Biochimica speciale - Appunti

Biochimica speciale: stress ossidativo

Il termine ROS sta per reactive oxygen species, cioè specie reattive dell’ossigeno. L'ossigeno di per sé non è dannoso perché in forma di tripletto. Ha una struttura radicalica con due elettroni di valenza in due orbitali separati, quindi con spin parallelo. Nella forma molecolare questi elettroni hanno tutti lo stesso spin. Può essere attivato e reso reattivo quando gli si aggiungono degli elettroni.

I principali ROS

• Anione superossido (O₂-): è stato aggiunto un elettrone
• Ione perossido (O₂^2-)
• Perossido di idrogeno (H₂O₂): è un ROS ma non un radicale
• Radicale ossile (OH°) (anche detto radicale ossidrile): esso non ha carica, infatti deriva dalla rottura omolitica dell'acqua (viene rimosso un atomo di H dall'acqua con il suo elettrone). Questo radicale è utilizzato dalla radioterapia, che sfrutta i raggi X per generare radicali idrossili (l'acqua è sempre presente in tutti i tessuti).

I ROS possiamo dividerli in:

• Specie radicaliche
• Specie non radicaliche ma che hanno comunque potere ossidante

Possiamo anche avere i RNS, ovvero le specie radicaliche dell'azoto (anche se in realtà anche qui c'è sempre un ossigeno). Tra le specie radicaliche abbiamo il radicale idrossile e l'anione superossido. L'anione superossido ha emivita di 1 microsecondo, mentre il radicale idrossile ha un'emivita di 1 nanosecondo. Poi abbiamo anche composti come il radicale alcossile RO°, oppure un radicale perossile ROO° (processo di rottura delle catene idrocarburiche degli acidi grassi), può essere un radicale metile R°, derivato da una rottura omolitica di una molecola di metano con rilascio di H radicalico, poi abbiamo l'ossido nitrico NO° (ha un'emivita di 1 secondo che gli consente di viaggiare molto rispetto al punto di origine).

Composti non radicalici

Tra i composti non radicalici abbiamo il perossido di idrogeno (emivita fino a delle ore); possiamo avere perossidi organici R-O-O-H, o composti come gli acidi ipoalosi. Ipoaloso si riferisce a tutti gli acidi che contengono alogeni (es. l'acido ipocloroso che dissociando diventa ipoclorito, è stato scoperto come disinfettante con la varechina e funge da agente killer nei confronti dei batteri). Possiamo avere anche delle clorammine, cioè ammine in cui l'azoto è legato al cloro (es. la taurina è un composto prodotto dai globuli bianchi ad azione antibatterica).

Ossigeno singoletto

L'ossigeno singoletto si forma quando i due elettroni spaiati hanno spin opposti; è una forma di ossigeno molecolare più instabile e si forma per azione di raggi UV. Ad esempio, nelle porfirine (come la IX) esse assorbono la luce e la trasferiscono sull'ossigeno e fanno sì che questo si trasformi in singoletto. Esso ha azione ossidante, per cui ha azione tossica. C'è infine il perossido di nitrito (ONOO^-).

I ROS possono avere sia azione positiva perché aiutano a combattere i processi infettivi, ma sono alla base anche di molte patologie come i tumori e le malattie cardiovascolari.

Reazioni tra ROS

• Due anioni superossido possono reagire in presenza di due protoni formando acqua ossigenata (H₂O₂) e ossigeno molecolare; non si ha eliminazione del ROS ma si ha la sua trasformazione in una forma meno tossica. La reazione è catalizzata dalla superossido dismutasi:
  2O₂^- + 2H⁺ → H₂O₂ + O₂
• Se invece due molecole di acqua ossigenata reagiscono si ha la formazione di acqua e ossigeno molecolare, qui con eliminazione di ROS. La reazione è catalizzata dalla catalasi oppure dalla glutatione perossidasi (GSH):
  H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂

Raggi X e raggi gamma devono la loro tossicità alla radiolisi, cioè lisi omolitica di un legame covalente dell'acqua in radicale ossidrile e atomi di idrogeno.
H₂O → OH° + H° (radiolisi).

Reazione di Fenton

Conversione dell'acqua ossigenata in radicale idrossile: la rottura dell'acqua ossigenata avviene a livello dei due O con l'aggiunta di un elettrone da parte dell'ossidazione di una atomo di Fe²⁺ a Fe³⁺ e formazione di uno ione idrossile OH^-, un radicale idrossile OH° e formazione di Fe³⁺. Questa è detta reazione di Fenton:
Fe²⁺ + H₂O₂ → OH° + OH^- + Fe³⁺.

