Biochimica speciale

Biochimica speciale

Enzima

Enzima → proteine che intervengono in un processo chimico facilitandone la reazione (alla fine della reazione si rigenerano perché non si consumano, dato che non sono un reagente/prodotto). Si tratta comunque di una reazione che già deve avvenire in modo naturale; l'enzima la velocizza (∆G<0).

Lievito En in, dentro Zyme. Questo nome perché i greci scoprirono che il lievito fa avvenire la trasformazione.

Nomenclatura

• Nomi comuni (pepsina, tripsina, ecc.) spesso non c'è un nome scientifico nei farmaci.
• Substrato + ase (lattasi, sintetasi, ecc.; inglese ase, italiano asi).
• Substrato + tipo di reazione (piruvato decarbossilasi, ecc.).
• Enzyme Code: 4 numeri di cui ognuno ha uno specifico significato (i.e. EC 1.1.1.1). Sito internazionale della biochimica classifica enzimi in 6 categorie in base alle reazioni che catalizzano.

6 classi di enzimi

1. Ossidoreduttasi (ossidazione/riduzione)
2. Transferasi (trasferiscono piccoli gruppi tra molecole)
3. Idrolasi (tagliano legami da una molecola se ne formano 2, ed è coinvolta H₂O)
4. Lyases (liasi) — spezzano legami (senza acqua)
5. Isomerasi — stereoisomeria (molecole da L a D o contrario)
6. Ligasi (formazione nuovi legami)

EC 2.7.3.22 indica la classe delle transferasi. Il 7 indica il gruppo funzionale su cui agisce, ad esempio 7 sta per molecola con almeno un atomo di fosforo (se non c'è il gruppo si mette 0, perché può essere un semplice movimento di elettroni, senza coinvolgere molecole). Il 3 identifica se c'è il coenzima e quale; anche questo può essere 0 nel caso non ci fosse il coenzima.

Motore di ricerca: Sito per nomenclatura enzimi + info su di essi. Se cerco EC 2.7.3.2 mi esce il nome: Creatine Kinase (creatin chinasi) + altre info tra cui altri siti (MEDLINE, sito per la ricerca sicuro e controllato, sito scientifico); posso trovare anche gene o trascritto di questo enzima, trovare la reazione e la struttura proteina e molecolare.

Isoenzima

Isoenzima è una categoria di enzimi, ISO significa che catalizza le stesse reazioni di un enzima ma può avere diversa struttura; li possiamo distinguere con metodi elettroforetici, saggi immunoenzimatici, resistenza all’attivazione chimica o termica. Ci sono isoforme genetiche e isoforme non genetiche.

Si possono avere 2 geni che codificano per subunità di una proteina. I trascritti, mRNA, ecc. si scrivono con le lettere minuscole mentre i polipeptidi e proteine con le lettere maiuscole. In questo caso vediamo 2 geni che codificano per subunità della lactatodeidrogenasi (LDH), A= muscolo e B= cuore. Dai polipeptidi si formeranno le subunità che si vanno a legare per formare dimeri sia dello stesso tipo che non, e poi per formare tetrameri che saranno dello stesso tipo o non. Chiaramente quelli di tipo A con subunità uguali avranno più probabilità di trovarsi nei muscoli mentre le B nel cuore, le altre in modo circa ubiquitario.

In questo caso avremo: A=M= muscolo e B=H=cuore (heart). A partire da sinistra: LDH-5 (M₄); LDH-4 (HM₃); LDH-3 (H₂M₂); LDH-2 (H₃M); LDH-1 (H₄). LDH-5 e 4 saranno più presenti nel muscolo scheletrico, rene e fegato, LDH-2 e 1 saranno più presenti nel cuore e miocardio, LDH-3 ubiquitarie.

Si ha lo stesso discorso della lactato deidrogenasi che per la creatin kinasi (CK), che è un dimero ed è composto da 2 subunità, B ed M e ci saranno quindi 3 isoforme: BB, MB, MM. BB nel cervello, tratto gastrointestinale, urinario; MB poco presente in piccola percentuale nel cuore; MM nel cuore, muscoli scheletrici. Questi valori li possiamo usare per diagnosticare problemi e trovare a cosa sono correlati.

Isoforme non genetiche

Enzimi che subiscono modificazioni come acilazione, deaminazione, glicosilazione, fosforilazione, ecc., così anche il modo in cui il substrato o l’ambiente esterno vede la proteina, o cambia attivazione/inattivazione enzimi. Gli enzimi non sono solo proteine, ci sono alcuni RNA che hanno funzione enzimatica (RIBOZIMI). Enzimi, quindi, fanno parte o di proteine o di RNA.

