Biochimica del metabolismo

GLICOLISI

La glicolisi è suddivisa in 10 tappe che portano alla degradazione del glucosio con la formazione di 2

ossidazione del

molecole di piruvato, sintesi di ATP e produzione di molecole di NADH. La completa

glucosio a CO e acqua procede con una variazione di energia libera standard di circa -2840 kJ/mol.Il

2

glucosio è costituito da 6 atomi di carbonio.

-il glucosio può essere ossidato tramite glicolisi per ottenere piruvato

-può essere depositato e stoccato sotto forma di glicogeno in caso di eccessi nel nostro organismo di

glucosio

-può subire un’altra via di ossidazione ovvero quella dei pentosi fosfati (necessario per produrre il

ribosio 5-fosfato che è coinvolto nella sintesi di acidi nucleici e formazione di NADPH usato nei

processi biosintetici riduttivi)

-può inoltre essere il precursore di polimeri strutturali di matrice extracellulare e polisaccaridi della

parete cellulare

La glicolisi è una via metabolica, rappresenta il paradigma di tutte le vie metaboliche e si compie

all’interno del citosol cellulare, ed è un processo ANAEROBICO dove i passaggi principali possono

avvenire in assenza di ossigeno. La glicolisi è organizzata in 10 tappe.

Nella glicolisi una molecola di glucosio viene degradata mediante una serie di reazioni enzimatiche,

che producono due molecole di piruvato, un composto a tre atomi di carbonio In tutto sono

necessarie dieci reazioni catalizzate da enzimi citosolici, le prime cinque delle quali costituiscono la

fase preparatoria (con dispendio di energia), mentre nelle successive cinque si ha la fase di recupero

energetico (con produzione di energia).

La reazione complessiva è: Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2Piruvato + 2NADH + 2H+ + 2ATP +

2H O.

2

Il principale prodotto della via glicolitica ovvero il piruvato è molto versatile.

Nella maggior parte dei tessuti quando l’ossigeno è abbondante, ci troviamo in condizioni

aerobiche, il piruvato viene ossidato con la perdita del gruppo carbossile sotto forma di CO e l’unità

2

costituita dai due carboni rimanenti diventa il gruppo acetile dell’Aceti coenzima A. Il gruppo acetile

viene metabolizzato e ossidati all’interno del ciclo degli acidi tricarbossilici andando a produrre CO 2.

Alternativamente in assenza di ossigeno, in condizioni anaerobiche, il piruvato può essere ridotto a

lattato attraverso l’ossidazione del NADH a NAD ed è un processo che prende il nome di

fermentazione lattica, quando si compie un’intensa attività fisica e non si ha più glucosio da bruciare,

viene ridotto il piruvato a lattato. Invece nei microorganismi come il lievito della birra e in alcuni

tessuti delle piante il piruvato può essere ridotto a etanolo, il NADH a NAD, il processo è noto come

fermentazione alcolica.

LA VIA DELLA GLICOLISI: le 10 tappe vengono distinte in 2 fasi. La prima fase comprende la scissione

del glucosio in 2 molecole di gliceraldeide-3-fosfato, la seconda fase comprende le ultime fasi che

trasformano le 2 molecole di gliceraldeide-3-fosfato in 2 molecole di piruvato. La prima fase definita

anche di consumo energetico, infatti vi è la fosforilazione del glucosio e conversione in 2 molecole di

gliceraldeide-3-fosfato e vengono consumate 2 molecole di ATP. Mentre la seconda fase definita

anche di recupero energetico, dove vengono sintetizzate 2 molecole di ATP per ogni molecola di

gliceraldeide-3-fosfato che viene convertita in piruvato, ciò significa che vengono generate 4

molecole di ATP e il bilancio energetico netto è la sintesi di 2 molecole di ATP. Queste due fasi sono

portati avanti in maniera più o meno simile sia nei microrganismi, sia nelle piante, sia negli animali

incluso nell’ uomo; però la velocità di queste singole reazioni e il meccanismo attraverso cui queste

sono regolate vanno a differire di specie in specie.

Vi sono valori di ΔG reali che sono diversi rispetto alle

condizioni standard. Le concentrazioni allo stato

stazionario dei metaboliti della glicolisi molto spesso

non rispecchiano le condizioni cellulari reali, ciò fa si

che i valori di G reali calcolati risultano essere

Δ

diversi. La glicolisi rilascia solo una piccola parte dei -

2840 kJ/mol perché comporta una variazione di

energia libera standard di soli -85 J/mol. La maggior

parte dell’energia del glucosio si trova all’interno del

piruvato e deve essere estratta nei successivi processi

metabolici, ovvero ciclo di Krebs e fosforilazione

ossidativa.

