Biochimica generale

Biochimica generale e applicata

È lo studio della composizione molecolare delle cellule, delle reazioni che subiscono i composti biologici e della regolazione di queste reazioni. La biochimica può essere:

• Strutturale: studia la struttura delle macromolecole;
• Funzionale: parte che riguarda il metabolismo cellulare (reazioni che avvengono all’interno della cellula).

Amminoacidi

Esistono 20 amminoacidi standard che entrano a far parte delle proteine; tutti gli amminoacidi sono alfa-amminoacidi (ovvero il gruppo amminico è sul carbonio alfa) eccetto che per la prolina, che è un alfa-imminoacido. Carbonio alfa = carbonio più vicino alla parte ossidata. L’imminoacido presenta un gruppo amminico.

Il pH intracellulare è mantenuto in modo preciso a circa 7,2 a questo pH si trovano gli AA in forma zwitterionica. Nel plasma sono presenti AA in forma libera, derivanti dalla dieta (digestione di proteine esogene); anche senza alimentazione sono comunque presenti gli amminoacidi liberi in quanto derivano dallo scambio di AA tra tessuti (vi è una concentrazione fissa di AA nel plasma). Hanno un carbonio sp³ asimmetrico, con quattro costituenti diversi, quindi sono otticamente attivi (1 su 20 non è otticamente attivo perché il gruppo R è un idrogeno).

Isomeri

Molecole con la stessa formula molecolare, ma con diversa struttura. Ci sono due tipi di isomeri:

• Isomeri costituzionali: differiscono nell’ordine degli atomi all’interno della molecola, es. gliceraldeide e diidrossiacetone.
• Stereoisomeri: differiscono per l’orientamento spaziale dei gruppi all’interno della molecola stessa.

Stereoisomeri

• Enantiomeri: sono degli stereoisomeri, immagini speculari l’una dell’altra, non sovrapponibili. Es. D-gliceraldeide e L-gliceraldeide. Stesse caratteristiche fisiche e chimiche tranne due: ruotano in direzione opposta il piano della luce polarizzata e inoltre si legano in modo diverso con strutture a loro volta simmetriche (l’asimmetria presente a livello del sito attivo fa sì che solo un enantiomero può legarsi specificatamente a un dato enzima; gli enzimi sono detti stereospecifici, in quanto in generale sono in grado di riconoscere uno stereoisomero). Separarli è quasi impossibile.
• Diesterisomeri: sono molecole non immagini speculari l’uno dell’altro (es. il glucosio e l’altrosio, due carboidrati con stessa formula molecolare, ma diversa disposizione spaziale). Hanno diverse proprietà chimiche e fisiche e per questo sono facilmente separabili.

Regole di planarizzazione di Fischer

Serve per descrivere la struttura degli isomeri; è basato su un modello della molecola gliceraldeide. Per assegnare un isomero:

• Si scrive in verticale tutti i C;
• I legami verticali vanno dietro al piano;
• La parte più ossidata (più ossidabile) è in alto.

Se l’OH del carbonio asimmetrico più lontano dal carbonio a maggior numero di ossidazione è a destra dell’asse degli atomi di C, il composto si assegna alla serie D, altrimenti alla L. Esistono amminoacidi in natura solo appartenenti alla serie L; non esistono AA della serie D (ci sono poche eccezioni, per esempio dei Gram-positivi, in quanto ha pochi AA della serie D). Gli AA standard sono tutti L, tranne uno che è la glicina, che non è uno stereoisomero.

Gli AA liberi esistono in soluzione nel plasma e a livello extracellulare (liquido interstiziale), dove il pH è leggermente più alcalino (circa 7,4 anziché 7,2). Lo stato di ionizzazione dipende dal pH e dal pKa. Titolazione di un aminoacido: hanno gruppi funzionali carbossilico (pK: 2,34) e amminico (pK: 9,6). La titolazione dell’istidina ha tre gruppi funzionali, in quanto ha in più un gruppo laterale della glicina. pI = punto isoelettrico è il valore di pH al quale una molecola non ha una carica elettrica netta.

Classificazione degli amminoacidi

Gli AA si classificano in base al tipo di catena laterale:

• Apolari: catena laterale idrofobica.
• Polari: catena laterale polare, ma non hanno una carica netta a pH fisiologico.
• Carichi.