Fattori che modificano gli enzimi

Tra i fattori ambientali, il principale che modifica gli enzimi è il pH: tutti gli enzimi hanno un intervallo di pH in cui essi lavorano in modo ottimale (non per forza è pH 7,4); ma come faccio a sapere qual è il pH giusto? Controllo sui database e oltre al pH troverò anche il tampone ottimale che fa agire in modo ottimale l’enzima.

Il pH è importante perché va ad agire con gli amminoacidi dell’enzima che si possono protonare/deprotonare, quindi variandolo si varia la protonazione/deprotonazione e viene alterato così il sito catalitico di un enzima. Quando siamo a pH<2 e pH>10 è talmente alto il profilo elettrostatico che destabilizziamo la struttura della proteina indebolendo il folding della proteina e si verifica la denaturazione della proteina.

Gli enzimi citoplasmatici funzionano in quell’ambiente, in quella viscosità, in quella situazione, dentro la cellula. Come fa l’enzima a riconoscere il substrato? Ci sono vari modelli di questo riconoscimento; il modello più semplice è il random collision paths che richiede enzima e substrato di forma rigida e ben strutturata che si incastrano, ma ovviamente si devono incontrare nel modo giusto per incastrarsi quindi il problema è l’orientamento (elevata temperatura si muovono più velocemente) c’è comunque bisogno di un giusto orientamento.

L’enzima in questo caso deve vedere da lontano il substrato per riuscire ad orientarsi, si tratterà di una reazione combinata perché entrambi si devono girare e posizionare.

Il riconoscimento

• Long range interactions (interazioni a lungo raggio), interazioni efficaci a distanza fra carica-carica (+&-).
• Short range interactions (interazioni a corto raggio), molto forti ma quando le particelle sono lontane non sono efficaci.

Le interazioni a lungo raggio hanno efficacia orientante, mentre quando arriviamo al corto raggio possono avvenire riarrangiamenti in zone flessibili per ottimizzare il legame.

Esempio: legame Procaspasi-9 e Apaf-1. Come hanno fatto a riconoscersi? Nella procaspasi-9 c’è una zona carica prevalentemente + e nella apaf-1 carica -, a distanza ruotano per cercarsi, ad una certa distanza avviene il riconoscimento perché si ha una reazione casuale per cui sono in fase chiave-serratura, in quel momento da lontano si riconoscono e si avvicinano e arrivano a corto raggio dove cominciano a instaurarsi gli altri legami (a idrogeno, disolfuri, ecc).

Quanto è estesa questa superficie di interazione? Negli enzimi siamo tra i 1000 e 2000 Angstrom di superficie; se l’enzima/substrato dovessero essere più grandi non cambia comunque la superficie di interazione perché sono altamente specifici. La velocità di reazione dipende dal riconoscimento.

Un altro fattore: la temperatura

La temperatura aumenta la velocità di diffusione delle particelle, ma può anche denaturare le strutture proteiche; l’aumento della temperatura favorisce sì la reazione ma fino ad un certo punto, un massimo, e poi decade (35-45°C dell’efficienza degli enzimi biologici). Aumentando troppo la temperatura aumentiamo le vibrazioni molecolari, quindi i moti delle catene laterali degli amminoacidi, che ruotano troppo e le rendiamo meno stabili, destabilizzando i legami e le strutture secondarie quindi anche le catene laterali idrofobiche (che prima erano coperte per minimizzare l’esposizione all’acqua, ma se ruotano non coprono le parti idrofobiche).

In un primo momento vengono destabilizzate le reazioni di impacchettamento, il fold della struttura è ancora efficace e la struttura secondaria è mantenuta, si sta solo muovendo (aprendosi e chiudendosi, oscilla); se continuiamo ad alzare la temperatura induciamo la rottura dei ponti idrogeno della struttura secondaria (che reggono alfa elica o beta sheet) distruzione enzima, denaturazione.

Questo fenomeno impatta anche la cinetica chimica della reazione (enzimi catalizzano reazioni che possono già avvenire); quella reazione aumentando la temperatura aumenta anch’essa (senza enzima, dipende da temperatura perché particelle si muovono di più).

Denaturazione: non sempre si riesce a tornare indietro, non sempre è reversibile. Teoricamente sì ma praticamente no perché bisognerebbe diluire tanto le molecole per isolarle le une dalle altre, perché la proteina sfoldata tende ad aggregare formando attorciglio di filamenti, viene formato questo aggregato che non funziona più da proteina/enzima.

