Biochimica generale

CATENA RESPIRATORIA E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

La catena respiratoria e la fosforilazione ossidativa avvengono nella membrana interna dei

mitocondri. Nella catena respiratoria gli elettroni contenuti nelle molecole di NADH e di FADH2 sono

trasferiti tramite una serie di trasportatori fino ad arrivare all’ossigeno.

Prima di ridurre l’ossigeno ad acqua gli elettroni prendono parte ad una serie di reazioni redox,

rilasciando gradualmente la loro energia.

Gli elettroni passano da coppie redox con potenziale via via maggiore.

Questa energia viene usata per pompare gli ioni H+ dalla matrice mitocondriale verso lo spazio

intermembrana, compreso tra la membrana interna e quella esterna del mitocondrio. Si crea così

un gradiente elettrochimico che verrà sfruttato poi dalla fosforilazione ossidativa per sintetizzare

ATP.

La catena respiratoria è costituita da:

• complessi mitocondriali

• coenzima Q (ubichinone): composto da 10 subunità ripetute

• citocromo C

I complessi mitocondriali sono 4 grosse proteine immerse nella membrana mitocondriale interna.

Ciascun complesso mitocondriale contiene centri redox in grado di accettare e cedere elettroni,

passando da uno stato ossidato a quello ridotto.

I 4 complessi multi-enzimatici sono collegati da due trasportatori mobili, il CoU e il citocromo C:

• CoU: lipide di membrana. Trasporta elettroni dal complesso 1 al 2 al 3;

• Citocromo C: proteina che trasporta elettroni dal complesso 3 al 4.

Il complesso mitocondriale I, o NADH deidrogenasi, è un enzima di grandi dimensioni, contenente

più di 43 catene peptidiche. E’ una flavoproteina contenente FMN. Ha sei centri Ferro-zolfo.

Il complesso I riceve elettroni ad alta energia dal coenzima NAD ridotto, proveniente dalla glicolisi e

dal ciclo di Krebs. Il NADH cede due elettroni ed è ossidato a NAD+; gli elettroni vengono trasferiti

all’ubichinone, una piccola molecola apolare in grado di accettare e cedere elettroni e di muoversi

liberamente nello spesso della membrana. Ubichinone (o coenzima Q) diventa coenzima QH2.

Sul coenzima Q arrivano elettroni anche dalla navetta glicerolo-3-fosfato e dalla beta-ossidazione

degli acidi grassi. Ubichinone è il primo trasportatore di elettroni ed è formato da 10 subunità

ripetute. Esistono vari tipi di complessi di coordinazione con il ferro:

• Ferro legato allo zolfo organico, legato a cisteina;

• Ferro che fa legami di coordinazione con 4 cisteine;

• 4 atomi di ferro con 4 atomi di zolfo inorganico e 4 cisteine.

Contemporaneamente il complesso I pompa 4 protoni nello spazio intermembrana.

Il complesso 1 assume due conformazioni:

1. Conformazione A: espone i siti ad alta affinità per i protoni verso la matrice;

2. Conformazione B: espone i siti ad alta affinità per i protoni verso l’esterno.

Gli elettroni passano da FMN al ferro e dal ferro al coenzima Q (ubichinone)→ o lega un elettrone

e diventa semi-ubichinolo, oppure ne lega due e diventa ubichinolo QH2.

Una fonte alternativa di elettroni ad alta energia è il succinato, proveniente dal ciclo di Krebs.

Complesso II, detto succinato deidrogenasi, due elettroni sono trasferiti all’ubichinone, con un

passaggio non diretto che passa dal FAD.

Questo coenzima riceve due elettroni dal succinato, FAD diventa FADH2, poi li cede all’ubichinone.

Il complesso II è il più piccolo dei complessi mitocondriale e l’unico che non pompa protoni nello

spazio intermembrana.

Complesso III: citocromo C reduttasi, si trova nella membrana mitocondriale interna (proteina

integrale). Ha dei centri Fe-S simili a quelli del complesso I: differenza fondamentale è che contiene

delle proteine, dette citocromi, che hanno gruppi EME come gruppi prostetici. Queste EME proteine

sono di due tipi, B e C; il tipo C è contenuto nel citocromo C.

Del complesso 3 fanno parte il citocromo DH (sottotipo di citocromo B), citocromo DL e citocromo

C1.

Nei citocromi il ferro passa da +2 a +3 e quindi funziona come trasportatore di elettroni.

L’ubichinone trasferisce due elettroni per volta al complesso III, la citocromo C reduttasi. Da qui gli

elettroni passano al citocromo C, un altro trasportatore mobile costituito da una proteina solubile

posta nello spazio intermembrana.

Il citocromo C prende gli elettroni in uscita dal complesso 3, ne può prendere solo uno per volta (fa

entrare due elettroni e ne fa uscire uno).

Il complesso III divide il flusso di elettroni tramite il “ciclo Q”:

• Arriva coenzima QH2 nel complesso 3, che trasporta due elettroni→ si lega al sito attivo del

complesso III e viene ossidato, diventando ubichinone (cede i due elettroni). Esce dal

complesso come ubichinone (=Q);

• Questi due elettroni prendono due strade diverse:

- Uno va a ridurre una proteina ferro-zolfo. Il gruppo Fe-S viene ridotto e così l’elettrone

va a livello del gruppo EME C. Da qui passa sul citocromo C1 riducendolo (si trova nel

complesso 3). Elettrone poi esce riducendo il citocromo C.

- L’altro passa da una via più lunga: passa dal citocromo BL al BH, in questo modo si riduce

ubichinone che prende un elettrone e diventa un radicale-semichinone (è un semi-

ubichinolo). Questo resta legato al complesso 3, come intermedio.