Apolari

Si dividono a loro volta in:

• AA non polari con gruppo R alifatico: glicina (ha un idrogeno, quindi è l’unico AA che non è uno stereoisomero); prolina (è un imminoacido, ha un gruppo amminico secondario). Valina, leucina e isoleucina sono AA prevalentemente presenti a livello muscolare, hanno gruppi R idrofobici. Metionina: uno dei due AA che ha un atomo di zolfo.
• AA non polari con un gruppo R aromatico: fenilalanina, tirosina e triptofano.
• AA essenziali: sono amminoacidi non sintetizzabili e quindi vanno introdotti con la dieta.

Polari

Si dividono in:

• AA con gruppi R polari, non carichi: serina, treonina, cisteina (ha uno zolfo al posto dell’ossigeno, per questo differisce da serina; è il secondo AA con un gruppo solforico), asparagina e glutammina hanno un gruppo amminico non carico a pH fisiologico.
• AA con gruppi R carichi positivamente: AA basici, sono l’istidina, l’arginina e la lisina.
• AA con gruppi R carichi negativamente: AA carichi negativamente, sono l’aspartato e il glutammato.

Residui amminoacidici non standard

Esistono anche dei residui amminoacidici non standard, ovvero AA modificati che si trovano nelle proteine (le modificazioni sono post-traduzionali: quindi dopo la sintesi proteica conclusa ci sono dei sistemi che modificano la struttura della proteina stessa). Le modificazioni possono essere tantissime:

• Fosforilazione: AA con gruppo alcolico possono andare incontro ad addizione di un OH a formare un estere con un acido fosforico (otteniamo fosfoserine);
• Idrossilazione;
• Acetilazioni: aggiunta di un gruppo acetile CH₃CO o metile CH₃ a particolari residui della lisina e arginina; sono state scoperte in proteine che strutturalmente si legano al DNA formando la struttura del cromosoma (cromatina) vengono acetilate. Queste acetilazioni o deacetilazioni sono funzionali a un cambiamento di struttura del DNA, favorendone una forma più compatta del DNA (eterocromatina) o una forma più rilassata del DNA (eucromatina). Queste modifiche dei cromosomi hanno a che vedere col fatto se quella data porzione di cromosoma è utilizzata per la sintesi proteica, ovvero se è attiva. L’eterocromatina impedisce la trascrizione di DNA, mentre l’eucromatina, più distesa, è permissiva per la lettura e trascrizione del DNA. Riassumendo, la struttura della cromatina quindi dipende da modifiche post-trasduzionali di proteine che si legano al DNA.

Gli AA sono importanti in quanto sono precursori biosintetici sia delle proteine che degli ormoni: uno di questi è il GABA (acido γ-amminobutirrico), neurotrasmettitore di cui il glutammato ne è precursore. L’istamina e la dopamina sono molecole anch’esse biologicamente attive; la dopamina è un neurotrasmettitore che viene dall’AA tirosina, mentre l’istamina è un mediatore delle risposte allergiche, derivante dall’amminoacido istidina. La tiroxina è precursore di T₃ e T₄. Citrullina e ornitina sono due AA non standard che si ritrovano all’interno della cellula, si ritrovano come intermedi. S-adenosinmetionina è una forma attivata della metionina grazie a un legame sullo zolfo.

Proteine

Polimeri di AA, macromolecole più diffuse in quanto le loro caratteristiche strutturali fanno in modo che abbiano molte funzioni. È stato stimato che il DNA sia in grado di codificare circa 25 mila proteine diverse, con varietà delle funzioni; una grossa parte delle proteine sono enzimi, ovvero catalizzatori di reazioni (aumentano la velocità delle reazioni), troviamo poi trasportatori che mediano il passaggio di molecole a basso peso molecolare. Le proteine sono poi necessarie per la contrazione muscolare (actina e miosina), per il loro ruolo strutturale (come quelle presenti nel citoplasma che costituiscono i microtubuli, microfilamenti o citoscheletro); esistono inoltre proteine all’esterno della cellula, come il collagene, con funzione di stabilizzazione della cellula, immunoglobuline (mediano la risposta immunitaria), si trovano nei meccanismi di visione.

Per passare da AA a proteine, due amminoacidi possono andare incontro a una reazione di condensazione, tra un gruppo alfa-amminico e alfa-carbossilico, ovvero l’eliminazione di una molecola di acqua, per avere legame amminico, detto “legame peptidico”. Le proteine sono fatte di residui amminoacidici che sono legati l’uno all’altro con legami peptidici. Reazione formale (teorica) è diversa da quella che avviene nella realtà, in quanto la condensazione è impossibile da un punto di vista termodinamico. Una proteina differisce da un’altra per numero di AA e per la loro sequenza.

