Appunti di Biochimica Speciale

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Appunti di biochimica speciale

ROS sta per Reactive Oxygen Species. L'ossigeno può essere dannoso. L'ossigeno di per sé non è molto reattivo, in quanto si trova in forma di ossigeno tripletto. Cioè contiene due elettroni spaiati in orbitali differenti. Però diventa molto più reattivo quando gli si aggiungono degli elettroni, formando dei ROS: anione superossido, ione perossido, perossido di idrogeno e radicale idrossile, che deriva dalla rottura omolitica dell'acqua (H* + OH* con * = elettrone).

Accanto a questi vi sono altri tipi di ROS. I ROS si possono dividere in due tipi, quelli con caratteristiche radicaliche e quelli senza. Tra le specie radicaliche si hanno anche radicali alchile, alcossile, perossile, monossido di azoto (o ossido nitrico), diossido di azoto. Tra i composti non radicalici (con un tempo di dimezzamento più lungo) si hanno anche gli acidi ipoalosi (acidi contenenti un alogeno) o i rispettivi sali, cloramine, in cui l'azoto è legato al cloro (ad esempio la taurina), ossigeno singoletto (in cui uno dei due elettroni spaiati ha lo spin opposto) e perossinitrito (uno dei più potenti agenti antibatterici).

I ROS sono un'arma a doppio taglio in quanto, oltre a poter combattere molti processi infettivi, possono causare diverse patologie. I ROS possono reagire tra di loro, in vari modi, in reazioni catalizzate anche da enzimi.

Reazioni di Fenton e Haber-Weiss

Nella reazione di Fenton si ha la reazione di ferro ferroso con acqua ossigenata. Il ferro diventa ferrico cedendo un elettrone all'acqua ossigenata rompendo il legame e formando un normale ossidrilione ed un radicale idrossile. Una reazione simile si ha se al posto del ferro c'è un anione superossido. Questa è la reazione di Haber-Weiss. Queste due reazioni sono i modi principali in cui si innesca la produzione di radicali ancora più tossici di quelli di partenza. Questa proprietà del ferro è tipica di tutti gli elementi del IV periodo, per quanto, vista l'enorme quantità di ferro presente nel corpo, nell'uomo è principalmente il ferro a partecipare nella reazione di Fenton.

Dalla reazione di anione superossido con NO si ottiene una molecola chiamata perossinitrito, che può diventare acido perossinitroso che può rompersi in modo omolitico liberando biossido di azoto e radicale ossidrile. Dalla reazione di acqua ossigenata con uno ione cloruro si ottiene acqua ed ipoclorito. L'acido ipocloroso può reagire con la taurina, formando taurina cloramina.

Fonti di ROS

I ROS vengono prodotti in continuazione. È stato calcolato che almeno il 2-5% dell'O₂ respirato in un giorno, diventa un ROS, in particolare anione superossido e acqua ossigenata. In malattie come diabete, Parkinson, etc., la produzione di ROS è una delle cause iniziali del danno cellulare.

• Mitocondri sono una delle fonti principali.
• NADPH ossidasi (NOX) che ha la funzione di convertire l'ossigeno in anione superossido nei globuli bianchi, con azione antibatterica.
• Perossidasi, ad esempio la mieloperossidasi, che si trova nei globuli bianchi.
• La xantina ossidasi.
• L'ossido nitrico sintasi (NOS). La NOS converte l'arginina in NO e citrullina. In mancanza di arginina converte l'ossigeno molecolare e lo converte in anione superossido.
• Le emoproteine, cioè tutte le proteine contenenti un gruppo eme (in particolare è il ferro in esso contenuto a causare i danni).
• Vari enzimi, come cicloossigenasi e lipossigenasi che trasformano l'acido arachidonico rispettivamente in prostaglandine e leucotriene.

Nei mitocondri si hanno situazioni in cui si ha un ridotto apporto di ossigeno, ma c'è la necessità di scaricare gli elettroni portati da cofattori ridotti. Può quindi capitare che l'ossigeno reagisca con il coenzima Q e quindi collida in un punto diverso da quello in cui riceve normalmente gli elettroni. In queste condizioni riceve un solo elettrone, diventando anione superossido. Questo avviene normalmente, in intensità ovviamente limitata. Per questo nei mitocondri si trova in gran quantità l'enzima superossido dismutasi che fa reagire due anioni superossido trasformandoli in acqua ossigenata, nel caso in cui l'ossigeno venga ridotto a livello di complessi diversi dal IV.

