Biochimica generale

BIOCHIMICA GENERALE E APPLICATA

E’ lo studio della composizione molecolare delle cellule, reazioni che subiscono i composti biologici

e della regolazione di queste reazioni.

La biochimica può essere:

● Strutturale: studia la struttura delle macromolecole;

● Funzionale: parte che riguarda il metabolismo cellulare (reazioni che avvengono all’interno

della cellula). AMMINOACIDI

Esistono 20 amminoacidi standard che entrano a far parte delle proteine; tutti gli amminoacidi

sono alfa-amminoacidi (ovvero il gruppo amminico è sul carbonio alfa) eccetto che per la prolina,

che è un alfa-imminoacido. Carbonio alfa= carbonio più vicino alla parte ossidata. L’imminoacido

presenta un gruppo amminico.

Il pH intracellulare è mantenuto in modo preciso a circa 7,2 a questo pH si trovano gli AA in forma

zwitterionica. Nel plasma sono presenti AA in forma libera, derivanti dalla dieta (digestione di

proteine esogene); anche senza alimentazione sono comunque presenti gli amminoacidi liberi in

quanto derivano dallo scambio di AA tra tessuti (vi è una concentrazione fissa di AA nel plasma).

Hanno un carbonio sp3 asimmetrico, con quattro costituenti diversi, quindi sono otticamente

attivi (1 su 20 non è otticamente attivo perché il gruppo R è un idrogeno).

Isomeri: molecole con la stessa formula molecolare, ma con diversa struttura. Ci sono due tipi di

isomeri: isomeri costituzionali (differiscono nell’ordine degli atomi all’interno della molecola, es.

gliceraldeide e diidrossiacetone) e stereoisomeri (differiscono per l’orientamento spaziale dei

gruppi all’interno della molecola stessa).

Gli stereoisomeri si dividono in due a loro volta:

● Enantiomeri: sono degli stereoisomeri, immagini speculari l’una dell’altro, non

sovrapponibili. Es. D-gliceraldeide e L-gliceraldeide. Stesse caratteristiche fisiche e chimiche

tranne due: ruotano in direzione opposta il piano della luce polarizzata e inoltre si legano in

modo diverso con strutture a loro volta simmetriche (l’asimmetria presente a livello del

sito attivo fa sì che solo un enantiomero può legarsi specificatamente ad un dato enzima

gli enzimi sono detti stereospecifici, in quanto in generale sono in grado di riconoscere uno

stereoisomero). Separarli è quasi impossibile.

● Diesterisomeri: sono molecole non immagini speculari l’uno dell’altro (es. il glucosio e

l’altrosio, due carboidrati con stessa formula molecolare, ma diversa disposizione spaziale).

Hanno diverse proprietà chimiche e fisiche e per questo sono facilmente separabili.

Regole di planarizzazione di Fischer: serve per descrivere la struttura degli isomeri; è basato su un

modello della molecola gliceraldeide.

Per assegnare un isomero:

● Si scrive in verticale tutti i C;

● I legami verticali vanno dietro al piano;

● La parte più ossidata (più ossidabile) è in alto.

Se l’OH del carbonio asimmetrico più lontano dal carbonio a maggior numero di ossidazione è a

destra dell’asse degli atomi di C il composto si assegna alla serie D, altrimenti alla L.

Esistono amminoacidi in natura solo appartenenti alla serie L; non esistono AA della serie D (ci

sono poche eccezioni, per esempio dei Gram-positivi, in quanto ha pochi AA della serie D).

Gli AA standard sono tutti L, tranne uno che è la Glicina, che non è uno stereoisomero.

Gli AA liberi esistono in soluzione nel plasma e a livello extracellulare (liquido interstiziale), dove il

pH è leggermente più alcalino (circa 7,4 anziché 7,2).

Lo stato di ionizzazione dipende dal pH e dal pKa.

Titolazione di un aminoacido: hanno gruppi funzionali carbossilico (pK: 2,34) e amminico (pK: 9,6).

La titolazione dell’istidina ha tre gruppi funzionali, in quanto ha in più un gruppo laterale della

glicina. pI= punto isoelettrico è il valore di pH al quale una molecola NON ha una carica elettrica

netta.

Gli AA si classificano in base al tipo di catena laterale:

● Apolari: catena laterale idrofobica;

● Polari: catena laterale polare, ma non hanno una carica netta a pH fisiologico;

● Carichi.

APOLARI: si dividono a loro volta in:

● AA non polari con gruppo R alifaticoglicina: ha un idrogeno, quindi è l’unico AA che non è uno

stereoisomero; prolina: è un imminoacido, ha un gruppo amminico secondario. Valina, leucina

e isoleucina sono AA prevalentemente presenti a livello muscolare hanno gruppi R idrofobici.

