Biochimica clinica - Le droghe

MATRICI BIOLOGICHE

URINA: è la matrice biologica di prima scelta nell’analisi delle sostanze d’abuso. Il suo

utilizzo presenta vantaggi quali: a) Prelievo non invasivo b) Possibilità di campionare

grandi volumi c) possibilità di analizzare sia le sostanze che i metaboliti anche a

diversi giorni dall’assunzione Vi è da mettere in evidenza che le analisi delle sostanze

d’abuso nelle urine possono solo dare un’indicazione della presenza o l’assenza di tale

sostanza ad un definito valore soglia, ma non danno alcuna indicazione sulla quantità

di sostanza assunta o sul momento dell’assunzione.

SANGUE può dimostrare solo una esposizione relativamente recente (poche ore dopo

l’assunzione) ed inoltre il prelievo è invasivo. Ha il vantaggio che il sangue, al contrario

dell’urina, non può essere soggetto a modificazione e/o adulterazioni.

SALIVA : Il motivo per cui viene determinato un farmaco nella saliva è che la sua

azione farmacologia dipende dalla frazione di farmaco nel plasma non legata alle

proteine seriche: questa frazione è normalmente escreta dalla ghiandola salivare nella

saliva. I vantaggi sono dati dalla possibilità di quantizzare la frazione libera del

farmaco. Gli svantaggi sono costituiti dalla necessità di tecniche analitiche sensibili per

i farmaci presenti in piccole concentrazioni, dall’alterazione della concentrazione

salivare di un farmaco nei casi di stimolazione del flusso salivare per la raccolta.

Inoltre le concentrazioni trovate non sono sempre correlabili a quelle plasmatiche e

urinarie.

CAPELLI : negli ultimi anni l’analisi dei capelli per la ricerca di farmaci e dei loro

metaboliti ha ricevuto moltissima attenzione, soprattutto a causa dei vantaggi rispetto

a liquidi biologici quali urine o siero. I farmaci e loro eventuali metabolici rimangono

all’interno del capello per un tempo indefinito, fornendo una finestra di rivelazione (da

settimane a mesi) molto più ampia rispetto a quella nel siero o urine. Inoltre, la

raccolta dei capelli è semplice, non invasiva e ripetibile per eventuali conferme sui

risultati. Il capello è una matrice stabile e molto difficile da manipolare al fine di

adulterare il contenuto. Vantaggi: monitoraggio dei farmaci assunti , non invasività

del prelievo, possibilità di differenziare consumatori leggeri, moderati e pesanti,

possibilità di individuare l’uso passato del farmaco con effetti collatelari ancora in atto,

difficoltà nell’adulterare la matrice. Svantaggi: variabilità nella cinetica di

incorporazione dei farmaci dovuta alla velocità di crescita del capello, di produzione

del sebo e del sudore, e dalla presenza di Melanina, contaminazione esterna

(detergenti per il lavaggio del capello, tinture, nicotina) , mancanza di standard di

riferimento scarsa correlazione capelli/peli pubici o ascellari a causa di crescita più

lenta e di maggior contatto con il sudore/deodorante.

TEST INIZIALI ( SCREENING ) Sono test che permettono di analizzare in tempi brevi

numerosi campioni. Il valore soglia è una definizione operativa stabilita in modo da

definire un campione negativo o positivo. E’ importante distinguere però il valore

soglia dal limite di determinazione del metodo (sensibilità) che è la più bassa

concentrazione dell’analita che può essere determinata con certezza. I metodi di

screening sono pertanto idonei a: contribuire all’accertamento dell’abuso di sostanze

stupefacenti; contribuire a valutare il grado di abuso e di tossicodipendenza;

verificare la compliance del soggetto in trattamento; contribuire ad identificare la

dose terapeutica efficace del farmaco sostitutivo; fornire informazioni preziose nelle

situazioni di emergenza. Ricordiamo che con il test di screening vengono rilevate

sostanze appartenenti a “famiglie” di stupefacenti e non la singola componente.