Al posto del ferro si può avere l'anione superossido che cede l'elettrone, e questa reazione è detta di Haber-Weiss:
O₂^- + H₂O₂ → OH° + OH^- + Fe³⁺.

Il ferro è molto presente nel nostro organismo (4-5 grammi), però anche il rame può innescare una reazione di Fenton. Anche il rame può causarla. La conversione di ossigeno tripletto in singoletto avviene grazie alle porfirine (che solitamente sono poche, se aumentano c'è un difetto di sintesi della porfirina IX) catturano l'energia radiante (raggi UV) e la trasferiscono sull'ossigeno causando l'inversione di spin di uno degli elettroni spaiati:
Porfirine + O₂ → porfirine + O₂ (fotolisi).

L'ossigeno singoletto è più reattivo, tende a regire con altre molecole biologiche, ed è un ROS.

Il monossido d'azoto

Il monossido d'azoto è incredibilmente polimorfo come comportamento: se prodotto in quantità elevate, soprattutto se prodotto in condizioni di infiammazione, è prodotto con i ROS: si forma perossinitrito (questo può fare un percorso più lungo, che può attraversare tutto lo spessore di una cellula) che può legare un protone diventando acido perossinitroso che tende a rompersi in due radicali, il diossido d'azoto e il radicale idrossile. Questi due una volta rilasciati hanno effetti tossici su altre molecole.

L'acqua ossigenata può reagire con il cloruro, e si forma acqua più ipoclorito catalizzata dalla mieloperossidasi.

Come si generano i ROS?

• Il mitocondrio stesso può formare ROS: una quota di ossigeno nella catena respiratoria può andare a collidere con il complesso secondo (succinato deidrogenasi) che converte l'ossigeno in anione superossido. Anche l'ubichinone può cedere elettroni all'ossigeno. Questo è normale e fisiologico, poiché il mitocondrio ha enzimi per la conversione dei ROS. Ma in quantità elevate hanno effetto dannoso.
• Un altro fornitore di ROS è la NADPH ossidasi (NOX): presenti in molti tessuti, genera anioni superossido per combattere i batteri (azione disinfettante).
• Perossidasi (come la glutatione perossidasi che a volte possono produrre dei ROS, e tra cui vi è anche la mieloperossidasi).
• Xantina ossidasi: produce acqua ossigenata e ione superossido.
• NO sintasi: l'NO deriva dall'arginina, ma se manca l'arginina la NO sintasi può produrre ROS.
• Emoproteine: può cedere elettroni all'ossigeno stesso (per la continua oscillazione tra ferro ferroso o ferrico).
• Ciclossigenasi e lipossigenasi.

L'anione superossido generato può danneggiare il DNA mitocondriale (se prodotto nel mitocondrio) perché non ha gli stessi enzimi riparatori del DNA normale. In molte patologie neurodegenerative, hanno alla loro base una disfunzione mitocondriale alla cui base corrisponde un’aumentata produzione di ROS.

Enzimi protettivi dei mitocondri

Vi è una superossido dismutasi che converte in acqua ossigenata due anioni superossido, vi è una catalasi mitocondriale, e una glutatione perossidasi mitocondriale.

Come aumenta la produzione di ROS?

Vi è un eccesso di NADH, e magari carenza relativa di ossigeno (ipossia e ischemia tissutale) è facile che l'ossigeno possa interagire con altri complessi e venire ridotto (non viene ridotto velocemente).

Superossido dismutasi

In seguito a riperfusione dopo un'ischemia (quindi in condizioni particolari) si possono formare dei ROS. La SOD mitocondriale ha quindi il compito di convertire l'anione superossido in acqua ossigenata. Poi altri enzimi come la catalasi e la perossidasi la ridurranno ad acqua. È importante proteggere i mitocondri in quanto in essi è contenuto DNA mitocondriale, che non possiede enzimi riparatori, per cui è prono alle mutazioni che i ROS possono causare (alla base dell'invecchiamento ci sono i danni al DNA mitocondriale).