Il sito catalitico

Nella catalisi enzimatica sono coinvolti meno del 5% dei residui della proteina che entrano nel meccanismo di reazione; il sito catalitico dell’enzima è una struttura terziaria o quaternaria a cui possono essere riarrangiati i cofattori (non legati in modo permanente, ma intrappolati ogni tanto nel sito catalitico). Il legame che si forma è non covalente, e contribuiscono a questo binding le forze di Van Der Waals, legami H, forze elettrostatiche (dipoli); queste interazioni non fanno parte di superfici ampie ma di “tasche” in cui possono rimanere intrappolate anche molecole di H₂O che spesso partecipano a questo tipo di reazioni.

Esempio: serino-proteasi (taglia/scinde) Proteasi del virus dell’epatite C, proteasi NS3. Il riconoscimento è ampio ma la catalisi avviene solo sulla tasca. Il substrato riconosciuto è lungo circa 10 residui/amminoacidi (raro perché solitamente serino proteasi riconoscono solo 4 residui). Perché per l’HCV richiede 10 residui per riconoscimento? Proteasi in un virus serve per tagliare amminoacidi di proteine virali, per produrle quindi (non quelle dell’ospite altrimenti uccide cella ospitante e non può riprodursi), richiede quindi più residui di riconoscimento per non sbagliare e non tagliare amminoacidi cellula ospite.

Quando mettiamo insieme enzima + substrato, si forma complesso enzima substrato (ES) molto solido, dopo c’è una barriera ad alto livello energetico per arrivare al primo intermedio di reazione (ES*). Il substrato si lega con l’enzima (cariche - e zona idrofobica – cariche + e zona idrofobica) legame substrato con orientamento per interazione elettrostatica impacchettamento (catalisi), poi enzima pronto per nuovo ciclo.

Cosa succede nella catalisi enzimatica? Se una reazione avviene senza enzima, può avvenire e deve passare attraverso intermedio di reazione attivato (che ha elevato contenuto di energia, molto instabile) serve quindi molta energia, perciò la reazione è lenta, reazione deve assorbire tanta energia. Enzima e catalizzatori abbassano questa soglia rendendo più facile il superamento, quindi l'evento enzimatico; alla fine arriviamo sempre allo stesso prodotto, quello che cambia è il di energia che serve per superare la barriera.

Nel caso della serino-proteasi, una volta avvenuto il riconoscimento e legame, l’Ossigeno della serina (δ-) si stacca e viene polarizzato da alcune molecole dell’enzima, entra poi in gioco il substrato che lega l’ossigeno della serina (questa è la catalisi a metà strada, aumenta pk struttura corrisponde Tl1, intermedio di reazione) dell’Histidina (passa da pk 5/6 a 8) e si.

Come si passa alla terza parte? Tramite una reazione di forma Tl2 (intermedio 2) acyl enzima idrolisi perché il sito catalitico della proteasi, la triade catalitica (His, Asp, Ser) senza substrato è esposto all’H₂O (serine proteasi cellulari hanno questa zona protetta perché altrimenti l’acqua fa concorrenza per legarsi) ma in questo caso si tratta della serino proteasi del virus che utilizza questo meccanismo (in cui c’è l’H₂O) per cui riesce a selezionare il substrato e ad attivarsi solo con il suo substrato, non quelli cellulari (che hanno amminoacidi molto piccoli); questo virus ha invece amminoacidi ingombranti come substrati che vanno bene per l’enzima e non sono riconosciuti dalle proteasi cellulari (amminoacidi ingombranti perché devono coprire ponti idrogeno e coprire dall’acqua per espellerla dato che era presente perché si trovava in forma libera).

L’area della triade catalitica dell’enzima libero esposta è di 86 Angstrom quadrati, quando c’è il suo substrato diventa 34, ciò significa che abbiamo espulso acqua. Finita questa reazione di legame tra substrato ed enzima con l’espulsione dell’acqua, si forma EP, quindi il prodotto con: il substrato che si stacca e l’acqua che torna nella triade (enzima libero).

Nell’esempio della serino proteasi avevamo 3 amminoacidi, nel lisozima ci sono 6 amminoacidi che partecipano alla catalisi. Il sito catalitico generalmente contiene delle catene (o gruppi funzionali) molto comuni, che riescono a entrare nei meccanismi di reazione (-OH, -NH, -COO, ecc). Bloccano substrato nella posizione e conformazione necessaria; coinvolti proprio nel meccanismo di catalisi.

