Biochimica Clinica

Indice

• Sommario preanalitica
• Prelievo e conservazione
• Variabilità biologiche e valori di riferimento
• Biochimica clinica e malattie rare
• Fase preanalitica – Dal prelievo all'analisi
• La sperimentazione di farmaci

Preanalitica

Variabilità preanalitica

Raccolta, trattamento e conservazione dei materiali biologici, una delle fasi più importanti e delicate dell’intero processo analitico (la più elevata causa di errore). Precise procedure nella raccolta e nella successiva manipolazione dei campioni biologici.

Se uno stesso campione viene analizzato ripetutamente non si ottengono sempre gli stessi valori. La variabilità analitica è la responsabile delle differenze che si osservano tra i valori analitici ripetuti e dipende dal metodo analitico utilizzato.

La variabilità analitica consta di due componenti: Precisione ed accuratezza.

• Precisione: Grado di concordanza tra misure replicate effettuate sul medesimo campione.
• Accuratezza: È il grado di concordanza tra la stima ed il valore vero della grandezza.

Prelievo venoso

Preparazione dell'assistito

• Digiuno/dieta
• Assunzione di farmaci
• Stress
• Postura
• Attività fisica
• Variazioni circadiane

Preparazione

• Eseguire identificazione del paziente
• Effettuare anamnesi: Breve (motivazione diagnostica degli esami richiesti, assunzione farmaci, attività fisica, ore di digiuno), dettagliata (compilazione questionari).
• Individuare gli esami richiesti
• Preparare le provette relative
• Apporre sulle provette l’identificativo del paziente

Operazioni durante il prelievo

• Individuare il punto del prelievo
• Applicare il laccio evitando una stasi prolungata
• Disinfettare con alcool etilico 70%, lasciare asciugare
• Introdurre l’ago con la parte smussa verso l’alto
• Togliere il laccio mentre il sangue inizia a defluire
• Riempire il vacutainer e quindi rimuoverlo
• Estrarre l’ago ed esercitare pressione con tampone di garza sul punto del prelievo, applicare un cerotto
• Agitare con delicatezza i campioni con anticoagulante

Tipo di campione

• Sangue intero
• Plasma
• Siero
• Urine

Il tipo di campione dipende dalle indagini da eseguire: Il siero è più limpido (non sono presenti fibrinogeno, protrombina, diversi fattori della coagulazione). Rispetto al plasma il siero presenta problemi di influenza da emolisi (K+, Hb, Lattico Deidrogenasi), il siero si ottiene dopo che avviene la coagulazione.

Coagulazione: Insieme di processi che portano alcune proteine plasmatiche ad aggregarsi tra loro, alla fine del processo il fibrinogeno solubile si trasforma in fibrina insolubile ad opera della trombina.

Emolisi: Rottura delle emazie (G.R.). È la causa più frequente di inadeguatezza qualitativa del prelievo di sangue. Conseguenza dell’emolisi è il passaggio nel siero (o nel plasma) dell’emoglobina e di tutte le sostanze contenute all’interno degli eritrociti. Es: Potassio, lattato-deidrogenasi, transaminasi.

Urine

L’analisi delle urine fornisce specifiche informazioni sulle condizioni funzionali del rene e del sistema urinario. Nell’urina confluiscono i prodotti finali di diversi catabolismi fisiopatologici, quindi l’esame delle urine fornisce molteplici informazioni cliniche.

• Campione più semplice per la raccolta
• Esame completo delle urine: Campione della prima minzione mattutina.
• Modalità di raccolta e conservazione: Mattutina, 24H.
• Modalità di raccolta differenti per indagini microbiologiche.
• Recipiente pulito ed in alcuni casi sterile.

Principali cause di variazioni preanalitiche

Raccolta del materiale

• Contaminazione (provette, aghi, contenitori).
• Metabolismo (additivi, anticoagulanti).

Trasporto

• Emolisi (meccanica, fisica, osmotica, cause biologiche).
• Inattivazione (esposizione luce, temperature elevate).

Conservazione del campione

• Temperatura non idonea e concentrazione.

