Biochimica speciale

La catalisi enzimatica e i modelli di interazione

Nell'esempio della serino proteasi avevamo 3 amminoacidi, nel lisozima ci sono 6 amminoacidi che partecipano alla catalisi. Il sito catalitico generalmente contiene delle catene (o gruppi funzionali) molto comuni, che riescono a entrare nei meccanismi di reazione (-OH, -NH, -COO, ecc) bloccando il substrato nella posizione e conformazione necessaria, e sono coinvolti proprio nel meccanismo di catalisi.

Ci sono 2 modelli/teorie per cui si riesce a raggruppare/spiegare le catalisi enzimatiche:

1. Lock and key model (chiave-serratura): rigido ma molto efficace su alcune famiglie di enzimi. Si assume che l'enzima e il substrato abbiano già la conformazione giusta per poter interagire e produrre un urto efficace, tutto già preformato e perfettamente funzionale.
2. Induced fit: il sito catalitico è quasi preformato e il substrato pure, non sono rigidi ma possono riaggiustarsi entrambi per dare luogo al riconoscimento finale.

A noi servirà misurare la...

capacità/attività di un enzima, stabilirne la concentrazione, ecc

Se andiamo a vedere fosfatasi alcalina dobbiamo valutare tutti i parametri (pH, tampone, ec fatti in precedenza)

Quali sono le unità di misura dell'attività di un enzima? Come è definita attività di un enzima?

La concentrazione si stabilisce solo in un modo indiretto, tramite cinetica enzimatica; era storicamente utilizzato un metodo in cui si definiva l'unità di attività, cioè quanto substrato veniva fatto reagire dall'enzima→veniva misurata l'attività, non il numero di molecole, quanto efficace era la reazione→difficoltà se si vogliono confrontare enzimi (xk due enzimi diversi, substrati diversi, parametri diversi, ecc..)→Si parla quindi di unità di attività, e sono unità rapportate in un certo volume (guardare sempre kit) anche sec'è unità internazionale U,

rapportata per Litro o per Kilo (unità per litro o per kilo) → ma quando Unità di substrato è un polimero (amido con tantissime unità) questo impatta su valore ottenuto perciò l'Unità in questo caso è espressa per micromoli al minuto del prodotto: (Formula che permette di passare da Katal a U)

Dobbiamo utilizzare l'enzima per trovare le conc di enzima o l'enzima per trovare le conc del substrato; per capire meglio il tutto dobbiamo fare un passo indietro:

Cinetica di reazione Una reazione chimica è fatta da specie A che diventa specie B, e c'è una certa velocità in questa reazione (k1 e k-1), k minuscola indica costante cinetica (K maiuscola è costante termodinamica, di equilibrio)

La velocità della reazione k1(v1) è proporzionale a quanto diminuisce la conc di A che si sta trasformando in B (il segno – è perché si sta trasformando in substrato,

x→convenzione) proporzionale alla costante e concentrazione di A. La reazione inversa è B che torna ad essere A, in cui B è substrato che diventa prodotto A (v-1)

Ora, all'equilibrio, cosa succede? Tante molecole si trasformano da A e in B, tante altre da B in A, e le due velocità sieguagliano tra di loro, solo all'equilibrio si ha questa condizione; l'equilibrio non è mai istantaneo ma ci vuole tempo.

se velocità sono uguali tra loro, le costanti (all'equilibrio) saranno proporzionali tra loro (NON UGUALI)

ricaviamo Keq (che è uguale alla costante di andata fratto quella di ritorno, le due costanti cinetiche)

Cosa intendiamo per ordine di reazione? Una reazione generale (es. anche 3 molecole di A devono dare 1 di B), la velocità di una reazione è data da (reazione in equilibrio xk abbiamo confrontato le velocità che sono uguali)

m→ va determinato sperimentalmente (no

teoricamente)→dipende dal meccanismo di reazione, può essere sia intero che frazionario, radicale, ecc, noi tratteremo solo i casi semplici (0 o 1) La velocità non dipende dalla concentrazione di reagente m=2 si avrà parabola che passa x l’origine m=1 si avrà retta che passa per l’origine m diverso da 0, la velocità di reazione può dipendere dalla concentrazione del reagente Modello di Michaelis e Menten Primo modello di reazione enzimatica proposto, ma invece di spiegare cinetica enzimatica basata su interpretazione molecolare, è più una interpretazione sperimentale Enzima e substrato sono separati, vanno a formare un complesso non ben definito→nella formula l’enzima è generico (ce ne sono di attivi, attivabili, contenere o meno cofattore, ecc) Reazione al prodotto va in un solo verso (ma in alcuni enzimi non è proprio vero, e ciò avviene grazie ad un fattore esterno come ad esempio il pH)

La cinetica con cui si forma ES (k1 e k-1) è più veloce rispetto alla cinetica di k2.

La prima condizione è che l'equilibrio sia molto rapido rispetto alla formazione del prodotto; il passaggio limitante deve essere k2.