Le proteine hanno un’estremità libera carbossilica e un’estremità libera amminica; legandosi testa-coda si avrà l’ultimo AA con un’estremità carbossilica libera.

Il legame peptidico o amminico è un legame sigma, rigido e planare a causa della risonanza: ha una lunghezza di legame intermedia tra la lunghezza di un legame sigma e la lunghezza di un legame pi-greco. Si può formare un legame peptidico in cis (legame peptidico dove i due gruppi R si trovano dalla stessa parte del piano) o in trans (gruppi R sono in posizioni opposte rispetto al piano delimitato dal legame peptidico stesso); la forma cis nella maggior parte dei casi è impedita dall’ingombro sterico, quindi la trans è la configurazione più frequente.

Il legame peptidico planare non impedisce totalmente la libertà di movimento del polimero in quanto esistono ulteriori legami tra carbonio alpha e carbossile e C alpha e gruppo NH, che invece sono semplici legami sigma, quindi hanno capacità di movimento (legame tra carbonio alpha e NH è detto legame phi Φ, mentre quello tra carbonio alpha e carbossile è detto psi Ψ). Gli angoli di rotazione permessi comunque non sono a 360° in pratica: ci sono alcuni angoli permessi e alcuni no, a causa dell’ingombro sterico dei gruppi R laterali dei due amminoacidi adiacenti.

Ramachandran considerò tutti gli angoli possibili permessi intorno ad ogni gruppo amminoacidico, andando a misurarli sperimentalmente. Grafico: verde angoli possibili. Alanina ha poco ingombro sterico, ma nonostante ciò gli angoli non possibili sono molti. Fece questo perché determinare la sequenza di una proteina vuol dire differenziarle, tecnica che era già possibile in passato (era impossibile determinarne la struttura tridimensionale, definendo tutti i possibili angoli posso ottenere una sequenza primaria delle proteine e quindi posso capirne la struttura tridimensionale).

Struttura delle proteine

Si classificano 4 tipi di struttura.

Struttura primaria

Sequenza amminoacidica; scoperta da Watson e Crick. Se conosco il codice genetico, conosco anche la proteina. Si parla di oligopeptidi per quanto riguarda sequenze proteiche fino a 10 residui amminoacidici, come il TSH, la vasopressina e l’ossitocina (prodotte dall’ipofisi). La vasopressina e ossitocina sono molto simili a livello strutturale e sono due ormoni, uno che aumenta la pressione arteriosa e l’altro che stimola la contrazione di una particolare muscolatura liscia. Alfa-amanitina: ha 8 amminoacidi. Polipeptidi: sequenze da 10 a 100 amminoacidi. L’insulina ne fa parte, ha 56 AA. 100 AA è la lunghezza minima con cui si può avere una struttura tridimensionale definita e stabile. La più piccola proteina non può essere più piccola di 100 AA. Proteine: hanno sequenze da 100 AA in su. 100 AA corrisponde a un peso da 11 a 13mila peso Dalton.

Struttura secondaria

Porzioni di sequenza stabilizzate esclusivamente dal legame a idrogeno, legame elettrostatico direzionale. Ci sono tre tipi di strutture secondarie:

