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14. FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA
La fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri. I mitocondri hanno due membrane, una esterna
facilmente penetrabile da piccoli ioni o piccole molecole, quella interna è quasi impermeabile tranne che per
+
molecole come CO , H O e O risulta quindi impermeabile a ione H . Specifiche specie chimiche che
2 2 2
possiedono un recettore sulla superficie mitocondriale stessa possono penetrare la membrana interna ed è
proprio sulla membrana interna che si svolge la catena respiratoria ed è dove si trova il complesso
enzimatico per la produzione di ATP, quindi sono presenti trasportatori di elettroni, ATP-sintasi, e
trasportatori di metaboliti. Nella matrice mitocondriale avvengono invece tutte le reazioni metaboliche
tranne la glicolisi che avviene nel citosol.
L’ATP si forma a partire da ADP + Pi e dato che non si trova all’interno del mitocondrio necessiterà di
essere trasportato all’interno, contemporaneamente l’ATP prodotto percorrerà la via inversa.
La fosforilazione ossidativa ha inizio con la catena di trasporto degli elettroni. La maggior parte degli
+ +
elettroni sono ricavati dall’azione di enzimi deidrogenasi che dipendono da NAD /NADP (nucleotidi
piridinici) e da FMN o FAD (nucleotidi flavinici).
NAD/NADP + -
Le deidrogenasi NAD dipendenti rimuovono due atomi di H sotto forma di H e H . Sia il NAD che il NADP
sono solubili in acqua e si associano reversibilmente alle deidrogenasi. Il NADH trasporta gli elettroni delle
reazioni cataboliche alla NADH deidrogenasi, mentre il NADP trasporta gli elettroni delle reazioni
anaboliche. Né il NAD, né il NADP possono attraversare la membrana mitocondriale interna.
FAD/FMN
FAD e FMN si associano saldamente (talvolta anche covalentemente) alle proteine formando flavoproteine
che appunto contengono un cofattore flavinico. Il coenzima flavinico ossidato può accettare sia uno che due
elettroni.
CATENA DI TRASPORTO DEGLI ELETTRONI
La catena respiratoria mitocondriale è costituita da una serie di trasportatori di elettroni che spesso sono
proteine integrali di membrana che contengono gruppi prostetici in grado di accettare e donare elettroni.
Esistono tre tipi di trasferimento di elettroni:
• 2+ 3+
Diretto come nella riduzione del Fe da Fe a Fe
• + -
Trasferimento di un solo elettrone tramite un atomo di idrogeno nella forma H +e
• -
Trasferimento di due elettroni tramite uno ione idruro H
Qualunque sia la forma di trasferimento degli elettroni con il termine equivalente riducente si indicherà il
singolo elettrone trasferito in una reazione di ossido-riduzione.
I trasportatori di elettroni nella catena respiratoria mitocondriale sono:
• Ubichinone
• Citocromi
• Proteine ferro-zolfo
Ubichinone
L’ubichinone è detto anche coenzima Q o semplicemente Q ed è un benzochinone idrofobico di piccole
dimensioni con una lunga catena laterale, questo gli permette di diffondere facilmente del doppio strato
fosfolipidico della membrana mitocondriale interna e può agire da ponte tra i trasportatori di elettroni meno
mobili e la stessa membrana. Può accettare sia uno che due elettroni e può trasportare sia protoni che
elettroni.
Citocromi
I citocromi hanno un elevato assorbimento della luce e contengono un gruppo eme contenente ferro. Ne
esistono di tre tipi: a, b, c e nei citocromi a e b il gruppo eme pur essendo legato saldamente non è legato
covalentemente al citocromo, il citocromo c invece ha il gruppo eme legato covalentemente. Alcuni tipi di
citocromi sono proteine integrali della membrana mitocondriale interna, il citocromo c dei mitocondri è una
proteina solubile che si lega mediante interazioni elettrostatiche alla superficie estera della membrana
mitocondriale interna.
Proteine ferro-zolfo
Le proteine ferro-zolfo contengono anch’esse un atomo di ferro, ma non in un gruppo eme, è infatti legato a
residui di Cys (a livello dello zolfo) della proteina di cui fanno parte. Esiste una classe atipica di proteine
ferro-zolfo chiamate proteine ferro-zolfo di Reiske dove l’atomo di Fe è legato a residui di His anziché di
Cys. Le proteine ferro-zolfo possono trasportare un solo elettrone.
In generale nella respirazione mitocondriale gli elettroni passano da un donatore primario ai trasportatori di
elettroni per poi finire all’ossigeno.
IL COMPLESSO MULTIENZIMATICO DEL TRASPORTO DI ELETTRONI
Nella membrana mitocondriale interna possono essere riconosciuti ben 4 complessi multienzimatici
responsabili del trasporto di elettroni ed ogni complesso rappresenta una frazione della catena respiratoria
stessa.
Complesso I: NADH ubichinone (NAD ubichinone ossidoreduttasi)
Il complesso 1 è un enzima molto complesso, ha 42 catene peptidiche e possiede ben 6 nuclei Fe-S, ha una
forma ad L dove un braccio si trova nella membrana mitocondriale interna e l’altro è rivolto verso la
matrice. L’enzima catalizza 2 reazione simultanee:
• Trasferimento esoergonico dal NAD di uno ione idruro e dalla matrice di un protone verso
H
+¿+Q 2 ¿
→ NAD
+¿+Q
l’ubichinone secondo la reazione: ¿
NADH H
+
• Trasferimento endoergonico di 4 protoni dalla matrice allo spazio intermembrana
Il complesso 1 è quindi possibile definirlo come una pompa protonica. La reazione che catalizza il
complesso 1 è vettoriale in quanto muove i protoni da una direzione definita (matrice mitocondriale) ad
un’altra ben definita (spazio intermembrana).
