Biochimica Clinica

Provette

Sangue intero: costituito da parte corpuscolata, plasma. Si ottiene rendendo il sangue incoagulabile

con anticoagulanti.

Plasma: Sangue privato degli elementi corpuscolati. Si ottiene da sangue prelevato con

anticoagulante separandolo dagli elementi corpuscolati con centrifugazione a 2000rpm per 10 min.

_I campioni di plasma possono essere lavorati subito dopo il prelievo.

_Maggiore resa a parità di volume di sangue: 15-20% in più rispetto al siero.

_Prevenzione di interferenze coagulazione-indotte: Con il siero rischio di ostruire gli aghi di

aspirazione degli analizzatori, ma possibile interferenza da anticoagulanti, interferenze da

fibrinogeno, minore stabilità di alcuni analiti.

Siero: Plasma privato del fibrinogeno. Si ottiene dal sangue intero senza aggiunta di anticoagulanti.

_Buona stabilità a vari analiti.

_Permesso in molti dosaggi.

_Interferenza da fibrina e rischio di coaguli durante aspirazione ago-campione-strumento.

_Spesso insidioso soprattutto quando si lavora con i tubi primari.

_Difficoltà a coagulare in presenza di pazienti in terapia anticoagulante.

Quali provette

_Eparina: All’1%, Anticoagulante naturale, altera la morfologia dei leucociti, provoca aggregazione

delle piastrine, è l’anticoagulante che interferisce di meno con le determinazioni enzimatiche.

Concentrazione ottimale: 0.1-0.2 mg/ml di sangue.

Calcio ione: Utilizzare eparina titolata con calcio (per minimizzare la chelazione)

Litio: Non può essere dosato in provetta litio eparina

Acidi biliari: Assolutamente non dosabile in eparina

Ammoniaca: In eparina refrigerato, ma soprattutto rapidamente centrifugato e dosato in ambiente

esente da contaminazioni (fumo di sigaretta).

_EDTA: Acido etilendiaminotetracetico - Sale bisodico o bipotassico (più solubile). Il migliore per

studiare la morfologia delle cellule del sangue. Non altera il volume degli eritrociti, non provoca

emolisi, riduce al minimo la lisi dei leucociti, è rapidamente solubile nel sangue. Agisce legando il

calcio. Lega anche altri cationi divalenti (Zn, Mg, Cu). Concentrazione ottimale: 1mg/ml di sangue.

Contaminazione da EDTA riconoscibile da K elevato e Calcio bassissimo.

Può a volte causare alterata conta delle piastrine (formazione di trombociti giganti per alterazioni

della membrana secondarie a chelazione del calcio); in questi casi si preferisce il citrato. Utilizzato

anche per: ACTH, renina, aldosterone, farmaci, biologia molecolare, etanolo (ma importa soprattutto

che non evapori).

_Citrato: Citrato di sodio tribasico per i test della coagulazione e la VES. Agisce legando il calcio.

Concentrazione 3.2-3.8% (mol/L). Le provette devono essere assolutamente piene (100%)

fondamentale il rapporto volume campione/anticoagulante.

_Sodio fluoruro/ossalato di potassio: Anti glicolitico e anticoagulante utilizzato per la determinazione

della glicemia (blocco della via glicolitica). A T° ambiente il consumo del glucosio ematico da parte

degli eritrociti è di 10mg/100mL di sangue in 1 ora. Per glucosio e acido lattico. Spesso dà emolisi e

non viene usato per altri test.

_Attivatore coagulo: Accorcia i tempi (15-30min invece di 1 ora).

_Gel separatore siero: Presenza di gel polimerico con peso specifico intermedio tra siero e cellule;

con la centrifugazione il gel migra e forma una barriera. Ridotto rischio di emolisi e stop di processi

metabolici. Alcuni analiti e farmaci possono però legarsi al gel. Contaminazione e anticoagulanti, non

fare mai travasi. Tecnica con vacutainer riduce questo rischio, mantenere nel prelievo l’ordine di

provette consigliato.