Tutti gli intermedi glicolitici sono fosforilati, poiché il gruppo fosforico può avere tre funzioni utili:

1. Conferisce impermeabilità alla membrana plasmatica: il glucosio rappresenta una molecola

neutra e quindi potrebbe diffondersi nella membrana, ma la fosforilazione va nella prima tappa a

porre una carica negativa sul glucosio e la membrana risulta essere impermeabile.

2. Permette di conservare l’energia metabolica (legami ad alta energia): la fosforilazione mantiene il

substrato all’interno della cellula, quindi gli intermedi glicolitici fosforilati non possono più uscire

dalla cellula e dopo la fosforilazione non è necessaria altra energia per tenere i componenti

fosforilati.

3. Riduce l’energia di attivazione ed aumenta la specificità della reazione enzimatica: il legame del

gruppo fosforico al sito attivo di un enzima produce un’energia di legame che contribuisce ad

abbassare l’energia di attivazione e va ad aumentare la specificità della reazione catalizzata data

dall’enzima. L’energia rilasciata dai legami fosfoanidrici dell’ATP viene conservata per la formazione

degli esteri fosforici come il glucosio-6-fosfato, i composti fosforilati ad alta energia che si formano

all’interno della glicolisi donano i loro gruppi fosforici all’ATP e vanno a formare del nuovo ATP.

Tappa 1: Prima reazione d’innesco

Coinvolge la fosforilazione del glucosio sul C-6 con formazione di glucosio 6- fosfato, catalizzata

dall’esochinasi o gluconasi. L’esochinasi è una transferasi, che ha bisogno di ioni Mg2+ per la sua

attività catalitica e va incontro ad un adattamento dovuto al legame con il glucosio. Il vero substrato

è il magnesio ATP (complesso del magnesio con l’ATP). La reazione è termodinamicamente sfavorita

e per avvenire richiede un apporto energetico, dunque l’energia necessaria viene fornita dall’ATP

quindi c’è un consumo di energia, il che è controproducente perché la glicolisi fornisce energia e non

la consuma. Però la reazione dell’esochinasi è considerata una reazione d’innesco, dunque un

dispendio di energia necessario per far sì che tutte le altre reazioni avvengano.

Nell’uomo esistono 4 diversi isozimi (I – IV), di cui l’esochinasi IV (o glucochinasi) degli epatociti ha

proprietà cinetiche e di regolazione peculiari, con importanti implicazioni fisiologiche. L’esochinasi 1

è la principale forma presente nel cervello, l’esochinasi di tipo 1 e 2 si ritrova al livello del muscolo

scheletrico. Gli isozimi animali sono inibiti dal prodotto cioè dal glucosio-6-fosfato, che inibiscono

l’attività esochinasica fino a quando il consumo attraverso la glicolisi ne abbassa la concentrazione.

L’isozima 4 dell’esochinasi, chiamato anche glucochinasi, si trova nel fegato e nel pancreas. Questo

isozima è specifico per il D-glucosio e presenta una K molto maggiore per il glucosio, inoltre

m

l’isozima 4 non viene inibito dal suo prodotto. Quando i livelli di glucosio sono elevati, il glucosio

viene convertito subito in glucosio 6-fosfato e immagazzinato nel fegato come glicogeno. La

glucochinasi ha la caratteristica di essere un enzima inducibile, la sua quantità presenta nel fegato è

controllata dall’insulina. Infatti, chi soffre di diabete mellito ha valori bassi di insulina e glucochinasi

ma alti livelli di glucosio. Ecco perché prima di ogni pasto subiscono un’iniezione di insulina che fa

produrre glucochinasi e far sì che i livelli di glucosio assunti nel pasto diminuiscano. Dal punto di vista

strutturale l’esochinasi è presente in un’unica forma cioè un monomero a due lobi di 50kDALTON.

Il glucosio 6-fosfato risulta impermeabile alla membrana cellulare, inoltre la conversione del glucosio

a glucosio 6-fosfato mantiene la concentrazione intracellulare di glucosio ad un livello basso, ciò

permette la diffusione facilitata del glucosio dall’esterno verso l’interno della cellula e inoltre il

passaggio è termodinamicamente favorito. Il glucosio è mantenuto all'interno della cellula dalla

fosforilazione a glucosio 6- fosfato, che non può attraversare facilmente la membrana plasmatica.

IL GLUCOSIO 6-FOSFATO RAPPRESENTA UN PUNTO DI RAMIFICAZIONE, questo metabolita può

intraprendere diverse strade:

1) la via dei pentoso fosfato

può essere trasformato in glucosio-1-fosfato, che a sua volta rappresenta il precursore nella

2.a)

sintesi del glicogeno, ovvero della principale fonte di energia immagazzinata nel fegato e nei muscoli.

dal glucosio-1-fosfato si può ottenere il glucuronato, fondamentale nella sintesi dei carboidrati.