Errori della fase preanalitica

• Errata identificazione del paziente
• Errata identificazione del reparto
• Dimenticanza nella richiesta di esami
• Provetta non idonea
• Raccolta scorretta del campione

Errori analitici

Tutti i risultati analitici sono soggetti a variazione. L’intervallo di variazione dipende dalle caratteristiche delle reazioni utilizzate, dagli strumenti impiegati, dall’abilità dell’operatore, dalle condizioni ambientali, etc. Gli errori possono essere di tre specie:

• Errori casuali - Deterioramento dei reattivi, malfunzionamento dello strumento, modifiche delle condizioni operative, imprecisione dell’operatore.
• Errori sistematici - Possono essere dovuti a scarsa specificità del metodo, strumenti non ben tarati, etc. È un errore eliminabile, può essere evitato con l’impiego di metodi specifici, di buoni strumenti e di controlli adeguati.
• Errori da disattenzione - Hanno carattere accidentale e possono essere dovuti a inquinamento del campione, errori di prelievo, errori di lettura, scambi di campioni, errori di calcolo, errori di trascrizione. Sono errori evitabili con una buona organizzazione.

Metodi analitici

• Metodo definitivo: Risultato “definitivo”. Migliore approssimazione al valore “vero”. Es: spettrometria di massa.
• Metodo di riferimento: Metodo con inaccuratezza trascurabile. Es: spettroscopia di assorbimento.
• Metodo ad errore noto: In cui l’entità dell’errore è stabilita (mediante comparazione con un metodo di riferimento).

Controllo di qualità

Obiettivi: Scopo del C.Q. è quello di garantire che l’errore totale analitico sia contenuto entro livelli predeterminati, che assicurano la significatività del risultato ai fini dell’utilizzo clinico. Sistemi di controllo: Il monitoraggio della qualità analitica viene effettuato mediante controllo di qualità interno e valutazione esterna di qualità.

• Controllo di qualità interno: Scopo del controllo di qualità interno è di verificare l’imprecisione delle metodiche utilizzate. Il controllo è eseguito per ogni serie analitica sia per i livelli normali che per i patologici almeno due volte: Inizio della seduta analitica, fine della seduta analitica, intervallati tra serie di campioni (20 o 50).
• Controllo di qualità esterno: Scopo del controllo di qualità esterno è di verificare l’inaccuratezza con la quale sono effettuate le determinazioni analitiche. Vengono determinati campioni di controllo ed i risultati confrontati con quelli di altri laboratori a parità di metodica e strumentazione.

Variabilità biologica

Diversi fattori possono influenzare la variabilità dei parametri biochimici. Questa variabilità si evince dal confronto: Tra il valore osservato in un paziente ed i valori osservati in altri individui e tra i valori successivamente osservati nello stesso individuo.

• Variabilità intra-individuale: È legata alle oscillazioni omeostatiche quando in un individuo vengono eseguite misure ripetute nel tempo della grandezza dello stesso componente (es: glucosio, si potrà notare che il valore analitico è soggetto a variazioni tra i giorni, le settimane, etc.).
• Variabilità interindividuale: Ogni individuo ritenuto sano ha caratteristiche distintive peculiari che lo diversificano dal suo simile all’interno della stessa popolazione.

Fattori esogeni

• Postura: Modificazione del volume plasmatico (-10% se il paziente è disteso). Aumento della concentrazione delle plasma-proteine e degli analiti ad esse legati. Aumento della secrezione di catecolamine, aldosterone, angiotensina II, renina e ADH. Un prolungato allettamento può provocare: Riduzione volume plasmatico e extracellulare, aumento dell’ematocrito, riduzione della concentrazione di albumina e plasma-proteine, aumento paradosso della CK nella fase iniziale poi netta riduzione, aumentata escrezione urinaria di calcio, sodio, potassio, fosfato e solfato, riduzione della variazione circadiana del cortisolo.
• Stato fisiologico - Lo stress induce l’aumento di secrezione di: Aldosterone, Angiotensina, Catecolamine, Cortisolo, Prolattina, Renina, GH, TSH, Vasopressina, Aumentano anche albumina, colesterolo, fibrinogeno, glucosio e insulina.
• Dieta - Alcuni componenti plasmatici sono influenzati dal tipo di dieta e dal tempo che intercorre dal pasto al prelievo. Il maggiore aumento dopo un pasto si osserva per i seguenti analiti: Glucosio, Ferro, Trigliceridi, Fosfatasi alcalina. Eseguire il prelievo al mattino, dopo 8-12 ore di digiuno riduce notevolmente la variabilità di molti analiti e sembra essere il migliore periodo di tempo per la standardizzazione del prelievo.
• Farmaci
• Attività fisica – Esercizio moderato: Aumento cortisolo e catecolamine, Glucosio con aumentata secrezione di insulina, Aumento lattato e piruvato, Aumento enzimi muscolari (CK, AST, LDH e aldolasi). Esercizio eccessivo: Accentuazione delle modificazioni suddette. Atleti: Aumento delle attività enzimatiche di derivazione muscolare, Aumento di creatinina plasmatica e urinaria, Aumento degli ormoni tiroidei, Riduzione del colesterolo totale e dei trigliceridi.