Metionina: uno dei due AA che ha un atomo di zolfo.

● AA non polari con un gruppo R aromatico Fenilalanina, tirosina e triptofano.

● AA essenziali: sono amminoacidi non sintetizzabili e quindi vanno introdotti con la dieta.

POLARI: si dividono in:

● AA con gruppi R polari, non carichi serina, treonina, cisteina (ha uno zolfo al posto

dell’ossigeno, per questo differisce da serinaè il secondo AA con un gruppo solforico),

asparagina e glutammina hanno un gruppo amminico non carico a pH fisiologico.

● AA con gruppi R carichi positivamente AA basici, sono l’istidina, l’arginina e la lisina.

● AA con gruppi R carichi negativamenteAA carichi negativamente, sono l’aspartato e il

glutammato.

Esistono anche dei residui amminoacidici non standard, ovvero AA modificati che si trovano nelle

proteine (le modificazioni sono post-traduzionali: quindi dopo la sintesi proteica conclusa ci sono

dei sistemi che modificano la struttura della proteina stessa). Le modificazioni possono essere

tantissime:

● fosforilazione AA con gruppo alcolico possono andare incontro ad addizione di un OH a

formare un estere con un acido fosforico (otteniamo fosfoserine);

● idrossilazione;

● Acetilazioni aggiunta di un gruppo acetile CH3CO o metile CH3 a particolari residui della

lisina e arginina; sono state scoperte in proteine che strutturalmente si legano al DNA

formando la struttura del cromosoma (cromatina) vengono acetilate. Queste acetilazioni

o deacetilazioni sono funzionali ad un cambiamento di struttura del DNA, favorendone una

forma più compatta del DNA (eterocromatina) o una forma più rilassata del DNA

(eucromatina). Queste modifiche dei cromosomi hanno a che vedere col fatto se quella

data porzione di cromosoma è utilizzata per la sintesi proteica, ovvero se è attiva.

L’eterocromatina impedisce la trascrizione di DNA, mentre l’eucromatina, più distesa, è

permissiva per la lettura e trascrizione del DNA. Riassumento, la struttura della cromatina

quindi dipende da modifiche post-trasduzionali di proteine che si legano al DNA.

Gli AA sono importanti in quanto sono precursori biosintetici sia delle proteine che degli ormoni:

uno di questi è il GABA ( , neurotrasmettitore di cui il glutammato ne è

acido γ-amminobutirrico)

precursore. L’istamina e la dopamina sono molecole anch’esse biologicamente attive la

dopamina è neurotrasmettitore che viene dall’AA tirosina, mentre l’istamina è un mediatore delle

risposte allergiche, derivante dall’amminoacido istidina. La tiroxina è precursore di T3 e T4.

Citrullina e ornitina sono due AA non standard che si ritrovano all’interno della cellula, si ritrovano

come intermedi. S-adenosinmetionina è una forma attivata della metionina grazie ad un legame

sullo zolfo. PROTEINE

Polimeri di AA, macromolecole più diffuse in quanto le loro caratteristiche strutturali fanno in

modo che abbiano molte funzioni. E’ stato stimato che il DNA sia in grado di codificare circa 25mila

proteine diverse, con varietà delle funzioniuna grossa parte delle proteine sono enzimi, ovvero

catalizzatori di reazioni (aumentano la velocità delle reazioni), troviamo poi trasportatori che

mediano il passaggio di molecole a basso peso molecolare. Le proteine sono poi necessarie per la

contrazione muscolare (actina e miosina), per il loro ruolo strutturale (come quelle presenti nel

citoplasma che costituiscono i microtubuli, microfilamenti o citoscheletro); esistono inoltre

proteine all’esterno della cellula, come il collagene, con funzione di stabilizzazione della cellula,

immunoglobuline (mediano la risposta immunitaria), si trovano nei meccanismi di visione.

Per passare da AA a proteine due amminoacidi possono andare incontro ad una reazione di

condensazione, tra un gruppo alfa-amminico e alfa-carbossilico, ovvero l’eliminazione di una

molecola di acqua, per avere legame amminico, detto “legame peptidico”. Le proteine sono fatte

di residui amminoacidici che sono legati l’uno all’altro con legami peptidici. Reazione formale

(teorica) è diversa da quella che avviene nella realtà, in quanto la condensazione è impossibile da

un punto di vista termodinamico. Una proteina differisce da un’altra per numero di AA e per la

loro sequenza.

