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quanto l’alcool deidrogenasi ha alta affinità per l’etanolo ma molto bassa per il metanolo; di

conseguenza in presenza di un eccesso di etanolo la deidrogenasi preferenzialmente ridurrà NAD

utilizzando l’idrogeno dell’etanolo anziché del metanolo che non potendo essere ossidato verrà

eliminato con le urine.

3) CONCENTRAZIONE DEI COFATTORI

E’ ovvio che una ridotta disponibilità di coenzimi o difficoltà dell’enzima a legarsi al proprio

gruppo prostetico si risolverà in una ridotta capacità catalitica dell’enzima. Il principale regolatore

della disponibilità di cofattori è la dieta in quanto l’uomo non è capace di sintesi delle vitamine o ne

forma i precursori ma non è in grado di convertire questi in vitamina (Provitamina D) oppure

necessita del precursore della vitamina che gli è fornito dall’esterno e quindi converte questo

precursore in vitamina (Provitamina A: alfa e beta carotene convertiti a livello intestinale ed epatico

in vitamina attiva). Ne consegue che una dieta carente di vitamine, in particolare del gruppo B, si

associa a deficit di attività dell’enzima in cui la vitamina è parte come componente del cofattore.

Es: la malattia beri-beri per deficit di vit. B1, la pellagra per deficit di niacina, la scorbuto per

deficit di vit. C.

4) CONCENTRAZIONE IDROGENIONICA

L’effetto del pH sulla velocità della reazione enzimatica è strettamente correlato con la natura

protidica dell’enzima ed in particolare alla presenza sulla proteina enzimatica di cariche elettriche

portate dalle catene laterali degli aminoacidi a loro volta responsabili della struttura terziaria della

proteina e spesso anche di quella quaternaria. Come conseguenza vi sarà per ogni enzima un

particolare valore di pH al quale l’enzima raggiunge la conformazione più idonea ad interagire con

il substrato. Inoltre, laddove il substrato sia ionizzabile, il suo grado di ionizzazione potrà renderlo

più o meno idoneo ad interagire con l’enzima.

La curva della velocità della reazione in funzione del pH è normalmente una curva a campana in cui

il picco segnalerà il valore di pH a cui l’attività dell’enzima è massima; questo valore viene definito

pH ottimale dell’enzima nei riguardi di un determinato substrato. Per gli enzimi dei tessuti animali

il pH ottimale è intorno alla neutralità e coincide da vicino con il pH fisiologico intracellulare ed

extracellulare; fanno eccezione alcuni enzimi in particolare la pepsina, proteasi presente nel lume

gastrico che è attiva ottimalmente intorno a pH 1.2-2, pH caratteristico del succo gastrico; la

tripsina anche questa presente nel canale digerente in particolare attiva nel duodeno, che ha un pH

ottimale intorno ad 8. Queste differenze sono preordinate ad avere enzimi che lavorano

elettivamente in definiti e differenti segmenti del canale digerente. Di solito il pH ottimale copre un

range ristretto di valori di pH, a destra ed a sinistra del quale l’attività va rapidamente a zero. Una

eccezione è rappresentata dalla amilasi salivare che agisce in modo pressocchè ottimale fra pH 4.5 e

9, ambito che permette di resistere al progressivo inacidimento del bolo alimentare nello stomaco.

Gli enzimi dei tessuti vegetali hanno sovente un pH ottimale più acido di quello dei tessuti animali e

questo vale anche per i funghi.

5) EFFETTO DELLA TEMPERATURA

La temperatura è un fattore dirimente per una reazione chimica;: un suo aumento o diminuzione

somporta accelerazione o rallentamento della velocità della reazione. Tuttavia gli enzimi sono delle

proteine ed il fattore termico influenza moltissimo la loro conformazione potendo modificarla fino

al punto da distruggere irreversibilmente le caratteristiche naturali (denaturazione). Di conseguenza

la curva della cinetica della reazione enzimatica sarà asimmetrica, in quanto ci sarà un aumento

progressivo fino ad un valore in gradi centigradi intorno a 30-37 con una rapida caduta oltre i 40

gradi ed annullamento totale intorno ai 60 gradi. Di solito un aumento di 1 grado porta au un

aumento della velocità della reazione del 10% ed un aumento di 10 gradi un raddoppio. Esistono

tuttavia enzimi attivi ancora a 100 gradi localizzati nei batteri termofili; inoltre in generale gli

enzimi dei tessuti vegetali sono maggiormente resistenti alle temperature elevate rispetto agli

enzimi dei tessuti animali. La denaturazione degli enzimi con il calore ha trovato largo impiego nei

 o

processi tecnologici di conservazione degli alimenti. La pastorizzazione (T 70-80 C) ha lo scopo

 o

di inattivare gli enzimi dei microrganismi patogeni; la sterilizzazione (T <120 C) ha lo scopo di

distruggere ogni forma vivente compresi i batteri termofili esporigeni. La surgelazione ha uno scopo

simile rallentando tutte le reazioni enzimatiche di eventuali microorganismi patogeni e allo stesso

tempo di preservare le qualità organolettiche dei cibi stessi.