Fattori endogeni

• Genetici: Popolazioni/razze
• Fisiologici: Età (Es: Attività della fosfatasi alcalina), sesso. Le differenti concentrazioni di analiti nei due sessi sono dovute alle diverse influenze ormonali sul metabolismo. Obesità (Es: Concentrazioni di colesterolo e trigliceridi). Stato nutrizionale (Es: Avitaminosi).

Prelievo e conservazione

Campione Cause più frequenti di errore:

• Emolizzato - 55%
• Insufficiente - 20%
• Non idoneo - 15%
• Coagulato - 5%
• Altro - 5%

Ogni campione deve essere esaminato visivamente subito dopo l'arrivo e dopo centrifugazione. È comunque difficile prevedere l’entità degli effetti provocati dall’emolisi, dalla torbidità (lipemia) e dalla bilirubina (ittero) sui vari reagenti e sistemi analitici.

Paziente (postura, dieta, variabilità biologica, fattori individuali)

• Applicazione prolungata del laccio – Eccessiva stasi
• Campione itterico (ottimale)
• Campione insufficiente
• Errata etichettatura della provetta
• Conservazione non idonea
• Contaminazione
• Errata identificazione del paziente
• Mancata indicazione del tipo di prelievo
• Anticoagulante non idoneo
• Campione coagulato
• Incompleto riempimento della provetta (volume dell’ora del prelievo)

Laccio emostatico

Il laccio facilita la raccolta del campione, ma causa emo-concentrazione artificiale:

• Apparente aumento della concentrazione delle molecole grandi che non sono capaci di passare attraverso la parete del capillare già quando il laccio viene applicato per 1 solo minuto.
• Proteine e sostanze ad esse legate (calcio, bilirubina, farmaci...), ferro, colesterolo, AST.
• Laccio per circa 3 minuti -> Aumento dal 5 al 10%.
• Laccio per più tempo -> Attiva la glicolisi anaerobia con aumento del lattato, acidosi e aumento del potassio
• Questi effetti sono ancora più pronunciati se il laccio viene rilasciato durante il prelievo del sangue.

Emolisi

Dopo centrifugazione del sangue l’emolisi è rilevata dal colore rosso del siero o del plasma. È il passaggio di componenti intra-eritrocitari nello spazio extracellulare del sangue.

• In vivo (reazione post trasfusionale, durante la malaria, deficit enzimi eritrocitari).
• In vitro durante tutti gli step della fase pre-analitica (prelievo, trasporto del campione e conservazione).

Cause più frequenti in vitro

• Difficoltà nel prelievo.
• Contaminazione dell’ago con alcool o altri disinfettanti.
• Aspirazione, espulsione, mescolamento troppo energici.
• Tempo eccessivo prima della separazione del siero - Velocità di centrifugazione eccessiva.
• Conservazione a temperature troppo alte (>30°C) - Troppo basse (congelamento).
• Causata da meccanismi biochimici, immunologici, fisici e chimici.
• Post trasfusione – anticorpi contro antigeni del gruppo sanguigno
• Osmotici (diluizione con soluzione ipotonica) e pressori (vuoto)
• Meccanici in vivo - turbolenza del sangue attraverso cateteri.
• Centrifugazione inadeguata, temperatura elevata, congelamento, prelievo con siringa (eccessiva forza aspirante o pressione con lo stantuffo durante espulsione).
• Chimici per disinfettanti e contaminanti nell’ago, siringa o contenitori.

Emolisi in vivo o in vitro può causare un apparente aumento o diminuzione dei risultati coagulativi, biochimici ed ematologici. Anche emolisi non riconoscibili all’ispezione (campione processato come idoneo) possono produrre alterazioni clinicamente significative. Rilevazione visiva emolisi, è rilevabile dal colore rosso del siero o del plasma per concentrazioni extracellulari di emoglobina superiori a 20-30 mg/dl.