Le proteine hanno un’estremità libera carbossilica e un’estremità libera amminica; legandosi testa

coda si avrà l’ultimo AA con un’estremità carbossilica libera.

Il legame peptidico o amminico è un legame sigma, rigido planare a causa della risonanzaha una

lunghezza di legame intermedia tra la lunghezza di un legame sigma e la lunghezza di un legame

pi-greco.

Si può formare un legame peptidico in cis (legame peptidico dove i due gruppi R si trovano dalla

stessa parte del piano) o in trans (gruppi R sono in posizioni opposte rispetto al piano delimitato

dal legame peptidico stesso); la forma cis nella maggior parte dei casi è impedita dall’ingombro

sterico, quindi la trans è la configurazione più frequente.

Il legame peptidico planare non impedisce totalmente la libertà di movimento del polimero in

quanto esistono ulteriori legami tra carbonio alpha e carbossile e C alpha e gruppo NH, che invece

sono semplici legami sigma, quindi hanno capacità di movimento (legame tra carbonio alpha e NH

Ψ).

è detto legame phi Φ, mentre quello tra carbonio alpha e carbossile è detto psi Gli angoli di

rotazione permessi comunque non sono a 360° in pratica: ci sono alcuni angoli permessi e alcuni

no, a causa dell’ingombro sterico dei gruppi R laterali dei due amminoacidi adiacenti.

Ramachandran considerò tutti gli angoli possibili permessi intorno ad ogni gruppo amminoacidico,

andando a misurarli sperimentalmente. Grafico: verde angoli possibili.

Alanina ha poco ingombro sterico, ma nonostante ciò gli angoli non possibili sono molti.

Fece questo perché determinare la sequenza di una proteina vuol dire differenziarle, tecnica che

era già possibile in passato (era impossibile determinarne la struttura tridimensionaledefinendo

tutti i possibili angoli posso ottenere una sequenza primaria delle proteine e quindi posso capirne

la struttura tridimensionale).

La struttura delle proteine: si classificano 4 tipi di struttura.

STRUTTURA PRIMARIA: sequenza amminoacidica; scoperta da Watson e Crick. Se conosco il

codice genetico, conosco anche la proteina. Si parla di oligopeptidi per quanto riguarda sequenze

proteiche fino a 10 residui amminoacidici, come il TSH, la vasopressina e l’ossitocina (prodotte

dall’ipofisi). La vasopressina e ossitocina sono molto simili a livello strutturale e sono due ormoni,

uno che aumenta la pressione arteriosa e l’altro che stimola la contrazione di una particolare

muscolatura liscia. Alfa-amanitina: ha 8 amminoacidi. Polipeptidi: sequenze da 10 a 100

amminoacidi. L’insulina ne fa parte, ha 56 AA. 100 AA è la lunghezza minima con cui si può avere

una struttura tridimensionale definita e stabile. La più piccola proteina non può essere più piccola

di 100 AA. Proteine: hanno sequenze da 100 AA in su. 100 AA corrisponde a un peso da 11 a

13mila peso Dalton.

STRUTTURA SECONDARIA: porzioni di sequenza stabilizzate esclusivamente dal legame ad

idrogeno, legame elettrostatico direzionale. Ci sono tre tipi di strutture secondarie:

● alpha elicaporzioni della molecola che si avvolgono a formare un’elica. Sono tutte

destrorse: ruotano verso destra. I parametri dell’elica sono due: parametro n, ovvero il

numero di residui amminoacidi per ogni giro dell’elica, e p, ovvero la distanza lineare che

occorre affinchè l’elica torni al punto di partenza (passo dell’elica: se è lungo si ha un’elica

a forma di molla stirata). Stabilizzata da legami a idrogeno intracatene, tra il gruppo CO e il

gruppo NH di un altro AA le catene laterali non partecipano alla stabilizzazione della

struttura. Legame a H si forma tra un gruppo CO di un residuo “n” e un gruppo NH di un

residuo “n+4” (il secondo AA sta 4 posti più avanti). I legami a idrogeno sono paralleli

rispetto all’elica quando l’elica ha la posizione più stabile, quindi quando è nella condizione

di minima energia. La forza di legame è inversamente proporzionale alla distanza tra i

gruppi che partecipano al legame (se si allunga l’elica si aumenta la

distanza dei gruppi nel legame H e quindi diminuisce la forza di

legame; elica più compressa è meno stabile perché i legami H sono

troppo lunghi). Forza legame: carica1*carica2/distanza tra le cariche.

La più stabile di tutte è quella con n=3,6 residui, dove i due atomi

coinvolti nel legame a H sono separati da 13 atomi, mentre p=5,4

armstrong. Legami H trasformano questo tipo di struttura, quindi

hanno una forza di interazione maggiore. Pedice di 3,6:13 (numero di

amminoacidi che intercorrono tra due amminoacidi che fanno legame

a idrogeno).