[S] >>> [E], substrato in concentrazione maggiore dell'enzima → se → forward=k2 condizioni rispettate [ES]

Stato stazionario [Enzima] iniziale = [Enzima] finale

All'inizio di questa reazione avremo, substrato in [C] maggiori (fissata inizialmente S0) ed Et (enzima che vogliamo trovare o noto) → man mano che aumenta il tempo quindi processo avviene, l'enzima libero comincia a diminuire (E) e complesso (ES) comincia a aumentare → zona curve costanti steady state/stato stazionario

Il substrato invece decresce velocemente, poi si stabilizza la velocità (nella zona in cui anche enzima si stabilizza) e allo stesso modo aumenta prodotto e nella stessa zona diventa lineare → (S) e (P) hanno lo stesso coefficiente

Il valore di una variabile (o di ES) è costante nel tempo

La velocità di formazione di ES è uguale alla velocità di consumo

Nella regione grigia ES ed E sono stazionari

Le costanti cinetiche sono un rapporto di K_m e V_forward e [ES]

Una condizione per cui questo vale è che dobbiamo essere in condizione saturante ([S] >>> [Etot]), e stiamo quindi spingendo l'equilibrio a formare tanto ES, perché c'è tanto substrato per l'enzima libero

[Etot] = [ES] e k₂ prende il nome di K_cat

V_max = K_cat x [Etot]

Cosa sono K_m, K_cat e il loro rapporto K_cat/K_m?

K_cat è la costante del primo ordine cinetico che si riferisce alle proprietà del primo ordine, rappresenta il turnover, cioè considerata l'unità di tempo (es. un secondo) quante volte sull'enzima un certo numero di molecole si legano e vengono processate quindi efficienza

quanto taglia in 1 sec l'enzima enzimaKm, costante di dissociazione apparente, perché ES è ambiguo, rappresenta + specie, e quindi Km rappresenta→valutiamola costante di equilibrio di associazione di tutte quelle specie se enzima sta funzionando

Il rapporto definisce quanto è specifico quel substrato su quel particolare enzima, perché possono avere +→ →substrati si misura efficacia di enzima su quel substrato specificità dell'enzima su quel substrato

Fattori che modificano velocità dell'enzima possono essere l'aggiunta di fattori, o fattori che regolano attivazione, allosteria, inibizione, ecc Ci sono enzimi semplici (solo proteina) o enzimi“complessi” o “oloenzimi” (parte proteica+ non proteica -cofattore)

Parte proteica→apoenzima→cofattore

Parte non proteica

Cofattore può essere:

• Gruppo prostetico, piccola molecola/atomoinorganica, legato forte all'enzima
• Coenzima

grande molecola organica, legato debolmente all'enzima (es gruppo EME)

Meccanismi di regolazione: questi cofattori come vengono utilizzati?

Enzima ha delle tasche, c'è un coenzima che si lega (può accadere che la forma della tasca e quella del coenzima riarrangiamento siano diverse del substrato che fa legare il coenzima) → oloenzima (a cui si può legare substrato) → *Coenzimi + utilizzati derivano da vitamine, oppure possono essere i NAD, FAD, ecc → coenzimi sono NOLD: non protein, organic molecules, low MW, dyalizable

Come fanno cofattori a regolare attività enzimatiche?

Ci sono due tipi di reazioni dei cofattori:

• Indiretta, non si lega nel sito di legame del substrato, ma si lega a un altro sito, questo legame modifica poi il sito catalitico dei substrati che ne consente poi il riconoscimento; non partecipa direttamente alla reazione
• Diretta, cofattore partecipa direttamente alla reazione, si immettono nel sito catalitico, lo completano

lo strutturano in modo da far avvenire la reazione e prende parte alla reazione

Coenzimi:

• Metaboliti, sintetizzati attraverso l'alimentazione, la dieta
• Derivati da vitamine, non siamo capaci di sintetizzare da frammenti e metterli insieme per formarli

Vitamine non possono essere sintetizzate dai mammiferi ma devono essere ottenute tramite nutrienti

Regolazione allosterica:

• Sito altro, non sito catalitico
• Es. cofattore si lega a sito allosterico e regola attività del sito catalitico
• Spesso è un meccanismo utilizzato quando l'enzima è molto grande che richiede quindi un sito allosterico per la regolazione

L'allosteria si riconosce anche dalle forme cinetiche enzimatiche (non conformi a cinetica Michaelis-Mendel)

Regolazione per inibizione:

• Inibitore allosterico, legato all'enzima che fa assumere all'enzima una modifica al sito catalitico rendendolo inattivo (uno o più siti catalitici)
• Attivatore allosterico, attiva il sito catalitico

co dell'enzima Esempio di questo meccanismo: Regolazione del feedback Si parte da substrato iniziale: threonina, che viene legata alla threonina deaminasi→1 → →intermedio ecc intermedi produzione isoleucina come prodotto, ma questa molecola inibisce sito della threonina deaminasi; quindi, quando la concentrazione di questa molecola cresce x questo processo e→supera livello soglia, si attiva meccanismo di feedback c’è abbastanza isoleucina non c’è bisogno di produrne altra Enzimi inibitori Ci sono diversi metaboliti, capaci di regolare enzimi inibendoli Un inibitore si lega a enzima e gli impedisce formazione complesso ES x produrre EP Inibitori di vario tipo: - Reversibili, può dare luogo ad equilibrio, processo reversibile, - Competitive, competono per il sito catalitico che non si può legare al substrato o influenzano comunque sito catalitico.