Importanza dei mitocondri

Perché è così importante proteggere i mitocondri dai ROS? Perché contiene del DNA che è molto più suscettibile del DNA genomico agli stress ossidativi. Nel fenomeno dell'invecchiamento si osserva un progressivo aumento della produzione di ROS a livello mitocondriale. La superossido dismutasi è presente in tre diverse isoforme. Fanno tutte la stessa cosa, cioè fanno una reazione di dismutazione, in cui cioè reagiscono due molecole. Una è mitocondriale, una citosolica ed una extracellulare. Queste ultime due richiedono rame e zinco, mentre quella mitocondriale richiede manganese. La particolarità di questi enzimi è che sono inducibili da numerose citochine infiammatorie, in particolare quella mitocondriale e quella extracellulare.

Gli stessi ROS possono indurre una maggiore attività della superossido dismutasi mitocondriale.

Sclerosi laterale amiotrofica (SLA)

È stata osservata un'alterazione della superossido dismutasi citosolica nel caso della sclerosi laterale amiotrofica. Nelle corna ventrali del midollo spinale si trovano dei motoneuroni che nel caso della SLA muoiono. Se un motoneurone muore, la fibra muscolare va incontro ad una progressiva degenerazione, perché l'innervazione di un muscolo non regola solo la contrattilità, ma anche il normale trofismo. La SLA è stata chiamata anche con il nome di malattia di Lou Gehrig, uno dei primi sportivi in cui è stata osservata.

In un 20% dei casi la SLA è ereditaria autosomica dominante. Il gene coinvolto è quello che codifica la superossido dismutasi citosolica dei neuroni. Non è ancora chiaro perché questa alterazione si traduca in una morte neuronale, ma l'ipotesi è che questa favorisca un maggior danno ossidativo, una conseguente presenza di agglomerati di proteine e quindi all'apoptosi.

Dopo la produzione di acqua ossigenata dalla superossido dismutasi, interviene la catalasi che fa reagire due molecole di acqua ossigenata per produrre acqua ed ossigeno. Vi sono altri enzimi che fanno la stessa cosa, perché si osservano casi in cui la catalasi non funziona e questi vivono ugualmente. Tali enzimi sono le perossidasi. Le perossidasi, oltre alla reazione catalizzata dalle catalasi, trasformano anche perossidi in due alcoli più un composto riducente X.

Una delle perossidasi più importanti è la glutatione perossidasi. Accanto al glutatione si possono usare anche acido ascorbico e citocromo C. Le perossidasi hanno la caratteristica di avere nel sito attivo un residuo di selenocisteina, in cui al posto di S si ha un atomo di selenio. Si è ipotizzato che in alcune zone del mondo dove si ha un'alta incidenza di tumori e malattie cardiovascolari (aterosclerosi) questo sia causato da una carenza di Se nel terreno (che si traduce in una ridotta capacità della perossidasi).

Un altro importante enzima di cui sono ricchi soprattutto i globuli bianchi è la mieloperossidasi, un enzima che fa reagire l'acqua ossigenata (è quindi una via alternativa ad altre perossidasi) con uno ione cloruro, formando ipoclorito e acqua.

Un altro enzima è la NADPH ossidasi (o anche NOX), che sembra essere coinvolta in moltissimi processi sia fisiologici che patologici. Questo enzima usa prevalentemente NADPH, anche se in certe condizioni può usare il NAD ridotto (per questo si indica NAD(P) H ossidasi). Questo enzima trasferisce un elettrone su una molecola di ossigeno. Dato che NADPH porta due elettroni, questo enzima andrà a trasferire un elettrone su due molecole di ossigeno.

In condizioni di ipossia la xantina deidrogenasi utilizza non più il NAD producendo acqua ma può utilizzare ossigeno per produrre acqua ossigenata. Quindi in occasioni come la riperfusione ischemica si ha la produzione di acqua ossigenata.

L'ossido nitrico (monossido di azoto)

Inizialmente si credeva fosse solo un agente inquinante, ma poi si è scoperto che veniva prodotto anche dall'organismo. Alcuni ricercatori stavano studiando anelli di aorta di coniglio monitorando il grado di rilassamento della muscolatura liscia quando sottoposto all'azione di acetilcolina. Se però si portava via l'endotelio, quindi lasciando a nudo la muscolatura liscia, si osservò che l'acetilcolina non causava più dilazione, ma al contrario si aveva una piccola contrazione. Quindi si osservò che l'acetilcolina doveva interagire con le cellule endoteliali per produrre un fattore, chiamato inizialmente EDRF, che inducesse la dilatazione. Dopo anni si scoprì che l'EDRF non era nient'altro che il monossido di azoto. Questo veniva prodotto dalle cellule endoteliali a partire dall'arginina. Si asportava infatti l'azoto ammidico (l'arginina formava citrullina).

