Biochimica clinica 4: enzimi del siero

Saggio della Fosfatasi Alcalina

Si esegue a 37°C, pH basico (optimum 8,6-10,3)

Il prodotto (p-nitrofenolo) è colorato di giallo

Spettrofotometro, 405 nm

L'assorbanza è proporzionale alla quantità di ALP nel campione

Gamma-glutamil transpeptidasi (GGT o γGT)

Il suo aumento è dovuto ad un danno epato-biliare (marcatore più specifico, in quanto l'ALP aumenta fisiologicamente in gravidanza). Si trova inserito in membrana plasmatica o nel reticolo endoplasmatico. Ha una funzione importante nel trasporto di amminoacidi e peptidi in forma di gamma-glutammil.

Questo enzima è coinvolto in quello che è chiamato ciclo del gamma glutammile o ciclo di Meister, che consiste nella sintesi e degradazione del glutatione. "Ma cos'è il glutatione?" viene naturale chiederselo. Il glutatione è un tripeptide particolare, in quanto è il principale antiossidante intracellulare; è formato da...

acido γ-glutammico,cisteina e glicina.

La sua particolarità è quella di presentare un legame tra acido glutammico ecisteina che coinvolge il C-γ, piuttosto che il C-α, dunque tra acido glutammico ecisteina non si forma un legame di natura peptidica. Questa caratteristica rende ilglutatione resistente alle proteasi. Inoltre il glutatione si può attaccare a delleproteine mediante un ponte disolfuro, o dare luogo alla sua forma ossidataformando un ponte di sofuro tra le due cisteine di due molecole di glutatione; inentrambi questi casi il ponte disolfuro ha azione antiossidante.

Nella cellula esiste il glutatione, il glutatione reagisce con un amminoacidomediante l’azione della gamma-glutammil transpeptidasi, si forma lacisteinilglicina,e rimane l’acido glutammico che lega l’amminoacido dainternalizzare.Entra poi in gioco l’enzima ossoprolinasi,e si forma l’oxoprolina (= acidopiroglutammico, ossia forma ciclica dell’ac.

Glutammico). L'acido piroglutammicoviene riconvertito nuovamente in glutammato, si lega prima alla cisteina (tramiteutilizzo di ATP), e poi alla glicina.Dunque, questo è il ciclo di Meister, serve sia alla biosintesi del glutatione sia a faentrare attraverso la membrana gli amminoacidi.Se troviamo in circolo GGT, è segno di:

• Malattia epatobiliare
• Ostruzione delle vie biliari, colestasi
• NAFLD ( Non Alcoholic Fatty Liver Disease)
• Neoplasia primarie e secondarie del fegato
• Epatiti alcoliche ed infettive
• Assunzione di farmaci ( barbiturici*, alcune statine**)

*farmaci che agiscono sul SNC, che determinano effetti come sedazione eanestesia, usati come ansiolitici.

** sono farmaci che inibiscono la produzione endogena di colesterolo andando abloccare l'enzima idrossimetilglutaril-CoA reduttasiPoiché GGT non è presente nel tessuto osseo può confermare l'origine epatica diaumentati livelli di ALP; può essere un

1. marcatore di colestasi in gravidanzaLSR: 40 U/L F; 68 U/L M
2. Aamilasi è prodotta da ghiandole salivari e pancreas. Due isoenzimi possono essere riscontrati nel siero: amilasi salivare e pancreatica
3. METODO DI MISURAZIONE DELLE AMILASI: Enzimatico, colorimetrico: si usano come substrati oligosaccaridi coniugati a p-nitrofenolo, che quando viene scisso per azione dell'amilasi presente nel campione di siero produce una colorazione evidenziabile a 415 nm
4. Lipasi pancreatica (marcatore del danno pancreatico): Marcatore più specifico dell'alfa-amilasi per riscontrare danni al pancreas. La lipasi pancreatica libera le catene di acido grasso o in posizione 1 o in posizione 3. Se si sospetta che il paziente possa avere un'infezione o un tumore al pancreas, si va a misurare la lipasi pancreatica, che viene rilasciata in circolo più velocemente rispetto

all'alfa-amilasi.

Come si misura la lipasi pancreatica?