• Alpha elica: porzioni della molecola che si avvolgono a formare un’elica. Sono tutte destrorse: ruotano verso destra. I parametri dell’elica sono due: parametro n, ovvero il numero di residui amminoacidi per ogni giro dell’elica, e p, ovvero la distanza lineare che occorre affinché l’elica torni al punto di partenza (passo dell’elica: se è lungo si ha un’elica a forma di molla stirata). Stabilizzata da legami a idrogeno intracatene, tra il gruppo CO e il gruppo NH di un altro AA; le catene laterali non partecipano alla stabilizzazione della struttura. Legame a H si forma tra un gruppo CO di un residuo “n” e un gruppo NH di un residuo “n+4” (il secondo AA sta 4 posti più avanti). I legami a idrogeno sono paralleli rispetto all’elica quando l’elica ha la posizione più stabile, quindi quando è nella condizione di minima energia. La forza di legame è inversamente proporzionale alla distanza tra i gruppi che partecipano al legame (se si allunga l’elica si aumenta la distanza dei gruppi nel legame H e quindi diminuisce la forza di legame; elica più compressa è meno stabile perché i legami H sono troppo lunghi). Forza legame: carica₁ * carica₂ / distanza tra le cariche. La più stabile di tutte è quella con n=3,6 residui, dove i due atomi coinvolti nel legame a H sono separati da 13 atomi, mentre p=5,4 armstrong. Legami H trasformano questo tipo di struttura, quindi hanno una forza di interazione maggiore. Pedice di 3,6:13 (numero di amminoacidi che intercorrono tra due amminoacidi che fanno legame a idrogeno).
• Foglietto beta: ha delle similitudini all’alfa elica, in quanto è sempre una struttura stabilizzata dal legame H. Legame H si forma tra gruppi C=O e N-H dei legami peptidici intercatena (tra catene polipeptidiche affiancate; C=O della prima catena con N-H della seconda). In questo caso il legame non è intracatena, ma tra due catene diverse. Struttura beta antiparallela: le due catene che si contrappongono vanno in direzione opposta tra loro. Si possono avere anche strutture beta parallele, che vanno entrambe nella stessa direzione. La lunghezza dei legami H quando le due catene sono antiparallele è minore, quindi l’interazione del legame è più forte e di conseguenza la struttura risulta più stabile. Nella beta parallela i gruppi che formano il legame H sono più distanti, quindi la forza con cui le due catene sono tenute insieme è inferiore e quindi la struttura risulta meno stabile. Nelle proteine globulari si trovano solitamente da 2 a 15 catene polipeptidiche in un foglietto beta. Le catene laterali degli amminoacidi si trovano alternativamente sopra e sotto il piano del foglietto; i gruppi R non partecipano alla formazione del legame a idrogeno. Linker: uniscono testa-coda le porzioni del foglietto beta. Il foglietto beta necessita di due porzioni di catena che si giustappongono e quindi queste due porzioni devono essere connesse tra loro con catene amminoacidiche. Una sequenza proteica è formata da due porzioni di sequenza che si legano a formare un foglietto beta (A). Sono legate da una sequenza di AA che forma la legatura tra le due. Le due porzioni sono antiparallele. Per porzioni parallele invece la catena (porzione di sequenza non strutturata che le collega) deve essere ripiegata e più lunga (B).
• Beta turns: sono delle sequenze non ripetitive che consentono un’inversione di 360° nella direzione della proteina. Sono presenti 4 residui amminoacidici, che si ripiegano in modo tale che ci sia un’inversione a 360°; consente l’inversione della sequenza con cui si sviluppa la proteina. Appartengono alle strutture secondarie in quanto sono stabilizzate anche loro da legami ad idrogeno tra il gruppo C=O di un AA₁ e un gruppo N-H che partecipa sul carbonio 3 di un AA₂ (tramite legame peptidico). Queste strutture sono presenti nella maggior parte delle proteine perché per potersi piegare in senso tridimensionale occorre che la proteina sia ripiegata (360° è il loop più stretto possibile). Non tutti gli AA consentono un loop così stretto per motivi di ingombro sterico; se i gruppi laterali sono stericamente ingombranti e l’AA₄ non è sufficientemente vicino all’AA₁ non si può formare il legame ad idrogeno. Nella maggior parte dei casi la sequenza che consente un ripiegamento della proteina è una sequenza che contiene due AA, quasi sempre sono una la glicina (Gly) e una la Prolina (Pro). Tra questi 4 molto spesso sono presenti Gly e Pro: la glicina perché ha un ingombro sterico piccolo in quanto di dimensioni ridotte; la prolina perché quando si trova in cis conferisce una curvatura naturale della catena peptidica (rende più semplice la curvatura).

Quando si ha legame peptidico la configurazione più stabile è la configurazione trans (gruppi R degli AA adiacenti sono posti lateralmente); se i gruppi R sono vicini questo crea ingombro (legami cis). Quando c’è la prolina la percentuale di legami cis, che normalmente sono presenti nello 0,05% dei casi, diventa del 6%, quindi incrementa particolarmente; ripiegano naturalmente la catena.

Quando la proteina viene sintetizzata a livello dei ribosomi non viene ripiegata in modo casuale, infatti il suo ripiegamento viene assistito da una classe di proteine che sono le chaperonine, che ne assistono il folding. Una sottoclasse di queste chaperonine è il PPI. L’enzima “peptide prolil cis-trans isomerasi (PPI)” favorisce la formazione della forma cis del legame peptidico in presenza di prolina, quindi favorisce la formazione dei beta-turns. Questi enzimi assistono la ripiegatura della proteina.

Struttura terziaria

Conformazione tridimensionale; ogni proteina ha un’unica conformazione detta “nativa”. Modifiche anche piccole alla struttura tridimensionale portano a una denaturazione della proteina. È la forma con cui la proteina è capace di svolgere la sua funzione fisiologica. Di struttura...