6) EFFETTORI: effetto degli inibitori sulla attività dell’enzima

Una delle funzioni dei farmaci è quella di rallentare od annullare una patologia in corso ricorrendo a

molecole naturali o di sintesi (chemioterapia). Spesso il ruolo primario di queste molecole è quello

di andare a colpire la causa primaria della patologia andando ad interagire con la funzionalità di

determinati enzimi ora sminuendola ora esaltandola. Individuare in qual modo il farmaco agisce

sull’enzima è quindi di notevole interesse nel campo farmacologico e clinico.

Gli effettori degli enzimi possono essere attivatori od inibitori. La attenzione dei ricercatori si è

appuntata soprattutto sui secondi, perché di più facile individuazione; tuttavia le conoscenze sul

meccanismo d’azione di questi sono alla base delle conoscenze sui primi poiché le leggi che

governano gli uni valgono anche per gli altri.

L’inibizione può essere fondamentalmente di due tipi (e di conseguenza gli inibitori si possono

raggruppare in due classi): reversibile ed irreversibile. Quest’ultima prevede che l’enzima rimanga

permanentemente inibito anche dopo allontanamento dell’effettore; è di solito indipendente dalla

concentrazione del substrato e si instaura in tempi relativamente lunghi; inoltre dà luogo alla

generazione di una nuova molecola che avrà proprietà sue del tutto differenti dall’enzima nativo.

Nel caso dell’inibizione reversibile, che è il più frequente in vivo, l’allontanamento dell’inibitore

comporta il ricupero pieno dell’attività; inoltre il fenomeno di inibizione si instaura assai

rapidamente Nell’ambito della inibizione reversibile l’inibitore può lavorare in competizione con il

substrato od indipendentemente da questo. Pertanto possiamo formulare la seguente classificazione:

inbitori irreversibili. Esempi di inibitori irreversibili sono il cianuro nei riguardi di enzimi che

1) portano um metallo pesante al centro di una struttura ciclica (citocromo ossidasi ed emoglobina

per quanto concerne il legame con l’ossigeno) oppure come metallo singolo legato direttamente

alla proteina (es. la xantinaossidasi che è un metallo protide legante ferro e molibdeno); in ogni

caso tuttavia il cianuro si lega al ferro solo se trivalente. Tuttavia il cianuro non è specifico per

questo tipo di legame potendo derivatizzare gruppi tiolici ed aldeidici presenti sui cofattori

legati all’enzima o sul substrato per formare la cianidrina corrispondente. Esempi di inibitore

irreversibile sono ancora: l’acido monoiodocetico, la monoiodoacetamide che derivatizzano in

modo irreversibile ed abbastanza selettivo gruppi tiolici (difiniamo così enzimi tiolici quelli che

portano gruppi SH reattivi riferibili alla presenza di uno o più residui di cisteina; alchilfosfati,

tra cui diisopropilfluorofosfato, fenilmetil solfonilfluoruro (PMSF), che derivatizzano gruppi

alcoolici in particolare quelli portati da serina (definiamo questi enzimi serina enzimi; esempi

sono la acetilcolinesterasi responsabile della degradazione del neurotrasmettitore acetilcolina, la

colinesterasi, molte proteasi del canale digerente, tripsina, chimotripsina, elastasi, e le proteasi

coinvolte nella coagulazione del sangue, tra cui si possono ricordare trombina, fattore X attivo,

fattore VII attivo ed altri.

inibitori reversibili di tipo competitivo e non competitivo, dove per competizione si intende

2) quella svolta dall’inibitore sul substrato nei riguardi del legame con l’enzima. Nel primo caso

inibitore non competitivo, l’inibitore ed il substrato non possono coesistere sull’enzima ed in

particolare sul suo sito catalitico; inoltre a concentrazioni crescenti di substrato l’inibizione

progressivamente verrà rimossa e tanto più quanto più elevata è l’affinità dell’enzima per il suo

substrato e quindi quanto più piccola è la Km dell’enzima per quel substrato. Nel secondo caso

questa coesistenza è possibile ma le proprietà catalitiche dell’enzima sono tuttavia

compromesse. Ne consegue che la presenza dell’inibitore sull’enzima, pur in mancanza di un a

diretta interazione dell’inibitore con il sito catalitico, induce delle modificazioni