Nella reazione interviene l'enzima NO sintasi, insieme a NADPH ed in presenza di O₂. Ma già da tempo si sapeva che i composti contenenti azoto erano vasodilatatori. Per esempio la nitroglicerina, o trinitrina. In tempo di guerra, gli operai dell'industria bellica spesso collassavano. Questo perché gli esplosivi contenevano molti nitriti, che se venivano inalati venivano trasformati in NO e quindi si aveva una vasodilatazione.

In realtà si è poi scoperto che NO è anche un importante neurotrasmettitore, sconvolgendo anche il concetto di neurotrasmettitore, cioè di una sostanza che si accumulava in vescicole e che veniva rilasciata solo in seguito ad un impulso elettrico. Questo perché NO è un gas, che può essere prodotto solo al momento e non può essere contenuto in vescicole e non si concentra solo a livello della sinapsi, ma si diffonde a 360 gradi. In seguito si è scoperto che avevano la stessa funzione anche H₂S, acido solfidrico, e anche CO, monossido di carbonio.

Un terzo evento è che in soggetti con processi infiammatori cronici si osserva un aumento di nitrito e nitrato nelle urine. Ci si chiedeva da dove potesse derivare. Deriva dal sistema immunitario, che in risposta ad uno stato infiammatorio, si mette a produrre anche NO. Quindi compare anche il ruolo di NO nella risposta immunitaria aspecifica. NO ha un'emivita piuttosto lunga, rispetto agli altri radicali, 1 o 2 secondi. Viene rilasciato dai globuli bianchi e partecipa all’uccisione del batterio o del virus. Poi si è visto che NO viene prodotto praticamente in tutti i tessuti, non solo endotelio, sistema nervoso o globuli bianchi. In particolare NO prodotto dall'endotelio è anche un inibitore dell'aggregazione piastrinica. Quindi NO ha un'azione positiva anche nello sviluppo di un ateroma.

Isoforme dell'NO sintasi

• NO sintasi neuronale costitutiva.
• NO sintasi inducibile.
• NO sintasi endoteliale costitutiva.

Per quanto queste isoforme possono essere un po' tutte inibite o usate in modo costante, quindi questi termini sono vecchi ed un po' fuorvianti, anche perché si trovano un po' in tutti i tessuti. È un dimero, in cui ciascuna delle due subunità presenta dei siti per coenzimi (NADPH, FAD, FMN, CaM o calmodulina, BH4 o tetraidrobiopterina e eme). Nelle forme neuronali ed endoteliali il legame Ca/calmodulina porta al legame con l'enzima e ne aumenta l'attività, mentre nella forma inducibile è sempre legata, quindi è indipendente dal Ca.

L'aumento di sostanze all'esterno della cellula, come acetilcolina e glutammato, induce un'aumentata permeabilità dell'ER che lascia fuoriuscire del Ca, o induce un'aumentata attività dei canali del Ca, quindi facendolo entrare dall'esterno. Il Ca si lega alla calmodulina e il complesso CaM va a legarsi all'enzima attivandolo. L'attivazione di NOS inducibile richiede la presenza di determinate proteine (citochine, interferone beta, tumor necrosis factor). Queste si legano ad un recettore che aumenta la traduzione dell'enzima. Naturalmente lo scopo è diverso. Nella cellula endoteliale è necessario un enzima che lavori in modo rapido. Analogamente per i neuroni. Per le cellule del sistema immunitario il discorso è diverso.

Si è visto che uno dei componenti che causano il danno ai neuroni in seguito ad ischemia, è la maggiore produzione di NO, che ha un'azione citotossica nei confronti dei neuroni vicini. Questo fenomeno si chiama eccitotossicità. Per questo si è visto che somministrando un inibitore della NOS si riduceva il danno ai tessuti ischemici. NO ha un effetto anche sulla guanilato ciclasi, che converte GTP in GMP ciclico. La guanilato ciclasi ha due subunità legate da un eme. Nel vaso si ha una situazione in cui l'acetilcolina attiva una via di segnalazione che aumenta l'attività della NOS. Si forma così NO che, essendo un gas, diffonde. Può diffondere nel sangue, dove ha un effetto antiaggregante piastrinico. Può anche diffondere nella muscolatura, dove interagisce con la guanilato ciclasi solubile. Infatti questa guanilato ciclasi sta nel citosol. In tal modo il ferro dell'eme si lega all'NO. Il legame sposta il ferro, che si traduce in un cambiamento conformazionale della proteina (proprio come nell'emoglobina, legando O₂, si aveva un cambiamento dell'affinità).