L’ubichinone in forma completamente ridotta (QH ) è chiamato ubichinolo e diffonderà nella matrice
2
mitocondriale interna dal complesso 1 al complesso 3 dove verrà ossidato a Q.
Complesso II: succinatoubichinone
Il complesso 2 è anche conosciuto come succinato deidrogenasi (ciclo di Krebs) ed è l’unico enzima
dell’acido citrico ad essere legato alla membrana mitocondriale interna. Contiene almeno due gruppi
prostetici e 4 proteine diverse, di cui ha legato covalentemente un FAD e un centro Fe-S. Il meccanismo di
azione ipotizzato disegna il passaggio degli elettroni dal donatore al FAD che successivamente passano al
centro Fe-S ed infine a Q.
Complesso III: ubichinonecitocromo c
Il complesso 3 è un dimero formato da 11 subunità ed accoppia il trasferimento degli elettroni
dall’ubichinolo (QH ) al citocromo c con il trasporto protonico vettoriale dalla matrice allo spazio
2
intermembrana.
Il ciclo dell’ubichinone + +
Il ciclo dell’ubichinone consiste nel rilascio di 2H per ogni Q, quindi un totale di 4H nello spazio
-
intermembrana. Ciascun QH dona un e (tramite il centro Fe-S) al citocromo c e un altro (tramite il
2 1
+
citocromo b) ad una molecola di Q riducendola ad QH utilizzando anche 2H provenienti dalla matrice
2
mitocondriale. Il ciclo dell’ubichinone regola il trasferimento degli elettroni da un trasportatore a due
elettroni (Q) a trasportatori ad un elettrone (i citocromi) e giustifica perché in ogni reazione sono traslocati
+ -
4H ogni 2e . Quando il gruppo eme del citocromo c accetta un elettrone si sposta verso il centro binucelare
dell’enzima del complesso 4.
Complesso IV: citocromo cO 2
Il complesso 4 è un grosso enzima intermembrana della membrana mitocondriale interna. È formato da 13
subunità di cui:
• Subunità mitocondriale I: è formata da due gruppi eme (a e a ) e da una coppia di ioni rame (Cu ). Il
3 B
gruppo eme a con il gruppo Cu forma un centro binucleare il quale accetta elettroni provenienti dal
3 B
gruppo eme a e li trasferisce ad O che è legato al gruppo eme a
2 3
• Subunità mitocondriale II: contiene ioni rame complessati con gruppi –SH di due residui di Cys
formando un centro binucleare chiamato Cu A
Il trasferimento di elettroni nel complesso IV procede quindi secondo la via:
citocromo c → centro Cu → gruppo eme a → centro gruppo eme a → O
−Cu
A 3 B 2
+
Ogni volta che 4 elettroni attraversano questo ciclo l’enzima usa 4H per ridurre 1 molecola di O 2
formando 2 molecole di H O.
2
SINTESI DELL’ATP
L’energia rilasciata dalla catena di trasporto degli elettroni non viene sprecata, ma viene convertita
nell’energia chimica dell’ATP (lo stesso avviene per il potenziale di membrana). È necessaria quindi una
proteina che associ l’ossidazione con la fosforilazione. Questa proteina è conosciuta come ATPsintasi o
ATPasi (in quanto catalizza anche l’idrolisi dell’ATP). Questa proteina è complessa e attraversa la
membrana mitocondriale interna per tutta la sua lunghezza e si espande anche nella matrice. La parte che
attraversa la membrana interna è chiamata F (che funge da canale protonico) mentre quella che si espande
0
nella matrice è chiamata F ed è proprio la porzione interessata alla sintesi dell’ATP.
1
La catena di trasporto degli elettroni è strettamente collegata alla fosforilazione dell’ADP anche se ci sono
alcune condizioni o alcuni farmaci specifici che possono separarle, ad esempio quando la membrana
mitocondriale viene rotta la catena di trasporto degli elettroni prosegue mentre viene arrestata la
fosforilazione dell’ADP.
Il modello che collega la differenza di concentrazione tra i protoni all’interno della matrice mitocondriale e
lo spazio intermembrana alla produzione di ATP è chiamato modello chemiosmotico.
L’ATP prodotto non è subito rilasciato dall’ATP sintasi bensì è sempre necessario il gradiente protonico a
garantire il rilascio dell’ATP. Per la sintesi continua di ATP l’enzima deve cambiare conformazione tra una
che lega saldamente l’ATP e una che lo rilascia.
+
Ogni 4 H che rientrano attraverso l’ATP sintasi garantiscono la formazione di 1 molecola di ATP.
F è formata da 3 subunità di cui 3α, 3β, γ, δ, ε dove ciascuna delle 3 subunità β possiede un sito catalitico
1
per la formazione di ATP. Anche se hanno la stessa sequenza amminoacidica le 3 subunità β hanno
conformazioni differenti che si estendono anche ai siti di legame per l’ATP e l’ADP.
È stato proposto un meccanismo di azione delle 3 subunità β, e precisamente una delle 3 subunità β
assumerà conformazione β –ADP legando ADP e Pi (preso dall’ambiente circostante), si attuerò quindi un
cambiamento conformazionale in β-ATP che legherà saldamente l’ATP stabilizzandolo determinando
l’equilibrio tra ADP+Pi e ATP e verrà quindi rilasciato l’ATP, a questo punto la subunità assumerà
conformazione β &ndash
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