conformazionali della molecola enzimatica che si risolvono in un danno per le proprietà

strutturali del sito attivo. Pertanto, con un inibitore competitivo la velocità massimale della

reazione verrà comunque raggiunta seppure con concentrazioni di substrato più elevate rispetto

a quelle in assenza di inibitore, il parametro che invece sarà alterato sarà la Km che in ogni caso

sarà aumentata. Nel secondo caso, un inibitore non competitivo, la Km di solito non è alterata,

mentre la velocità massimale è ridotta. Esempi di inibitore competitivo sono: 1) gli acidi

dicarbossilici malico, maleico, malonico, ossalacetico nei riguardi della succinatodeidrogenasi

che utilizza come substrato l’acido succinico; con questo gli inibitori condividono il radicale –

CH-COOH; il fruttoso nei riguardi della saccarasi che utilizza come substrato il saccaroso; il

glucoso nei riguardi di alcune disaccaridasi intestinali attive su maltoso, isomaltoso e lattoso.

Altro esempio è fornito da un gruppo di farmaci noti come sulfamidici, derivati dell’amide

dell’acido p-amino-benzensolfonico, che vengono somministrati in molti casi di infezioni

provocate da ceppi batterici per inibirne la crescita. La base strutturale di questi farmaci è

rappresentata da derivati dell’acido p-aminobenzoico (PABA) che costituisce un fattore

indispensabile per la crescita di molti ceppi batterici e che noi assumiamo sotto forma di acido

folico, vitamina del gruppo B, prodotto sia dai batteri della flora intestinale sia dalle piante.

Questi sulfamidici assunti entrano in competizione con il PABA prodotto dal microrganismo

infettante ed in tal modo ne rallentano la riproduzione e quindi la aggressività. Quali esempi di

inibitore reversibile non competitivo si possono ricordare: 1) p-cloromercuribenzoato nel

riguardi di enzimi tiolici sui quali l’inibitore riconosce un singolo gruppo SH, l’acido

ortoiodosobenzoico che riconosce due gruppi SH sufficientemente vicini per formare un

disolfuro; i derivati dell’ arsenico trivalente tra cui la clorovinildicloroarsina (Cl-CHCH-As-

Cl ) usato come aggressivo chimico nella prima guerra mondiale il cui effetto può in parte

2

essere prevenuto dal dimercaptopropanolo (CH SH-CHSH.CH OH).

2 2

Nell’ambito della inibizione reversibile esiste ancora l’inibizione incompetitiva che si verifica

3) quando l’inibitore è attivo sul complesso enzima-substrato: in questo caso sono alterate sia la

V , sia la Km.

max

Modulazione allosterica. Questo tipo di modulazione dell’attività enzimatica, che può risolversi

4) in attivazione od inibizione, si può ricondurre all’azione reversibile di un modulatore i cui effetti

possono essere attivanti od inibitenti. Al riguardo l’azione del modulatore, che è mirata in ogni

caso a modificare il sito catalitico, può comportare una variazione della Km, senza variazione

della V o viceversa non dà variazione della prima ed altera la seconda. Sotto questo aspetto

max

questi modulatori mimano l’effetto di inibitori reversibili di tipo competitivo e non competitivo,

anche se il loro meccanismo d’azione è notevolmente diverso da quello dell’inibitore

competitivo e non competitivo. Su questa base gli enzimi allosterici sono suddivisi in due classi:

classe K e classe M. Gli enzimi soggetti a regolazione allosterica sono caratterizzati dall’esistere

in stati conformazionali differenti ed interconvertibili e nella maggior parte dei casi si tratta di

proteine polimeriche. Su di essi è possibile individuare per ogni subunità solitamente almeno

due siti, l’uno catalitico e l’ altro situato di norma lontano dal sito catalitico. Quest’ultimo è il

target del modulatore che legandosi ne modifica la conformazione a sua volta responsabile di

modificazione strutturale dell’intera subunità e quindi anche del sito catalitico che insiste su di

essa. Di interesse i modulatori allosterici sono frequentemente di massa molecolare piccola,

sovente prodotti all’interno di vie metaboliche e frutto di stimoli nervosi od ormonali. Come

esempio: supponiamo di avere un enzima formato da due subunità che oscillano entrambi fra

due forme conformazionali di diversa attività dipendendo dalla concentrazione di determinati

metaboliti prodotti dalla cellula. Se un metabolita allosterico ad azione attivante si lega ad un

sito di modulazione, l’enzima sarà più attivo perché il sito attivo per la presenza del modulatore

è in grado di legare più molecole di substrato rispetto alla condizione in assenza del modulatore