2.b)

Tappa 2: la fosfoglucoisomerasi catalizza l’isomerizzazione del glucosio-6-fosfato

Conversione reversibile del glucosio 6-fosfato(aldoso) a fruttosio 6-fosfato(chetoso), catalizzata dalla

fosfoesosio isomerasi (detto anche fosfoglucosio isomerasi o glucosio fosfato isomerasi). Avviene

una reazione di isomerizzazione poiché il fruttosio è una molecola più simmetrica rispetto al glucosio

6-fosfato, infatti questa simmetria sarà massima quando ci sarà la seconda fosforilazione catalizzata

dalla fosfofruttochinasi e quindi si avrà una molecola assolutamente simmetrica. La reazione

d’isomerizzazione è fondamentale, per consentire le tappe successive della glicolisi a carico di un

esosio più simmetrico e divisibile in due unità a tre atomi di carbonio. La fosfoglucosio isomerasi

richiede del Mg per poter essere attivata. La fosfoglucosio isomerasi al di fuori delle cellule animali

2+

presenta una seconda funzione ovvero fattore della crescita nervosa, infatti è nota anche come

neuroleuchina ed è secreta dalle cellule T del sistema immunitario e promuove la sopravvivenza di

alcuni neuroni spinali e alcuni nervi sensoriali. La fosfoglucosio isomerasi viene secreta dalle cellule

tumorali perché stimola la migrazione di cellule cancerose oppure nota come fattore di

differenziazione e maturazione e promuove il differenziamento di alcune cellule leucemiche. La

fosfoglucosio isomerasi sembra possa creare danni a causa di questo tipo di secrezione, può essere

dannosa dall’organismo stesso. Si è visto in studi dell’artrite reumatoide come la fosfoglucosio

isomerasi rappresenti un antigene per l’organismo stesso, viene dunque riconosciuto come not-self.

Tappa 3: Seconda reazione d’innesco

Fosforilazione del fruttosio 6-fosfato a fruttosio 1,6-bisfosfato, catalizzata dalla fosfofruttochinasi-1

(PFK-1). Questa è la prima reazione “di comando” della via glicolitica, poiché il fruttosio 1,6-

bisfosfato è un intermedio esclusivo della glicolisi, a differenza degli intermedi precedenti che

possono avere destini metabolici alternativi. L’azione della fosfoglucosio isomerasi ha spostato il

gruppo carbonilico (C=O) da C1 a C2, creando una nuova funzione alcolica; il passaggio successivo è

andare a fosforilare questo gruppo carbonilico da parte della fosfofruttochinasi. Il substrato che

fornisce il gruppo fosfato è rappresentato dall’ATP

È una reazione endoergonica perché il valore di intorno ai 16,3 kJ/mol, ma quando viene

ΔG

accoppiata con il trasferimento del fosfato dall’ATP la reazione completa diventa esoergonica e

quindi si ha una reazione spostata verso destra. Questa reazione impone alla cellula di assumere, di

metabolizzare il glucosio piuttosto che convertirlo in un altro zucchero o di andarlo a metabolizzare.

La fosfofruttochinasi (PFK-1) è soggetta ad una complessa regolazione allosterica:

•viene attivata dalla diminuzione di ATP o dall’accumulo di prodotti d’idrolisi di ATP ed ADP e

(soprattutto) dall’AMP. Un'altra molecola che va a regolare l’azione della PFK è il fruttosio 2,6-

bisfosfato (quest’ultimo è un potente mediatore della regolazione ormonale di glicolisi e

gluconeogenesi)

•viene inibita dall’aumento di ATP e di citrato. Il citrato è il primo intermedio del ciclo di Krebs ed è

anche un inibitore allosterico della PFK, ciò dipende dallo stato energetico della cellula. Quando il

ciclo dell’acido citrico raggiunge un livello di saturazione, la glicolisi (che va ad aumentare il ciclo

dell’acido citrico) rallenta e fornisce i precursori delle vie biosintetiche. Il citrato inibendo la glicolisi,

assicura che il glucosio non venga utilizzato per altri tipi di attività.

L’ATP rappresenta oltre un substrato anche un inibitore allosterico dell’enzima, infatti la PFK

presenta due siti per l’ATP: un sito ad alta affinità per il substrato e un sito regolatorio a bassa

affinità questo perché quando vi è un’alta concentrazione di ATP, la PFK si comporta in maniera

cooperativa, dunque la glicolisi deve spegnersi, inibendo la PFK diminuisce l’affinità dell’enzima per il

suo substrato (fruttosio 6-fosfato). Un altro regolatore del funzionamento della PFK è l’AMP che

inverte l’inibizione dovuta all’ATP. I livelli di AMP aumentano quando diminuiscono i livelli di ATP, ciò

è dovuto all’azione della chinasi, i livelli di ADP sono rispettivamente il 10% rispetto all’ATP e i livelli

di AMP sono l’1% della concentrazione di ATP. L’AMP attiva il processo della PFK.

