Biochimica - estrazione dei lipidi

Ora dobbiamo intervenire degradando la matrice organica.

Abbiamo bisogno all’incirca di 100 mg di lipidi.

• Aggiungiamo 2 ml di acido solforico concentrato:

in questo modo, la matrice lipidica verrà degradata. Per favorirne la disgregazione, è possibile

aggiungere un magnetino e porre il contenitore su un agitatore.

• Separiamo le fasi dopo centrifugazione (3000 rpm per 10 min). Raccogliamo il sovranatante in

pallone da 100 ml.

• Facciamo evaporare il solvente nel Rotavapor:

sulle pareti, rimarranno adesi gli organoclorurati.

Dal momento che è possibile che siano rimaste ancora delle impurità, si ricorre ad una cromatografia

su colonna.

La cromatografia è un processo di separazione di più componenti di una miscela basato sulla diversa

affinità di questi per la fase stazionaria. Oggi esistono vari tipi di cromatografie, generalmente

classificate in funzione della natura delle fasi stazionaria e mobile.

Nel nostro caso, la fase mobile è rappresentata dal solvente, mentre la fase stazionaria è una resina

atta a trattenere eventuali impurità. Per preparare una colonna, si inserisce un setto di lana di vetro

all’interno di una pipetta Pasteur. Si aggiunge 1 g di Florisil (resina) e 0,3 g di sodio solfato anidro per

trattenere l’acqua eventualmente presente. Infine si andrà a far evaporare il solvente in corrente

d’azoto.

FASE 3

Iniettiamo i nostri organoclorurati estratti nel gas cromatografo.

La tecnica della gas cromatografia ci servirà per separare i diversi congeneri di PCBs contenuti nel

campione.

La fase mobile è costituita dal “gas carrier”, possiamo utilizzare l’idrogeno mentre la fase stazionaria è

costituita da gel di silice.

ALIMENTATORE: bombola con il gas carrier oppure un generatore di H2.

CAMERA TERMOSTATATA: riscaldata anche oltre i 300 °C, contiene una COLONNA

CAPILLARE.

Essa, costituita da rame e resistente alle alte temperature, contiene la fase stazionaria.

Uno dei suoi capi è connesso all’iniettore, mentre l’altro al rivelatore. La temperatura viene

mantenuta bassa per i primi picchi e poi innalzata per consentire la risoluzione delle sostanze

altobollenti.

INIETTORE: riceve il campione tramite una microsiringa. In questa fase, il solvente evapora.

RIVELATORE (o detector) è un dispositivo posto subito dopo il termine della colonna con la

funzione di indicare la presenza del componente all’uscita della colonna, e di fornire la misura

della concentrazione di esso nel gas di trasporto. Si parla di rilevatore “a cattura di elettroni”

Una sorgente radioattiva (63Ni) emette radiazioni β. Tali elettroni, detti primari, colpiscono le

molecole del gas carrier, generando cationi ed elettroni secondari. Essi sono la causa della

corrente di fondo tipica dello strumento. Al passaggio di sostanze elettroaffine, si generano delle

perturbazioni del sistema, rilevate e tradotte in picchi dal sistema ( si forma così un

cromatogramma).

L’aumento della temperatura durante tutto il procedimento, ci porta ad affermare che si lavora “in

programmata”, infatti si parte da una temperatura vicina e superiore al punto di ebollizione del solvente

e la si aumenta progressivamente in un processo dalla durata di circa 60 minuti. In questo intervallo di

tempo, i congeneri organoclorurati verranno rilevati in tempi diversi a seconda della loro natura:

- Bassoclorurati: rilevati a temperature relativamente basse, hanno affinità con la fase

stazionaria relativamente bassa

- Altoclorurati: rilevati ad alti valori di temperatura. L’affinità con la fase stazionaria aumenta

all’aumentare degli atomi di cloro nella molecola.

CROMATOGRAMMA

Ogni congenere viene contraddistinto da un picco.

Le caratteristiche che contraddistinguono il picco sono:

1) Altezza: distanza tra il massimo e la base, misurata perpendicolarmente all’asse dei tempi;

2) Ampiezza: segmento ottenuto sulla base del picco, i cui estremi corrispondono alle intersezioni

tra questa e le tangenti alla curva nei punti di flesso

I picchi sono utilizzati per effettuare sia un’analisi qualitativa che quantitativa dei PCBs.

Per un’analisi qualitativa, bisogna effettuare un confronto dei tempi di ritenzione: tempo necessario ad

ogni congenere per essere rilevato dallo strumento. I tempi di ritenzione dei singoli congeneri vengono

confrontati con i tempi di ritenzione dei PCBs contenuti in uno STANDARD. Il picco che avrà, nello

standard, lo stesso tempo di ritenzione, rispetto a quello misurato nel cromatogramma identificherà lo

stesso organoclorurato.

Per un’analisi quantitativa, si confronta l’ area del picco standard con quella del campione(area del

picco: misura della superficie delimitata dal contorno e dalla base del picco).

area del picco (standard) : area del picco (campione) = concentrazione PCB (standard) :

x Concentrazione PCBs (campione)