Modelli di catalisi enzimatica

1. Lock and key model, chiave-serratura, rigido ma molto efficace su alcune famiglie di enzimi. Si assume che l’enzima e il substrato abbiano già la conformazione giusta per poter interagire e produrre un urto efficacie, tutto già preformato, perfettamente funzionale.
2. Induced fit, in cui il sito catalitico è quasi preformato e il substrato pure, non sono rigidi ma possono riaggiustarsi entrambi per dare luogo al riconoscimento finale.

A noi servirà misurare la capacità/attività di un enzima, stabilirne la concentrazione, ecc. Se andiamo a vedere fosfatasi alcalina dobbiamo valutare tutti i parametri (pH, tampone, ecc. fatti in precedenza). Quali sono le unità di misura dell’attività di un enzima? Come è definita attività di un enzima? La concentrazione si stabilisce solo in un modo indiretto, tramite cinetica enzimatica; era storicamente utilizzato un metodo in cui si definiva l’unità di attività, cioè quanto substrato veniva fatto reagire dall’enzima; veniva misurata l’attività, non il numero di molecole, quanto efficace era la reazione.

C'è una difficoltà se si vogliono confrontare enzimi (perché due enzimi diversi, substrati diversi, parametri diversi, ecc.). Si parla quindi di unità di attività, e sono unità rapportate in un certo volume (guardare sempre kit) anche se c’è unità internazionale U, rapportata per Litro o per Kilo (unità per litro o per kilo). Quando Unità di substrato è un polimero (amido con tantissime unità), questo impatta su valore ottenuto perciò l’Unità in questo caso è espressa per micromoli al minuto del prodotto: (Formula che permette di passare da Katal a U).

Dobbiamo utilizzare l’enzima per trovare le concentrazioni di enzima o l’enzima per trovare le concentrazioni del substrato; per capire meglio il tutto dobbiamo fare un passo indietro:

Cinetica di reazione

Una reazione chimica è fatta da specie A che diventa specie B, e c’è una certa velocità in questa reazione (k₁ e k_-1), k minuscola indica costante cinetica (K maiuscola è costante termodinamica, di equilibrio). La velocità della reazione k₁(v₁) è proporzionale a quanto diminuisce la concentrazione di A che si sta trasformando in B (il segno – è perché si sta trasformando in substrato, per convenzione) proporzionale alla costante e concentrazione di A. La reazione inversa è B che torna ad essere A, in cui B è substrato che diventa prodotto A (v_-1).

Ora, all’equilibrio, cosa succede? Tante molecole si trasformano da A in B, tante altre da B in A, e le due velocità si eguagliano tra di loro, solo all’equilibrio si ha questa condizione; l’equilibrio non è mai istantaneo ma ci vuole tempo. Se le velocità sono uguali tra loro, le costanti (all’equilibrio) saranno proporzionali tra loro (NON UGUALI). Ricaviamo K_eq (che è uguale alla costante di andata fratto quella di ritorno, le due costanti cinetiche).

Cosa intendiamo per ordine di reazione? Una reazione generale (es. anche 3 molecole di A devono dare 1 di B), la velocità di una reazione è data da (reazione in equilibrio perché abbiamo confrontato le velocità che sono uguali). m va determinato sperimentalmente (non teoricamente); dipende dal meccanismo di reazione, può essere sia intero che frazionario, radicale, ecc., noi tratteremo solo i casi semplici (0 o 1). La velocità non dipende dalla concentrazione di reagente. Se m=2 si avrà parabola che passa per l’origine; se m=1 si avrà retta che passa per l’origine; se m diverso da 0, la velocità di reazione può dipendere dalla concentrazione del reagente.

Modello di Michaelis e Menten

Primo modello di reazione enzimatica proposto, ma invece di spiegare cinetica enzimatica basata su interpretazione molecolare, è più una interpretazione sperimentale. Enzima e substrato sono separati, vanno a formare un complesso non ben definito.

Nella formula l’enzima è generico (ce ne sono di attivi, attivabili, contenere o meno cofattore, ecc.). Reazione al prodotto va in un solo verso (ma in alcuni enzimi non è proprio vero, e ciò avviene grazie ad un fattore esterno come ad esempio il pH). La cinetica con cui si forma ES (k₁ e k_-1) è più veloce rispetto a cinetica di k₂.

La prima condizione è che l'equilibrio sia molto rapido rispetto alla formazione del prodotto; il passaggio...