• Entra una seconda molecola di QH2: questo ricede due elettroni ed esce come ubichinone.

Il primo elettrone fa la stessa strada breve, mentre il secondo fa un percorso leggermente

diverso. Passa da BL a BH, si lega al semi-ubichinolo rimasto prima legato al complesso 3

facendolo diventare ubichinolo. A questo punto esce QH2.

In questo trasporto entrano 2 elettroni ma ne esce solo uno.

Il complesso 3 è anche una pompa protonica: pompa elettroni contro gradiente dalla matrice allo

spazio intermembrana.

Citocromo: è fondamentale per la vita della cellula, se non funziona porta a morte cellulare.

L’apoptosi estrinseca ed intrinseca hanno il punto di convergenza nel citocromo C: il segnale

apoptotico induce produzione delle proteine che formano dei pori. Questi pori consentono al

citocromo C di uscire e andare nel citoplasma, il che induce un’attivazione della fase effettrice

dell’apoptosi. Induce attivazione delle caspasi, che iniziano a digerire le proteine. Si ha poi

conseguente morte cellulare.

Complesso IV: il citocromo C si sposta verso il quarto complesso, la citocromo C ossidasi, e gli cede

i propri elettroni. L’accettore finale di elettroni è l’ossigeno: mezza molecola di ossigeno cede due

elettroni e con due protoni forma una molecola d’acqua. L’ossigeno come accettore finale di

elettroni ha il vantaggio di avere potenziale di riduzione alto (libera maggior quantità di energia

proprio per il potenziale più alto). Lo svantaggio è che l’ossigeno forma intermedi, fortemente

ossidanti. Il compito del complesso IV è quello di fare in modo di non formare altri intermedi

dell’ossigeno che non siano acqua.

È formato da due sub-unità con diversi trasportatori di elettroni:

• Atomi di rame, che passa da Cu 2+ a Cu 1+. Sub-unità 1: ha un atomo di rame CuB; Sub-unità

2: ha un atomo di rame CuA.

• Citocromo A e citocromo A3, entrambi sulla subunità 1. Contengono rispettivamente un

gruppo EME A e un gruppo EME A3.

Questa reazione vuole 4 elettroni per ridurre completamente una molecola di ossigeno ad acqua.

NB Il citocromo C traporta un elettrone alla volta:

1. Arriva un elettrone, va sul CuA, passa dall’EME A all’EME A3, per poi finire su CuB. A causa

di questo elettrone il CuB passa dallo stato ossidato a ridotto;

2. Arriva un altro citocromo C che scarica un altro elettrone: questo secondo elettrone fa lo

stesso percorso, ma si ferma sull’EME A3, dove riduce il ferro (contenuto nell’EME). Passa

da +3 a +2;

3. Entra l’ossigeno nel complesso 4, il quale va a livello del ferro dell’EME e del rame, si

trasforma in perossido in quanto sono ceduti contemporaneamente due elettroni

sull’ossigeno. O2 è un gas: viene tenuto fermo per un tempo sufficiente affinchè si abbia la

riduzione completa grazie alle forti interazioni elettrostatiche provocate da 5 cariche positive

(2 di queste cariche sono dovute al rame che torna a numero di ossidazione +2, le altre 3

sono dovute al ferro che torna al numero +3);

4. Entrano il terzo e quarto elettrone, che fanno lo stesso percorso: arrivano al perossido che

idrossilano, formando due OH (così l’ossigeno è completamente ridotto). Questi due OH

formano due molecole di H2O, che escono.

Il complesso 4 è una pompa protonica→ ciascun elettrone pompa per un protone: essendoci

l’intervento di 4 elettroni abbiamo 4 protoni; questi vanno nella matrice, dove serviranno per

produrre ATP.

La catena respiratoria è la principale produttrice di radicali liberi nella cellula. Questi ROS possono

provocare danni importanti, per questo le cellule si sono evolute per resistere a questi danni tramite

due meccanismi:

- Meccanismo passivo: composto dalla presenza di riducenti che si ossidano al posto del

materiale biologico, es. vitamina E, che in presenza di ROS si ossidano al posto del

materiale biologico, riducendo il danno alla cellula;

- Meccanismi attivi: usano enzimi che eliminano i ROS. Il superossido è il substrato degli

enzimi superossido dismutasi: fanno una reazione di dismutazione che porta alla

formazione di una molecola di ossigeno e una di perossido di idrogeno a partire da due

molecole di superossido. La più famosa è la superossido dismutasi 2: converte ROS in

perossido di H; H2O2 è ridotto ad acqua da un altro enzima. Altro enzima importante è

la catalasi, che fa dismutazione sul perossido producendo ossigeno.

Complessivamente dalla catena respiratoria ottengo 6 protoni che ritrovo nella matrice

mitocondriale: 4 protoni dal complesso IV, 1 protone dal complesso III, 1 protone dal complesso I.

L’energia ceduta dagli elettroni è utilizzata per pompare protoni nello spazio intermembrana.

Mitchell propose che l’accoppiamento tra trasporto di elettroni e sintesi di ATP fosse mediato da

una forza motrice protonica: l’accumularsi di protoni nello spazio intermembrana (grazie al

trasporto di elettroni) genera un gradiente elettrochimico tra i due lati della membrana

mitocondriale interna; è questo il modo in cui l’energia degli elettroni viene conservata e

trasformata in energia chimica, sotto forma di ATP, grazie alla fosforilazione ossidativa. La

conversione avviene ad opera dell’enzima ATP sintasi, un complesso proteico situato sulla

membrana mitocondriale interna.

L’ATP sintasi è formato da due domini:

• Fo: che attraversa la membrana. È sensibile all’oligomicina; costituisce il canale per i protoni.

E’ fatta da una subunità A, diverse subunità C (da 8 a 15