REGOLAZIONE DELLA FOSFOFRUTTOCHINASI (PFK)

(FIGURA 18.9) Le curve dei grafici sono sigmoidee, la K per il fruttosio 6-fosfato tende ad

m

aumentare. Al livello cellulare però la concentrazione di ATP non varia tanto infatti se si misura la

concentrazione di ATP nel muscolo in fase di allenamento è solo del 10% inferiore alla

concentrazione di ATP quando il muscolo è in fase di riposo. Nonostante ciò, la velocità della glicolisi

varia.

All’aumentare della concentrazione del fruttosio 2,6-bisfosfato aumenta la velocità dell’enzima

stesso (PFK), viene fissato un determinato valore del substrato per poter fare il confronto con gli altri

grafici. (FIGURA 18.10)

Mentre nell’altro grafico (FIGURA 18.11) all’aumentare della concentrazione del fruttosio 2,6-

bisfosfato viene a diminuire l’inibizione della fosfofruttochinasi (PFK) dovuta all’ATP, sull’asse del x si

ha l’inibitore della reazione stessa (ATP) e non più il substrato, se aumenta la presenza dell’attivatore

della fosfofruttochinasi, diminuisce l’inibizione che l’ATP che genera sullo stesso enzima man a

meno che la concentrazione di fruttosio 2,6-bisfosfato tende ad aumentare.

Tappa 4: creazione di 2 intermedi a 3 atomi di C

In questa tappa avviene la scissione del fruttosio 1,6-bisfosfato in diidrossiacetone fosfato (DHAP, un

chetosio) e gliceraldeide 3-fosfato (un aldosio), catalizzata dalla fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi (o

semplicemente aldolasi). La fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi crea un taglio tra C3 e C4 dando origine

al diidrossiacetone fosfato e la gliceraldeldeide 3-fosfato. Il è intorno a 24 kJ/ mol, dunque la

ΔG

reazione è positiva, non avviene spontaneamente dunque il reagente non si trasforma nei prodotti;

in realtà il valore di questa reazione che si viene a creare negli eritrociti corrisponde a -0,23

ΔG=

kJ/mol (vedi tabella), dunque a concentrazioni fisiologiche questa reazione è all’equilibrio. La

reazione è l’inverso di una condensazione aldolica reversibile, che ritroveremo anche nella

gluconeogenesi. L’enzima che interviene è un’aldolasi, in natura esistono 2 classi degli enzimi

aldolasi: i tessuti animali producono le aldolasi di classe 1, le quali sono caratterizzate dalla

formazione di una base di Schiff come intermedio covalente e si viene a formare tra il sito attivo

della lisina e il gruppo carbonilico del substrato, mentre le aldolasi della classe 2 sono prodotte

principalmente dai batteri e dai funghi. La classe 2 delle aldolasi utilizza lo ione zinco, presente nel

sito attivo dell’enzima, per stabilizzare l’intermedio enolato che si forma e porta a una polarizzazione

del gruppo carbonilico del substrato. Lo ione zinco si comporta da elettrofilo, polarizza il gruppo

carbonilico del substrato e va a

stabilizzare l’intermedio enolato

che si forma.

La base di Schiff, che si viene a

formare tra il substrato carbonilico

e il sito attivo della lisina, agisce

come una trappola elettronica

ovvero aumentando l’acidità del

gruppo β- idrossile e va a facilitare

il taglio dell’aldolasi.

Tappa 5: la trioso fosfato isomerasi completa la prima fase della glicolisi

Questo passaggio comporta l’isomerizzazione del diidrossiacetone fosfato in gliceraldeide 3-fosfato,

vi è un interconversione catalizzata dalla trioso fosfato isomerasi. Questo enzima si è evoluto verso

uno stato di perfezione catalitica, in quanto se si verifica il numero di turnover di questo enzima

risulta essere vicino al limite di diffusione. Questa conversione permette che entrambi i prodotti

della reazione dell’aldolasi possano continuare la via glicolitica. La reazione avviene tramite un

intermedio enediolo che può donare uno dei due protoni ossidrilici a un residuo basico dell’enzima,

in tal modo divenire diidrossiacetone fosfato o gliceraldeide 3-fosfato. A questo punto è stata

completa la prima fase della glicolisi, dove una molecola di glucosio è stata convertita in 2 molecole

di gliceraldeide 3-fosfa