Occorre fare un analisi al citofluorimetro per dare un idea

dell’efficienza di trasfezione, otteniamo un grafico biparametrico con l’intensità di GFP sulle x

e sulle Y il SS. In questa figura vediamo tre cumoli cellulari:

1. Gate M : abbiamo un 69% di cellule non

trasfettate (sono nella prima decade, uguale al

controllo negativo)

2. Gate N: abbiamo un 18,7% di cellule sono state

trasfettate e che esprimono moderatamente il

GFP.

3. Gate L abbiamo un 8,6%

di cellule trasfettate che

esprimono con elevata

intensità il GFP, perciò hanno più plasmidi per cellula.

La trasfezione ha un efficienza del 80%, per fare studi accurati occorre

avere una cultura pura solo di cellule trasfettare, per questo usiamo il FACS.

Dopo aver separato la nostra cultura d’interesse rianalizzammo con il

citofluorimetro. Si nota un arricchimento in purezza del Gate L, ovvero

quello che ci interessa. SEPARAZIONE CON IL MACS

Il MACS utilizza lo stesso principio del FACS, ma utilizza il magnetismo invece che le cariche

elettriche. Tuttavia questo strumento non si può utilizzare per antigeni intracellulari, ma solo per

antigeni di membrana. Come nel FACS abbiamo bassa resa me elevata purezza. Abbiamo un

magnete con all’interno una colonna costituita da una matrice in lama di acciaio. Per detectare

l’antigene utilizziamo anticorpi coniugati con biglie di ossido di ferro ovvero micro particelle

magnetiche che poi si degradano dopo qualche giorno. L’antigene viene legato al anticorpo il quale

rimane ancorato alla matrice, mentre tutto il resto passa.

Separa le cellule attraverso il magnetismo, perciò utilizziamo anticorpi coniugati a micro particelle

magnetiche.

Si può fare sia una marcatura diretta che indiretta.

• Nella marcatura diretta abbiamo a disposizione l’anticorpo primario complementare con

l’antigene già coniugato con la biglia immunomagnetica. Questa tecnica richiede uno step

di marcatura per l’anticorpo specifico nel quale l’anticorpo viene messo a contatto con la

cultura da detectare per circa 30’, poi avvengono i lavaggi per togliere l’anticorpo non

legato e quinti in fine si procede con l’analisi al MACS.

• Nella marcatura indiretta invece non abbiamo a disposizione l’anticorpo specifico

coniugato, perciò viene utilizzato un normale anticorpo specifico contro l’antigene che poi

viene legato secondariamente al anticorpo secondario coniugato con la biglia

immunomagnetica. Il riconoscimento tra l’anticorpo primario e il secondario può essere di

diverso tipo:

Anticorpo primario -Anticorpo secondario antiglobulina

o Anticorpo primario con biotina- anticorpo secondario con strepavidina

o Anticorpo primario con fluorocromo- anticorpo secondario antifluorocromo.

o

La selezione può essere:

• POSITIVA: è la più utilizzata e quella con maggior resa, prevede che il targhet cellulare

venga marcato e venga selezionato positivamente. Es. vogliamo le staminali emopoietiche,

marchiamo il CD34+, le cellule che rimangono sulla membrana sono quelle di interesse.

(La selezione positiva si fa quando conosciamo il marker)

• NEGATIVA O DEPLETTIVA : in questo caso vengono marcate tutte le cellule tranne quelle

d’interesse, perciò la porzione che vogliamo è quella che non rimane legata alla

membrana. Si utilizza quando il targhet è poco rappresentato rispetto al totale. Es. 0,5%

(poi eventualmente si fa una selezione positiva ).

PROBLEMATICHE

A. L’anticorpo può stimolare la cellula attivano una pathway metabolica. Es. il recettore CD14

dei monociti attiva il differenziamento macrofagico.

B. Il buffer e le reazione enzimatiche successive devono tener conto della presenza elevata di

ossido di ferro. È possibile staccare le biglie attraverso lavaggi con fenolo cloroformio.

Esempio di estrazione di cellule del sangue di cui non conosciamo l’antigene specifico

Per isolare queste cellule, dobbiamo fare diversi step.

