Biochimica - enzimi

Spiegazione della costante di Michaelis-Menten

Smax = [v] + 0 K

SmK = costante di Michaelis-Menten

mV = velocità iniziale

oV = velocità allo stato stazionario

maxv = velocità massima

La velocità di una reazione enzimatica in qualsiasi istante è determinata dal rapporto fra due costanti Km e Vmax e la concentrazione del substrato in quell'istante.

Il valore di Km è definito dalla concentrazione di substrato che dà una velocità pari alla metà della velocità massima: quando [S] = Km, v = Vmax/2.

Il significato della costante di Michaelis è che essa descrive una curva chiamata iperbole rettangolare.

Km è anche una misura dell'affinità dell'enzima per il suo substrato: se un enzima ha un piccolo valore di Km, vuol dire che raggiunge la massima efficienza catalitica a basse concentrazioni di substrato (bassa Km = alta affinità).

La Commissione Internazionale sugli Enzimi definisce l'Unità Internazionale della

quantità che catalizza la formazione di una micromole di Enzima come prodotto in un minuto. Il numero di turnover di un enzima, Kcat, è una misura della sua massima attività catalitica. Kcat = numero di molecole di substrato convertite in prodotto per molecola di enzima per unità di tempo quando l'enzima è saturato con il substrato.

L'equazione di Michaelis-Menten descrive una curva chiamata iperbole rettangolare:

v = (Smax * [S]) / (Km + [S])

A causa della forma iperbolica del grafico di v in funzione di [S], la determinazione precisa del valore di Vmax non è possibile.

Dall'equazione di Michaelis-Menten si possono ottenere grafici lineari: prendendo i reciproci di entrambi i membri dell'equazione di M-M:

1/v = (Km / Vmax) * (1/[S]) + (1/Vmax)

Questa equazione descrive una linea retta.

Grafico dei doppi reciproci di Lineweaver-Burk:

y = (Km / Vmax) * x + (1/Vmax)

Il riconoscimento enzima-substrato e gli eventi catalitici che seguono sono fortemente

L'inibitore competonoper lo stesso sito di legame sull'enzima (sito attivo). L'aumento della [S] aumenta la probabilità che sia S a legarsi all'enzima invecedell'inibitore. Alti valori di [S] possono annullare l'effetto di I. La caratteristica di questo tipo diinibizione è che Vmax non èinfluenzata da I (tutte le rettemostrano la stessa intercettasull'asse y). Vmax è invariata, mentre Km aumenta.

INIBIZIONE REVERSIBILE: inibizione non competitiva. L'inibitore ed il substrato silegano a siti diversi dell'enzima e il legame di I non influenza illegame di S. L'inibizione non può essere superataaumentando la [S], m maxK invariata, mentre V diminuisce (diminuzione dell'enzima attivo).

INIBIZIONE IRREVERSIBILE: l'inibitore si lega irreversibilmente all'enzima (per es. con unlegame covalente). Tipo di cinetica osservata: simile all'inibizione non competitiva. La diluizione non è efficace.

a dissociare il complesso E-I e non ripristina l'attività enzimatica

Substrati suicidi: sono inibitori analoghi del substrato che si legano covalentemente all'enzima con specificità ed alta affinità. la penicillina è un inibitore irreversibile dell'enzima glicoproteina transpeptidasi che crea i legami crociati nelle catene di peptidoglicano durante la sintesi della parete cellulare batterica. La specificità è il risultato del riconoscimento molecolare. Il sito attivo dell'enzima comprende solo una parte della sua struttura, una speciale tasca complementare alla struttura del substrato.

Adattamento indotto: il complesso cataliticamente attivo enzima-substrato è una struttura interattiva. La forma del sito attivo dell'enzima si modifica in seguito al legame di S. L'enzima induce il substrato ad adottare una forma che mimi lo stato di transizione della reazione processo di riconoscimento dinamico fra E e S.

Controllo

dell'attività enzimatica:

1. accumulo del prodotto (dimin. velocità di sintesi di P)
2. disponibilità del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente reversibile/irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici

4. Modificazioni covalenti reversibili:

• Fosforilazione
• Adenilazione
• Uridililazione
• ADP-Ribosilazione
• Metilazione Fosforilazione

Gli enzimi regolati mediante modifiche covalenti sono chiamati enzimi interconvertibili.