Si usa un metodo di misurazione enzimatico colorimetrico che sfrutta la formazione di glicerolo da parte delle lipasi. Nel test noi aggiungeremo trigliceridi e campione di siero che contiene la lipasi, colipasi e deossicolato. Cosa ottengo? Glicerolo, la quantità di glicerolo prodotto è proporzionale alla lipasi presente nel siero.

A questo punto nel kit è presente anche ATP e l'enzima glicerolo chinasi, il glicerolo viene fosforilato a glicerolo 3-P. Nel kit è presente anche glicerolo ossidasi, per cui otteniamo diidrossiacetone fosfato più perossido d'idrogeno.

A questo punto in presenza del substrato 4-aminoantipirina e un altro substrato (non necessario da conoscere, nome troppo complesso da ricordare) forma chinone diimmina.

Il composto chinone diimmina assorbe a 550 nm.

l'assorbimento è proporzionale alla quantità di lipasi nel campione di siero.

ATTENZIONE: prima volta in cui si osserva in un test biochimico-clinico un susseguirsi di reazioni accoppiate l'una all'altra, fino ad arrivare al prodotto terminale che è quello che viene misurato.

Lattato deidrogenasi

Enzima citosolico

• La sua concentrazione nei tessuti è 1550-5000 volte maggiore che nel plasma
• Marcatore poco specifico, in quanto può essere marcatore di varie condizioni cliniche

Rilevante solo in ematologia ed oncologia:

• Anemie megaloblastiche
• Metastasi epatiche
• Tumori delle cellule germinali (testicolo, ovaie)

METODO DI MISURAZIONE

Lattato + NAD+ piruvato + NADH

Il NADH prodotto assorbe a 340 nm, la quantità di NADH è direttamente proporzionale all'assorbanza. Questo è indicatore di quanta lattato deidrogenasi era presente nel campione.

Come è fatta la lattato deidrogenasi? È un tetramero

formato da 2 diverse subunità(M, muscle, e H, heart). La combinazione di queste subunità in un tetrametro dàluogo a 5 diverse isoforme: LDH1, LDH2, LDH3, LDH4, LDH5.

Le diverse subunità hanno diverso comportamento elettroforetico, si può pertanto risalire alla loro origine tissutale, se riscontrate nel siero.

Possiamo riscontrare la 2 e la 3 in caso di leucemia acuta, la 4 è liberata in caso di danno a livello muscolare o del fegato come anche la 5.

LDH2, LDH3> rischio di leucemia acuta (bisogna fare altre analisi per accertamenti)

NON DA STUDIARE, solo per capire la colinesterasi: Acetilcolinesterasi

Controlla la trasmissione nervosa mediante idrolisi del neurotrasmettitore acetilcolina

Colinesterasi del siero

Catalizza la stessa reazione dell’acetilcolinesterasi, ma oltre che sull’acetilcolina, su una gamma di esteri della colina più vasta

Presente in fegato, pancreas, cuore, siero

Funzione sconosciuta, probabilmente

coinvolta nel metabolismo dei farmaci

Indicazioni per la misura dell'attività nel siero:

• Esame di funzionalità epatica (es.: dopo trapianto di fegato)
• Indicatore di possibile avvelenamento acuto da insetticidi organofosforici, che la inibiscono
• Individuazione di soggetti con forme atipiche dell'enzima, meno attive, che influenzano la risposta ai miorilassanti usati durante le anestesie
• Esami biochimici della funzione cardiaca

Creatinchinasi → misurata in particolare nei soggetti d'infarto miocardico

INFARTO MIOCARDICO ACUTO

Sintomi:

• Dolore acuto al petto (angina pectoris)
• Alterazioni dell'eletrocardiogramma (ECG)
• Marcatori biochimici sierici

Ideale di marcatore del danno miocardico:

• Cardiospecifico (non presente in altri tessuti)
• Essere presente in alta concentrazione nel miocardio
• Essere rilasciato rapidamente (entro 1-2 ore) dopo inizio IMA
• Essere rilasciato in proporzione diretta con l'estensione del danno

miocardico

Persistere in circolo per molte ore: ampia finestra diagnostica con determinazione di riocclusione o di reinfarto

Essere dosabile rapidamente e facilmente

Creatinfosfochinasi

Enzima citosolico dimerico

Due subunità, B (brain) e M (Muscle), codificate da geni diversi