● foglietto beta: ha delle similitudini all’alfa elica, in quanto è sempre

una struttura stabilizzata dal legame H. Legame H si forma tra gruppi

C=O e N-H dei legami peptidici intercatena (tra catene polipeptidiche

affiancate; C=O della prima catena con N-H della seconda). In questo

caso il legame non è intracatena, ma tra due catene diverse.

Struttura beta antiparallela: le due catene che si contrappongono vanno in direzione opposta tra

loro. Si possono avere anche strutture beta parallele, che vanno entrambe nella stessa

direzione. La lunghezza dei legami H quando le due catene

sono antiparallele è minore, quindi l’interazione del

legame è più forte e di conseguenza la struttura

risulta più stabile.

Nella beta parallela i gruppi che formano il legame H

sono più distanti, quindi la forza con cui le due

catene sono tenute insieme è inferiore e quindi la

struttura risulta meno stabile.

Nelle proteine globulari si trovano solitamente da 2

a 15 catene polipeptidiche in un foglietto beta. Le

catene laterali degli amminoacidi si trovano

alternativamente sopra e sotto il piano del foglietto i

gruppi R non partecipano alla formazione del legame ad

idrogeno. Linker: uniscono testa-coda le porzioni del

foglietto beta.

Il foglietto beta necessita di due porzioni di catena che si

giustappongono e quindi queste due porzioni devono essere

connesse tra loro con catene amminoacidiche. Una sequenza

proteica è formata da due porzioni di sequenza che si legano a

formare un foglietto beta (A). Sono legate da una sequenza di AA che forma la legatura tra le due.

Le due porzioni sono antiparallele.

Per porzioni parallele invece la catena (porzione di sequenza non strutturata che le collega) deve

essere ripiegata e più lunga (B).

● Beta turns sono delle sequenze non ripetitive che consentono un’inversione di 360° nella

direzione della proteina. Sono presenti 4 residui amminoacidici, che si ripiegano in modo

tale che ci sia un’inversione a 360° consente l’inversione della sequenza con cui si sviluppa

la proteina. Appartengono alle strutture secondarie in quanto sono stabilizzate anche loro

da legami ad idrogeno tra il gruppo C=O di un AA1 e un gruppo N-H che partecipa sul

carbonio 3 di un AA 2 (tramite legame peptidico). Queste strutture sono presenti nella

maggior parte delle proteine perché per potersi piegare in senso tridimensionale occorre

che la proteina sia ripiegata (360° è il loop più stretto possibile). Non tutti gli AA

consentono un loop così stretto per motivi di ingombro sterico se i gruppi laterali sono

stericamente ingombranti e l’AA 4 non è sufficientemente vicino all’AA 1 non si può

formare il legame ad idrogeno. Nella maggior parte dei casi la sequenza che consente un

ripiegamento della proteina è una sequenza che contiene due AA, quasi sempre sono una

la glicina (Gly) e una la Prolina (Pro).

Tra questi 4 molto spesso sono presenti Gly e Pro la glicina perché ha un ingombro sterico piccolo

in quanto di dimensioni ridotte; la prolina perché quando si trova in cis conferisce una

curvatura naturale della catena peptidica (rende più semplice la curvatura).

Quando si ha legame peptidico la configurazione più stabile è la configurazione trans (gruppi R

degli AA adiacenti sono posti lateralmente); se i gruppi R sono vicini questo crea ingombro

(legami cis). Quando c’è la prolina la percentuale di legami cis, che normalmente sono

presenti nello 0,05% dei casi, diventa del 6%, quindi incrementa particolarmente; ripiega

naturalmente la catena.

Quando la proteina viene sintetizzata a livello dei ribosomi non viene ripiegata in modo casuale,

infatti il suo ripiegamento viene assistito da una classe di proteine che sono le chaperonine,

che ne assistono il folding. Una sottoclasse di queste chaperonine è il PPI. L’enzima

“peptide prolil cis-trans isomerasi (PPI)” favorisce la formazione della forma cis del legame

peptidico in presenza di prolina, quindi favorisce la formazione dei beta-turns. Questi

enzimi assistono la ripiegatura della proteina.

STRUTTURA TERZIARIA: conformazione tridimensionale; ogni proteina ha un’unica conformazione

detta “nativa”. Modifiche anche piccole alla struttura tridimensionale portano ad una

denaturazione della proteina. E’ la forma con cui la proteina è capace di svolgere la sua funzione

fisiologica. Di strut