Modificazioni covalenti irreversibili:

• Proteolisi (zimogeni)
• insulina
• enzimi proteolitici del tratto digestivo
• L'attivazione proteolitica del chimotripsinogeno
• coagulazione del sangue

Controllo dell'attività enzimatica:

1. accumulo del prodotto
2. disponibilità del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente reversibile/irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici

Gli isozimi della lattato deidrogenasi (M) 4

Numerosi enzimi esistono in più strutture.

quaternarie che differiscono nelle proporzioni di associazione di due subunità A e B.

Enzimi di interesse clinico che si presentano in forme multiple:

• Enzima Lattico deidrogenasi (infarto del miocardio, epatite virale)
• Isocitrico deidrogenasi (epatiti virali)
• Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (anemia)
• Glutammico deidrogenasi (affezioni epatiche)
• Aspartico transaminasi (infarto del miocardio)
• Creatina chinasi (indice di infarto e distrofia muscolare)
• Acetilcolinesterasi (anestesia)
• Colinesterasi (indice di funzionalità epatica)
• Fosfatasi alcalina (affezioni epatiche e dell'app. scheletrico)

Fattori che influenzano le attività enzimatiche nel plasma negli stati patologici:

• l'organo o il tessuto interessato dalla malattia
• la natura della lesione
• la distribuzione degli enzimi nel tessuto interessato
• effetti secondari su altri organi
• la velocità del rilascio dell'enzima da parte delle cellule danneggiate
• la scomparsa

dell'enzima dal circolo sanguigno• Controllo dell'attività enzimatica

1. accumulo del prodotto
2. disponibilità del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente reversibile/irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici

La proteina chinasi AMP ciclico dipendente (PKA)

Controllo dell'attività enzimatica

1. accumulo del prodotto
2. disponibilità del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente reversibile/irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici

Enzimi allosterici: la loro cinetica non obbedisce all'equazione di Michaelis-Menten

Grafico sigmoide di V in funzione di [S]

Il modello della regolazione enzimatica: la glicogeno fosforilasi

1. In condizioni normali, l'attività di questo enzima nel muscolo è regolata allostericamente da metaboliti che riflettono lo stato energetico cellulare (AMP, ATP, glucosio 6 fosfato)
2. In caso di stress

L'adrenalina stimola una cascata di reazioni che culminano nella fosforilazione (attivazione) dell'enzima fosfoglucomutasi.

La reazione della fosfoglucomutasi fornisce energia per la contrazione muscolare:

• muscolo: il glucosio viene esportato agli altri tessuti
• fegato: il dimero della struttura del monomero glicogeno della glicogeno fosforilasi

Curve di v in funzione di [S] per la glicogeno fosforilasi:

b) L'ATP è un inibitore a feed-back che influenza l'attività dell'enzima per il substrato.

c) L'AMP è un effettore eterotropico positivo; si lega allo stesso sito dell'ATP (in competizione) ed influenza l'affinità dell'enzima per il substrato.

Livelli significativi di AMP indicano che lo stato di energia della cellula è basso e che dovrebbe essere prodotta più energia (ATP).

I cambiamenti nelle concentrazioni cellulari di ATP e AMP e la loro competizione per il legame allo stesso sito con effetti opposti assicurano che la produzione

1. Meccanismo della modifica covalente e della regolazione allosterica della glicogeno fosforilasi
2. La fosforilazione causa nella fosforilasi un drastico cambiamento conformazionale

MECCANISMI DI AZIONE DEGLI ENZIMI

I tipi di meccanismi catalitici utilizzati dagli enzimi sono staticlassificati come:

1. Catalisi acido - basica
2. Catalisi covalente
3. Catalisi favorita da ioni metallici
4. Catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento

La catalisi acido-basica (presente in quasi tutte le reazioni enzimatiche) cambia il pH. Esistono 2 tipi di catalisi acido-basica:

1. Catalisi acido-base specifica: gli ioni H o OH accelerano la reazione (la concentrazione del tampone non ha alcun effetto sulla reazione)
2. Catalisi acido-base generale: un acido o una base,
   diversi da H₂O₂ o OH^- -accelerano una reazione (il tampone può