1. Fare una separazione con ficoll per ottenere i vari anelli con i tipi cellulari.

2. Per ottenere i granulociti eosinofile e neutrofili, bisogna lavorare sul pellet.

3. Nel pellet oltre alle cellule d’interesse vi sono anche gli eritrociti agglutinati sul fondo per

aggiunta di sodio metrilzoato. Per eliminarli, occorre risospendere il pellet in un buffer

leggermente isotonico che attua una lisi differenziale solamente per gli eritrociti.

4. Per separare eosinofili e neutrofili operiamo con il MACS attraverso il targhet CD16

espresso solo dai neutrofili.

Deplezione dei fibroblasti

Molte culture cellulari hanno bisogno per crescere del feerlayer 3T3, tuttavia per studiare la nostra

cultura, occorre separare le nostre cellule dai fibro. Utilizziamo antigeni anti

fibroblasti per fare una deplezione al MACS. Prima di procedere con la separazione,

andalizziamo al citofluorimetro in biparamentrica con due marcature:

• Anti fibroblasti

• Anti EpCAM (molecola di adesione dei cheratinociti)

Nella prima figura osserviamo un gran contaminazione di fibroblasti, a questo punto

separiamo con il MACS con anti fibroblasti attraverso una selezione negativa e poi

controlliamo nuovamente al citofluorimetro la purezza della separazione.

Isolamento dei granulociti basofili

I granulociti basofili risiedono nell’anello delle mononucleate dopo separazione fisica con ficoll. Per

ottenere soltanto le cellule d’interesse si fa una deplezione di tutte le cellule contaminati con la

combinazione di più anticorpi.

SEPARAZIONE CON BIGLIEIMMUNOMAGNETICHE

A differenza delle altre, queste sono biglie di ferro della grandezza di qualche micron

e non degradabili. In questa tecnica occorre una strumentazione diversa,

caratterizzata da una provetta di plastica con all’interno le nostre cellule marcate con

anticorpi coniugati a biglie immunomagnetiche e un alloggio avente un magnete.

Una volta inserita la provetta, le cellule marcate andranno ad aderire alla parete e

noi possiamo togliere il surnatante contenete tutto quello che non ci interessa, una

volta fatti diversi lavaggi sollevando la provetta rimarranno all’interno solo le cellule

d’interesse.

CROMATOGRAFIA PER AFFINITÀ

Abbiamo anche in questo caso un antigene di superficie che viene legato ad un anticorpo

coniugato con Biotina. La nostra cultura una volta marcata viene fatta bassare attraverso una

colonnina con una metrice coniugata con strepavidina. Le cellule marcate potitivamente rimangono

ancorate.

Coniugazione in situ con anticorpi: In questo caso abbiamo una piastra multipozzetto che ha sul

sondo anticorpi specifici per la cellula da isolare.

ELETTROFORESI per cellule del tubolo renale e Terreni selettivi abbianati ad anticorpi.

STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE

CELLULARE

1. La Conta cellulare ci dà un idea di quanto aumenta la nostra popolazione.

La conta cellulare è un esempio classico di metodo di analisi statico, infatti ci dice quando una

popolazione cellulare è cresciuta, ma non se in questo momento le cellule sono ancora in

divisione. Per capire quante cellule stanno proliferando occorre misurare il tempo di

raddoppiamento facendo conte sequenziali. Le cellule vengono poste sulla camera di bunker e

colorate con coloranti che mi evidenziano il nucleo.

2. Indice mitotico. Percentuale delle cellule che si trovano in mitosi su 1000 cellule contate

3

3. AUTORADIOGRAFIA CON H TIMINA: analogamente alla bromodeossiuridina, inserisco

un isotopo radioattivo per la timina. Essa verrà incorporata nelle cellule che si trovano in

fase S.

Si incubano le cellule in una base radioattiva e si determina:

• LABELING INDEX (LI) ovvero la percentuale di cellule in fase S. per 30’

• Frazione di crescita ovvero la percentuale di cellule che stanno proliferando. (Durata di un

ciclo cellulare)

L’autoradiografia è una fissazione con emulsioni fotografica che viene impressionata e fa

3

precipitare i granuli d’argento presenti nelle cellule che hanno incorporato la timina H .

Viene applicata solitamente ai tumori solidi. I tumori hanno un attività proliferativa deregolata in

eccesso in cellule indifferenziate impossibilitate ad andare in apoptosi. Perciò si ha un Li molto

elevato. TECNICHE DI CITOFLUORIMETRIA

MONOPARAMETRICA

1. Utilizziamo un cromoforo intercalante aspecifico al DNA chiamato PROPIDIO IOD