Vi sono tre isoforme:

• Una mitocondriale (come cofattori 3 atomi di Manganese)
• Una citoplasmatica (come cofattori rame e zinco)
• Una extracellulare (legata alla superficie esterna della membrana con catene saccaridiche (come per la LPL legata all'endotelio con eparansolfato))

Perché dismutasi? Convertono due molecole di anione superossido in una molecola di acqua ossigenata e O₂. Tutte e tre le isoforme sono inducibili, da due fattori in particolare:

• Aumentata produzione di ROS (autopromozione)
• Processo infiammatorio che vede coinvolti i ROS

Inoltre è stata osservata una disfunzione della SOD citosolica nel 20% dei casi di SLA: di è osservata una disfunzione di SOD nei neuroni di questi soggetti. Probabilmente in questi soggetti la disfunzione di SOD permette una più alta probabilità di danni ossidativi (patologia ereditaria in questi casi e non dovuta a fattori ambientali).

Catalasi

Un altro enzima importante è la catalasi, che converte due molecole d'acqua ossigenata in acqua e ossigeno:
H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂. È un'emoproteina, ovvero porta un gruppo eme che utilizza per trasferire gli elettroni sulle molecole di acqua ossigenata. Ci sono altri enzimi con lo stesso compito (si vive infatti anche senza catalasi).

Perossidasi

Poi abbiamo le perossidasi (l'acqua ossigenata è infatti un perossido). Il vantaggio delle perossidasi è che oltre a svolgere lo stesso ruolo delle catalasi, fanno anche due reazioni in più:

• Convertono perossidi in alcoli + acqua:
  ROOH + XH → ROH + H₂O + X
• Convertono perossidi in due alcoli:
  ROOH + XH → ROH + ROH + X

Nel frattempo, l'agente riducente si è ridotto. Il riducente più importante è il glutatione, grazie all’azione come cofattore nella glutatione perossidasi; possono essere usate anche altre molecole come l'acido ascorbico o il citocromo C. La GSH Perossidasi ha nel suo sito attivo una selenocisteina (che deriva da una serina dove il gruppo OH è stato sostituito con un atomo di selenio). Una carenza di selenio (anche se impossibile con la nostra alimentazione) può tradursi in ridotta capacità di conversione dei perossidi in alcoli e acqua.

Mieloperossidasi

Ne sono molto ricchi i globuli bianchi. Fa reagire una acqua ossigenata con l'anione cloruro formando ipoclorito:
H₂O₂ + Cl^- → ClO^- + H₂O. Da ricordare sono le proprietà igienizzanti dell'ipoclorito (prodotto dai nostri globuli bianchi).

NADPH ossidasi (NOX)

Sembra coinvolto in molti processi fisiologici e patologici. Enzima che trasferisce un elettrone su una molecola di O₂. Una molecola di NADH porta due elettroni, per cui ognuno va a ridurre una molecola di ossigeno molecolare formando due anioni superossido:
2 O₂ + NADPH → 2 O₂° + NADP⁺ + H⁺.

Xantina ossidasi

Utilizza l'ossigeno per produrre H₂O₂. In situazioni come la riperfusione post-ischemica.

NO sintasi

L'NO è prodotto dalle nostre cellule, in seguito a stimolazione da acetilcolina. In particolare nel primo esperimento in cui è stato scoperto si è capito che l'acetilcolina causa un rilascio di una sostanza a livello delle cellule endoteliali che permette il rilassamento delle fibre muscolari. Loro l'hanno chiamato EDRF (Fattore di Rilassamento Derivato dall'Endotelio). In realtà era il NO. Il NO si forma per azione della NO SINTASI che causa una asportazione dell'azoto amidico della Arginina e la trasforma in citrullina (Ciclo Urea) con rilascio di monossido di azoto. Come cofattori per la reazione servono ossigeno e NADPH. Ma il NO ha altre funzioni:

• Vasodilatazione e rilassamento della muscolatura liscia
• È un importante neurotrasmettitore → Sconvolte le credenze su cos'è un neurotrasmettitore (NO infatti è un gas). Viene prodotto al momento dall'arginina e si diffonde a 360 gradi. È coinvolto nei processi della memoria (rafforzamento del ricordo correlato al rilascio di NO)
• Prodotto dai globuli bianchi partecipa all'uccisione dei batteri
• Inoltre inibisce l'aggregazione piastrinica (e la formazione di ateroma)

Ci sono tre isoforme della NO SINTASI:

1. Neuronale costitutiva (nNOS, NOS I)
2. Inducibile (iNOS, NOS II): isolata nei macrofagi
3. Endoteliale costitutiva (eNOS, NOS III)

In realtà sono termini vecchi e le troviamo un po' in tutti i tessuti. NOS è enzima complicato con molti cofattori:

• NADH
• Heme
• FAD
• Sito attivo per Arginina
• FMN
• Sito regolatore per calmodulina
• BH₄ (tetrabiopterina)