Il colore delle diverse provette (plasma e siero) usate dalla maggior parte dei produttori segue le

norme ISO 9000 e ISO 6710.

Ordine di riempimento provette raccomandato

Riduce il rischio di cross contaminazione di additivi e anticoagulanti.

Plasma prelevato dopo il siero per evitare che l’anticoagulante rallenti la formazione del coagulo.

Colture cellulari. Siero con o senza attivatore o gel separatore.

Sodio citrato (tappo blu).

Eparinato (tappo verde).

EDTA (tappo viola).

Sodio ossalato/fluoruro (tappo grigio).

Coagulato

Prelievo con siringa: Micro coaguli possono formarsi prima che il sangue sia trasferito nelle provette

con anticoagulante.

Miscelare bene le provette subito dopo prelievo -> Anticoagulante per essere efficace deve essere

disperso in modo omogeneo in tutto il campione (per inversione 8-10 volte) -> Anche provette per

siero con additivi (per inversione 4-5 volte). La coagulazione richiederebbe più tempo, rischio di

coaguli durante il dosaggio.

Spesso impossibile eseguire i test. Possibili risultati erronei quando sottili ed a volte invisibili “fili” di

fibrina si formano in provetta durante il dosaggio.

Lipemico

Lipemia è definita come un eccesso di lipidi nel sangue. Il siero lipemico appare torbido o lattescente

(chilomicroni dopo pasto grasso).

_Come interferisce? Per torbidità del campione ed interferenza nei dosaggi basati sull’assorbimento

della luce. La matrice lipidica può bloccare legami anticorpali nei dosaggi immunochimici.

_Causa: Paziente non a digiuno, Dislipidemie, Infusione di lipidi.

_Interferenze nell'analisi spettrofotometrica: La lipemia interferisce sull’assorbimento della luce in

quasi tutte le misure fotometriche. Il risultato apparente può essere aumentato o ridotto

_Effetto volume: Le lipoproteine possono far diminuire la concentrazione di analiti riducendo l'acqua

disponibile nel campione, poiché il volume occupato dalle lipoproteine in plasma o siero è incluso nel

calcolo della concentrazione dell’analita. Es. più basso potassio e sodio in sieri lipemici.

Interferenza da meccanismi fisico-chimici (matrice).

Nei campioni di sangue è visibile soltanto per concentrazioni di trigliceridi > 1000mg/dL (11.3

mmol/L). Nel plasma o siero visibile già a concentrazioni > 300mg/dL.

La centrifugazione al g1000 è efficace per i chilomicroni. Almeno 10 minuti, centrifugazione a 12000g

separano i lipidi del plasma o del siero dal galleggiamento. L'ultracentrifugazione deve essere

impiegata per la separazione delle lipoproteine di densità bassa e delle lipoproteine ad alta densità.

Un tempo di centrifugazione almeno di 30 minuti ad una velocità superiore a 40000 g è suggerito.

Itterico

Il laboratorio deve conoscere per ogni metodo il limite al di sopra del quale l’ittero crea interferenza

analitica (limite di applicazione). Il controllo visivo dei campioni del siero o del plasma non è spesso

abbastanza sensibile soprattutto quando sono presenti simultaneamente altri pigmenti (per es. Hb).

Interferenza spettrale: La bilirubina ha un'alta capacità di assorbimento a 450 e 600nm. Al picco di

assorbanza del composto in esame si sovrappone quello interferente della bilirubina, provocando un

marcato assorbimento dell’energia luminosa.

Interferenza chimica: La bilirubina interferisce in reazioni enzimatiche basate sulla perossidasi.

_Campioni emolizzati e torbidi (lipemici) possono dare risultati di bilirubina inattendibili.

_In coagulazione interferisce sul dosaggio turbidimetrico della antitrombina III.

_Interferenza sulla creatinina (metodo di Jaffè).