Le procedure per gestire i campioni emolizzati devono essere descritte nel manuale della qualità. L’emolisi del campione deve essere segnalata al clinico e sul referto, se l’emolisi è presente in tutti i campioni di un paziente, si può sospettare emolisi in vivo.

Gestione dei campioni emolizzati

In presenza di un campione emolizzato per il quale sono richieste analisi di chimica clinica (generale), vengono definite le seguenti linee guida per la refertazione:

• Emolisi inferiore a 0.5 g/L di emoglobina: nessuna segnalazione, tutti gli esami vanno refertati.
• Emolisi tra 0.5 e 2.0 g/L: vanno refertati sia i risultati del Potassio che degli enzimi, accompagnati dal commento
• Emolisi superiore a 2.0 g/L: Vanno soppressi solo i risultati di AST e LDH, accompagnati dal commento.
• Campione laccato: È opportuno non refertare. Il grado di emolisi viene valutato visivamente per confronto con la scala allegata.

Commento: Campione emolizzato, probabile sovrastima di potassio ed enzimi, escludere una emolisi in vivo e ripetere il prelievo. Per tutti gli altri analiti va valutato il grado di interferenza del metodo in uso.

Per evitare emolisi durante prelievo

• Scegliere l’ago della misura idonea
• Evitare assolutamente di togliere la provetta da vuoto prima che sia stata riempita
• Non prelevare con siringa
• Non travasare il sangue nelle provette sottovuoto espellendolo dalla siringa con ago innestato.

Contaminazione da liquidi di infusione

In un paziente che riceve liquidi per via endovenosa, il prelievo di sangue dallo stesso braccio può essere causa di contaminazione del campione da esaminare. Effetto di diluizione a seguito di:

• Prelievi da accessi venosi (cateteri, dispositivi a permanenza).
• Prelievi eseguiti dallo stesso braccio anche in sedi lontane dalla via di infusione.

Il prelievo da accessi venosi può essere considerato idoneo previo arresto del flusso per almeno 2 minuti e scarto di un volume (in genere, almeno 5 ml di sangue). Il trattamento del campione in cui sia chiaramente dimostrabile una contaminazione è complesso: tipo ed entità della contaminazione, variabile, interferenza sui vari test. Alti livelli di glucosio e/o bassi livelli di elettroliti possono essere spia di contaminazione da linea e.v. Importante è anche la valutazione dei risultati attuali con quelli precedenti, quando è possibile.

Effetto di diluizione: Contaminazione e anticoagulanti

• Contaminazione da Eparina per campioni raccolti da vie centrali; CVC che contengono eparina per prevenire coaguli e chiusura della via.
• Anticoagulanti: Contaminazione da una provetta all’altra quando i test da eseguire richiedono provette di più tipi.

Provette

Sangue intero: costituito da parte corpuscolata, plasma. Si ottiene rendendo il sangue incoagulabile con anticoagulanti.

Plasma: Sangue privato degli elementi corpuscolati. Si ottiene da sangue prelevato con anticoagulante separandolo dagli elementi corpuscolati con centrifugazione a 2000 rpm per 10 min.

• I campioni di plasma possono essere lavorati subito dopo il prelievo.
• Maggiore resa a parità di volume di sangue: 15-20% in più rispetto al siero.
• Prevenzione di interferenze coagulazione-indotte: Con il siero rischio di ostruire gli aghi di aspirazione degli analizzatori, ma possibile interferenza da anticoagulanti, interferenze da fibrinogeno, minore stabilità di alcuni analiti.

Siero: Plasma privato del fibrinogeno. Si ottiene dal sangue intero senza aggiunta di anticoagulanti.

• Buona stabilità a vari analiti.
• Permesso in molti dosaggi.
• Interferenza da fibrina e rischio di coaguli durante aspirazione ago-campione-strumento.
• Spesso insidioso soprattutto quando si lavora con i tubi primari.
• Difficoltà a coagulare in presenza di pazienti in terapia anticoagulante.

Quali provette

• Eparina: All’1%, Anticoagulante naturale, altera la morfologia dei leucociti, provoca aggregazione delle piastrine, è l’anticoagulante che inte...