Questo cambiamento conformazionale aumenta l'attività della guanilato ciclasi, quindi aumenta la concentrazione di GMP ciclico. Il GMP ciclico, proprio come AMP ciclico legava la PKA, lega PKG. La PKG fosforila determinate proteine, tra cui una catena leggera della testa della miosina. Si determina così una ridotta contrattilità, in quanto la miosina non si può legare efficacemente all'actina. PKG fosforila anche i canali del calcio, determinando un minor ingresso di Ca e quindi di nuovo una minore contrattilità.

Ma l'NO può essere anche tossico. Infatti può legarsi all'eme di molte proteine, in particolare quello dei citocromi, determinando un blocco della respirazione mitocondriale. Può legare anche il ferro non legato all'eme, quindi i centri Fe-S della catena respiratoria, ma anche l'aconitasi, che ha un centro Fe-S, bloccando anche il ciclo di Krebs. L'effetto tossico dell'NO lo si vede bene anche nel ruolo che ha nella risposta immunitaria. La NOS produce grandi quantità di NO che poi diffondono intorno al macrofago. NO è anche un inibitore della proliferazione cellulare. Tutto questo può avvenire sia in cellule neoplastiche che in batteri.

Danno ossidativo al DNA

I ROS possono causare gravi danni anche al DNA. Ad esempio interagendo con la guanina causano la comparsa di un ossigeno, formando la 8-cheto-7-idroguanina. Questo può determinare danni a livello della duplicazione del DNA, dal momento che la chetoguanina riconosce adenina, invece di citosina. Questo processo si chiama transversione, in quando l'adenina poi in successive replicazioni si accoppia con timina, quindi da CG si passa alla coppia AT. Ci sono vari tipi di agenti con i quali gli operai possono venire a contatto. Un sistema per capire se gli operai sono stati esposti con un agente ossidante è vedere la presenza di chetoguanina nei globuli bianchi.

Lipoperossidazione

In presenza di un ROS, un elettrone viene trasferito alla catena idrocarburica di un lipide. Questo determina uno spostamento degli elettroni π, se presenti. Quindi si possono formare dei doppi legami coniugati. Uno degli eventi più frequenti è che questo elettrone spaiato attiri una molecola di ossigeno, formando così un radicale perossile. L'inserimento di un atomo di ossigeno, in questo modo rende molto più instabile la molecola, determinando così la rottura della catena idrocarburica. In tal modo spesso si formano molecole tossiche come la malondialdeide e il 4-idrossinonenale. La malondialdeide si può legare a delle proteine, collegandole.

La lipoperossidazione è un evento dannoso che spesso causa la morte cellulare. Le classiche macchie senili sono derivati della reazione di proteine con aldeidi, acidi carbossilici a catena corta e altre molecole frutto della lipoperossidazione. Queste formazioni si chiamano lipofuscine.

Ossidazione delle proteine

Se la proteina ha dei gruppi SH si determinerà la formazione di ponti disolfuro, nella stessa proteina o anche tra proteine diverse. Non è l'unico effetto, però possono anche alterare le caratteristiche di numerosi amminoacidi delle proteine, alterando almeno temporaneamente l'attività della proteina. L'effetto chiaramente è meno duraturo di un danno al DNA, ma si possono verificare gravi alterazioni del metabolismo.

Per quanto riguarda l'ossidazione di glicidi, questa può determinare un diverso antigene sulla membrana cellulare, che quindi viene riconosciuto e le cellule del sistema immunitario eliminano la cellula che lo espone. La produzione di ROS può essere conseguenza di patologie, come nel caso di soggetti affetti da favismo.

Antiossidanti fisiologici

Idrosolubili:

• GSH
• Acido ascorbico

Questi sono i principali agenti antiossidanti del citoplasma e del plasma.

Liposolubili:

• Acido urico, una molecola che se si accumula può causare gravi danni, ma in realtà è una mo...