Sostanza Durat Emivita Presenza Cutof

a nell’urina

d’azio

ne

Amfetamine 2-4 ore 7-34 ore 3-5 giorni 1000

ng/ml

Barbiturici a sec. 1-10 giorni 300 ng/ml

del

farmac

o

Benzodiazep 4-12 2-97 ore 3-5 giorni 200 ng/ml

ine ore

Cannabinoid 2-4 ore 14-38 ore 3-30 giorni 50 ng/ml

i

Cocaina 1-2 ore 2-5 ore 3-5 giorni 300 ng/ml

Metadone 12-24 15-55 ore 3-5 giorni 250 ng/ml

ore

Oppiacei 3-6 ore 1,3 – 6,7 1-3 giorni 300 ng/ml

ore

Reattività crociata: Si tratta di un fenomeno che avviene in una reazione

immunoenzimatica quando un anticorpo reagisce con sostanze che hanno strutture

chimiche similari. L’alta sensibilità analitica dei test immunologici ha come effetto

positivo il fatto che il test è in grado di rilevare tutti i derivati di una data classe

farmacologica. Il lato negativo è la possibilità di reattività crociata tra anticorpo e

sostanze che, pur avendo la struttura chimica simile, non sono correlate alla sostanza

in esame.

Sia la tecnica RIA (radioimmunologica) sia l’ EIA (immunoenzimatica) utilizzano

come evento primario una reazione immunologica antigene anticorpo con formazione

di un immunocomplesso antigene-anticorpo la cui presenza e testimoniata da un

rivelatore che è diverso per le due tecniche. Nel caso del RIA il rivelatore è un

tracciante radioattivo nel caso dell’EIA è un enzima. L’EIA può essere classificata in

omogenea: EMIT (Enzyme Multiplied-Immunoassay Technique) l’enzima coniugato

all’antigene viene inibito (o attivato) dalla reazione immunologica o per esclusione del

substrato o per un’alterazione conformazionale dell’enzima. Il farmaco nel campione

compete con il farmaco legato all’enzima nel legarsi all’anticorpo. L’enzima non legato

è disponibile a legarsi con il substrato determinando un cambio nell’assorbimento.

Ed eterogenea: ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) che si basa

sull’assobimento dell’antigene all’anticorpo legato ad una fase solida (superficie di

provetta, pozzetto, pallina di plastica ecc.) che consente così una facile separazione

della frazione libera da quella legata, mediante lavaggio. La metodologia EIA in fase

eterogenea si differenzia poi in competitiva e non competitiva. Nella tecnica

competitiva si sfrutta sostanzialmente la competizione per i siti anticorpali fra

antigene da dosare e antigene marcato introdotto come rivelatore; in quella non

competitiva si realizza una misura diretta della concentrazione antigenica in base alla

quantità di anticorpo marcato aggiunto in eccesso.

La tecnologia FPIA (fluorescenza a luce polarizzata) si basa sul principio della

fluorescenza a luce polarizzata. Durante l’analisi ad un’aliquota di campione del

paziente si aggiunge un tracciante (composto formato dall’analita in esame

covalentemente legato al fluoroforo). L’analita presente nel campione del paziente e il

tracciante competono per legarsi ai siti di legame localizzati sull’anticorpo. Quelli che

si legano rallentano la loro velocità di rotazione perchè uniti ad una grossa molecola. Il

tracciante legato all’anticorpo continua ad essere fluorescente, ma impiega più tempo

a ruotare. Un valore di polarizzazione alto sta ad indicare che la soluzione contiene

solo una piccola quantità di analita non marcato, ossia dell’analita presente nel

campione, un valore basso indica che la soluzione contiene una grande quantità di

analita non marcato, ossia di analita presente nel campione del paziente.

La tecnica LIA (lattici ad inibizione di agglutinazione) è una tecnica

immunologica rapida a cut off. In questo caso il sistema di reazione è costituito

dall’antigene, l’anticorpo e da un mezzo rivelatore costituito da un lattice

sensibilizzato con l’antigene da determinare. In caso di presenza di antigene nel

campione, sarà questo che si legherà all’anticorpo, impedendogli di legarsi al

complesso lattice-antigene e di dar luogo alle macro-particelle. In tal caso la miscela

di reazione si presenta omogenea e lattescente ed è in questo caso indice di

positività.

Immunofluorescenza (FIA) e immunoluminescenza (LIA)

L’uso diretto di sistemi fluorescenti o luminescenti, sia da soli che abbinati a marcatori

enzimatici, sono recentemente divenuti vantaggiose alternative ai RIA, a seguito dello

sviluppo di metodi adeguati e di strumentazioni affidabili per la misurazione del