(modulazione positiva). Se però un secondo metabolita ad azione inibente si porta ad un altro

sito o scalza il modulatore positivo, allora l’enzima assumerà una conformazione diversa meno

idonea alla catalisi e la reazione procederà con velocità minore. In questi casi la attività

dell’enzima non dipenderà tanto dalla concentrazione del substrato quanto piuttosto dalla

presenza dell’effettore. In presenza del modulatore allosterico la curva di attività in funzione

della concentrazione del substrato assumerà un andamento sigmoide rispetto alla forma di

iperbole rettangola, e si sposterà verso destra o verso sinistra a seconda che il modulatore sia di

tipo inibente od attivante. L’interpretazione dell’andamento sigmoide della curva velocità della

reazione-concentrazione del substrato implica l’introduzione del concetto di cooperatività. Per

cooperatività si intende l’influenza che un effettore che si è legato ad una subunità proteica

esercita su legame ad un’altra subunità di una nuova molecola di effettore, rendendo questo

legame più proficuo (cooperatività positiva) o meno proficuo (cooperatività negativa). Esempi

di modulatori allosterici sono: il fruttoso-2,6-bisfostato nei riguardi della fosfofruttosocinasi e

della fruttosobisfosfatasi, AMP nei riguardi della glicogeno fosforilasi b ed a, il glucoso-6-

fosfato ed ATP nei riguardi della glicogeno fosforilasi b ed il glucoso nei riguardi della

glicogeno fosforilasi a, l’ATP ed il citrato nei riguardi della fosfofruttosocinasi 1 (PFK1) b. Uno

dei meccanismi più intensamente sfruttati dalla cellula per modificare in modo rapido e

reversibile la velocità di una reazione enzimatica consiste nell’indurre una modificazione

conformazionale covalente dell’enzima attraverso processi di fosforilazione e defosforilazione

frequentemente a carico di residui di serina, treonina o tirosina, più raramente di istidina ed

aspartato. Quali esempi si possono ricordare la glicogeno fosforilasi, la glicogeno sintasi, acetil

CoA carbossilasi, la fruttoso-1,6-bisfosfato fosfatasi ed altri che via via verranno incontrati nei

processi metabolici. Per spiegare il comportamento gli nzimi allosterici sono state formulate

delle teorie di cui le due più accreditate sono il modello a modificazione concertata di Monod,

Weiman e Changeux, ed il modello a modificazione sequenziale di Koshland.

INIBITORI SUICIDI: Costituiscono una classse di inibitori del tutto particolare che raggruppa

5) composti sovente mimanti la formula chimica del substrato, che vengono riconosciuti

dall’enzima ed eventualmente modificati, ma il cui prodotto di reazione rimane sull’enzima

impedendo a successive molecole di substrato di inserirsi. Es. l’acido monofluorocitrico nei

riguardi della aconitasi.

Gli effetti di inibitori reversibili ed irreversibili sulla catalisi enzimatica si possono illustrare in

modo molto comprensivo con diagrammi detti di Linewear-Burk o anche dei doppi reciproci.

Questi diagrammi derivano dalla trasformazione dell’equazione di Michaelis-Menten in cui i valori

di [S], V e V sono riportati in grafico come reciproci 1/[S], 1/V ed 1/V con il vantaggio che la

0 max 0 max

curva iperbole rettangola ad andamento asintotico si trasforma in una retta che taglia l’asse della y

per un valore di 1/V e l’asse della x per un valore sul lato negativo pari a 1/Km. L’effetto di un

max

inibitore competitivo, non competitivo ed incompetitivo sarà quindi prontamente visibile perché la

retta nel primo caso taglierà l’asse della x per un valore negativo più grande, lasciando 1/V max

invariata, nel secondo caso non modificherà il valore 1/Km mentre il valore 1/V sarà più elevato,

max

nel terzo caso entrambi i valori di 1/Km ed 1/V saranno più elevati e la retta correrà parallela alla

max

retta del sistema non inibito, ma taglierà l’asse delle y per un valore di 1/V più alto, e l’asse delle

max

x per un valore negativo di 1/Km più elevato.

MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA

Come abbiamo accennato in precedenza uno dei fattori che regolano la velocità della reazione

enzimatica è la concentrazione dell’enzima. Nella cellula gli enzimi sono in quantità molto bassa e

ciò vale in particolare per enzimi definiti come regolatori della, o limitanti la velocità di un’intera

via metabolica. Ne consegue che laddove ci sia disponibilità di substrato l’aumento della

concentrazione di un enzima, cioè indurne ex-novo la sintesi, si risolverà in aumento della velocità

della reazione catalizzata da quell’enzima e quindi del processo metabolico a cui l’enzima afferisce.


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DETTAGLI
Esame: Biochimica
Corso di laurea: Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cecilialll di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Rinaudo Maria Teresa.

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