Le due forme costitutive (neuronale e endoteliale) vengono indicate come calciodipendenti, perché venivano attivate quando aumentava il calcio. Il calcio si lega alla calmodulina, che va a legarsi alla NOS e la attiva e accelera la conversione di arginina in citrullina + NO. Quando arriva l'acetilcolina nelle cellule muscolari e il glutammato in quelle neuronali si attiva una cascata di segnale che porta all'apertura sia dei canali del calcio del reticolo endoplasmatico che di quelli che lo fanno entrare dall'esterno. In questo modo si ha attivazione di NOS costitutiva.

iNOS viene detta inducibile perché non basta la regolazione allosterica del calcio (perché normalmente c'è poco enzima nella cellula, ma vi deve essere la sintesi di nuove proteine che aumentino la sua attività), e per questo è calcio indipendente. Gli stimoli questa volta possono essere varie citochine: interleuchina 1, interferone gamma, Tumor Necrosis Factor (TNF). Anche il lipopolisaccaride batterico induce la produzione di NO. Per arrivare alla produzione massimale di NO occorrono 6-24 ore, e ciò è utile per le cellule del sistema immunitario. In condizioni di ischemia (ridotto apporto di ossigeno), viene prodotto molto più NO dai neuroni, causando il fenomeno dell'eccitotossicità.

Come agisce il NO?

Il bersaglio del NO è la Guanilato Ciclasi solubile, che forma il cGMP a partire da GTP. L'NO interagisce con il gruppo eme della guanilato Ciclasi (può farlo come l'O₂). A questo punto il Fe dell'eme della Guanilato Ciclasi si sposta un po' e determina un cambiamento di conformazione di tutta la proteina che si traduce in un aumento di attività. Quindi viene prodotto più cGMP che attiva la proteina cinasi G (PKG):

• Fosforila la catena leggera della miosina che non si può più legare all'actina
• Fosforila i canali del calcio determinandone una minore uscita di calcio

Effetto finale: vasodilatazione

NO in eccesso:

• Può legarsi all'eme dell'emoglobina ed è dannoso o anche con l'eme dei citocromi (si blocca la respirazione)
• Interagisce col Fe dei centri Fe-S
• Blocca l'aconitasi (che ha un centro Fe-S) bloccando il ciclo di Krebs
• Inibisce la proliferazione cellulare

Danni a molecole biologiche dei ROS

Danno ossidativo al DNA

Possono interagire con la Guanina e causano la comparsa di un atomo di ossigeno in posizione 8, creando la 8-chetoguanina (GO). Se in una coppia CG la G viene sostituita da una GO, alla duplicazione successiva alla GO si potrà legare una Adenina. Alla replicazione successiva alla adenina si legherà una Timina, determinando la sostituzione della coppia CG con AT → Trasversione (si sostituisce una purina con una pirimidina e viceversa). C'è un enzima che ripara la GO riportandola a G normale.

Lipoperossidazione delle proteine

Danno a carico dei lipidi, in particolare delle catene idrocarburiche insature. In presenza di radicale libero H°, esso estrae un elettrone dalla catena dell'acido e si satura, ma si lega sulla catena. Ora si ha un riarrangiamento dei doppi legami, con formazione di legami coniugati (doppi legami alternati a un singolo). Ora questo elettrone spaiato, attira su di se una molecola di O₂, che porta alla formazione di un radicale perossile, che può interagire con un idrogeno radicalico formando lipoperossido (gruppo –COOH, con in due atomi di ossigeno legati tra di loro). L'inserimento di questo ossigeno rende la molecola più instabile e si può avere la rottura della catena (si formano dei buchi sulla membrana) con formazione di sostanze tossiche, come la malonilaldeide e la 4-idrossinonenale. La malonilaldeide è come un acido malonico ma con due gruppi aldeidici. Questi possono legarsi ai gruppi amminici di una stessa proteina o di due proteine diverse intaccandone le funzionalità. Il 4-idrossinonenale anche lui altera la normale funzionalità delle proteine.

Ossidazione delle proteine

Se una proteina ha gruppi SH adiacenti, un agente ossidante può causare la formazione di ponti disolfuro, generando dei polimeri di proteine che alterano le funzionalità. Inoltre, molti altri aminoacidi possono essere alterati modificando la funzionalità della proteina (nel breve termine almeno, perché poi la proteina viene sostituita). Possono essere ossidate anche le catene glicidiche che legano gli antigeni alle cellule. Se succede, si ha la formazione di un nuovo antigene in pratica, perché quello di prima.