_Sul dosaggio del fosforo con il metodo del fosfomolibdato con effetto di riduzione.

_Fosfatasi acida (per bilirubina > 3 mg/dl).

_Elettroforesi proteica: Bilirubina indiretta è legata all’albumina.

_Può interferire anche su glucosio, colesterolo, trigliceridi, urato.

Insufficiente volume ottimale

Provette e anticoagulante. È necessario che il rapporto tra sangue ed anticoagulante sia sempre

costante e corretto (raccomandazioni NCCLS).

È necessario utilizzare provette sottovuoto (sistema chiuso di prelievo, raccomandabile anche per

motivi di sicurezza).

Esempio: Se una provetta di plasma eparina da 5mL viene riempita solo con 3mL di sangue,

l’eparina in eccesso potrebbe interferire con alcuni analiti.

La quantità di campione necessaria per eseguire un test dipende da:

_Volume campione previsto per singolo dosaggio: Il volume spazio-morto dell’analizzatore, La

quantità di campione richiesta per eventuali ripetizioni, il volume di plasma è in relazione al rispettivo

ematocrito.

Eccezione: Campioni scarsi spesso pediatrici o per difficoltà di prelievo è opportuno contattare il

clinico per scegliere gli esami prioritari.

Usare provette pediatriche. Richiesta di dosaggi mirati e non a tappeto.

Fase pre-analitica intra laboratorio

Effettuato il prelievo, il materiale va inviato subito al Laboratorio.

Entro 1 ora dal prelievo i campioni devono essere centrifugati e separati.

Conservazione non idonea: Se campioni di sangue vengono lasciati a temperatura ambiente anche

per un tempo limitato (inferiore all’ora) si hanno alterazioni nette dei livelli di alcuni analiti (es. lattato,

ammoniaca, equilibrio acido-base). Per tempi maggiori si osserva:

_Riduzione del glucosio (diminuzione del 3-5% ogni ora per metabolismo cellulare), in seguito i

globuli rossi cominciano a perdere il loro contenuto citoplasmatico dando luogo ad aumento di LDH,

AST, potassio e fosfati.

Conservazione:

_Esame emocromo effettuato entro 7h massimo.

_VES non oltre 24h

_Test su fattori della coagulazione tempi molto più brevi.

Campioni che devono essere subito refrigerati e trasportati in ghiaccio: ACTH, ADH, acido lattico,

Nefa, Omocisteina, amminoacidi, Vitamina B6, B1, ammoniaca. La Renina non deve essere

assolutamente refrigerata (altrimenti rischio di crioattivazione) dosata subito o congelata.

Stabilità analiti in sangue intero a temperatura ambiente

_Ormoni (non tutti) 1 settimana.

_Acido urico, lipidi 3 gg.

_Amilasi, Gpt 4 gg.

_Glucosio, lipasi, meno di 4h.

_Ammonio, rapido aumento

_Etanolo, stabile se rigorosamente tappato

Cause principali dell’alterazione della qualità dei campioni

_Metabolismo delle cellule del sangue

_Reazioni chimiche

_Diffusione di gas (eq acido-base)

_Evaporazione e sublimazione

_Fenomeni di adsorbimento ai materiali utilizzati per il prelievo

_Effetto della luce (bilirubina, vitamine)

_Processi osmotici

Se vi è la necessità in laboratorio di conservare i campioni da analizzare o già analizzati:

_Raffreddamento (4°C) conservazione dei campioni per 2-3 gg, al massimo una settimana.

_Congelamento (-20°C/-80°C) conservazione per tempi più lunghi. Il metodo migliore è stoccare

piccole aliquote congelate rapidamente in azoto liquido e conservate a -80°C.

La stabilità di un analita nel campione indica per quanto tempo quell’analita mantiene la sua

concentrazione iniziale senza subire alterazioni fisico-chimiche. La misura dell'instabilità può essere

descritta come differenza assoluta, come quoziente o come deviazione pe