Biochimica Cellulare

TRASLOCAZIONE DELLE PROTEINE LISOSOMIALI AL LISOSOMA

Dal trans-Golgi al lisosoma le proteine destinate a lisosoma viaggiano attraverso le vescicole di

clatrina. Il recettore della proteina CARGO riconosce come tratto strutturale di queste proteine la

componente oligosaccaridica, in particolare il mannosio 6-P, questo si forma così: nel cis-Golgi gli

oliosaccaridi N-linked presenti sulla maggior parte degli enzimi lisosomiali subisce una reazione in

2 steps che genera i residui di mannosio 6-P:

1. Una N-acetilglucosammina fosfotrasferasi trasferisce una N-acetilglucosammina fosforilata

su uno o più residui di mannosio (questi residui vengono aggiunti solo agli enzimi

lisosomiali poiché solo essi contengono le sequenze riconosciute da questo enzima)

2. Una fosfodiesterasi rimuove l’N-acetilglucosammina e lascia il mannosio 6 fosfato sulla

proteina

Queste modificazioni avvengono nel golgi e generano questo tratto strutturale che viene

riconosciuto dal suo recettore e viene poi incluso nella vescicola di clatrina che viene indirizzata al

tardo endosoma, il quale si forma a seguito della associazione di vescicole endocitiche che si

fondono tra loro. Il tardo endosoma ha un basso pH: infatti c’è una pompa protonica che acidifica

l’ambiente interno, probabilmente perché è infarcito di enzimi litici (tra cui proteasi) che lavorano

in modo efficiente solo in ambienti acidi. Il pH viene sfruttato però anche per altri scopi come per

esempio per il rilascio di una proteina solubile destinata al lisosoma: nel Golgi, il pH neutro favorisce

l’associazione tra la proteina che deve essere trasportata e il suo recettore, mentre una volta che la

vescicola raggiunge il tardo endosoma, il rilascio è garantito dal basso pH che favorisce la

dissociazione tra la proteina e il suo recettore. Un successivo processo di maturazione porta poi

all’accumulo tutti gli enzimi necessari, a un ulteriore abbassamento del pH e alla formazione del

lisosoma. È possibile che alcune proteine lisosomiali possano essere esocitate in maniera aspecifica,

perciò a livello della membrana avviene poi una endocitosi mediata da recettore in modo che gli

enzimi lisosomiali possano essere catturati e portati al lisosoma.

ESOCITOSI

Tutte le cellule eucariotiche secernono in modo costitutivo certe proteine secrezione costitutiva

Cellule secretorie specializzate immagazzinano alcune proteine in vescicole per secernerle solo

quando spinte a farlo da uno specifico stimolo secrezione regolata

Evidenze morfologiche sembrano indicare che la secrezione regolata sia controllata



dall’aggregazione proteica selettiva le proteine destinate alla secrezione regolata si aggregano

selettivamente prima della loro incorporazione nelle vescicole secretorie regolate

Nelle vescicole secretorie regolate ci sono due proteine: cromogranina e segretogranina e

-3

all’interno delle vescicole si produce un aumento di concentrazione di calcio (10 ) rispetto al calcio

-7

citosolico (10 ). Il risultato è che le proteine che regolano le vescicole precipitano in seguito allo

stimolo insieme agli ormoni o proteine che devono essere secrete. Questo succede nel trans-Golgi

network in cui avviene questa selezione

Non si sa come avviene la secrezione costitutiva! Le proteine non precipitano in modo selettivo, ma

sono contenute in vescicole e poi vanno a fondersi con la membrana.

Quali sono le co-proteins implicate nelle vescicole secretorie? Non si sa

Caratteristiche delle proteine secrete

Una buona parte delle proteine destinate alla secrezione hanno una pro-sequenza che

normalmente sta all’N-term. Non c’entra niente con la sequenza segnale che è già stata eliminata

(si chiamava pre-sequenza). Le proteine infatti fanno tutto il tragitto in forma di PRO-PROTEINE (es.

pro-albumina). Nel caso della pro-insulina la sequenza è interna, mentre nella pro-albunima è

all’estremità. Queste pro-sequenze vengono tolte appena prima di essere secrete.

▪ A cosa servono?

- A promuovere un corretto folding ( perché magari a questo livello non sono ancora

foldate)

- Per tenere insieme il peptide A e B che formano poi la forma matura in modo da dare la

possibilità di fare i ponti di solfuro che nell’insulina tengono insieme le due catene

polipeptidiche

- La pro-sequenza staccata dalla proteina ha la capacità di promuovere il folding per quello

che rimane.

- Enzimi digestivi: la chimiotripsina è prodotta come chimiotripsinogeno. Si distinguono

per la pro-sequenza che viene tagliata all’ultimo momento.

▪ Perché viene tolta? Perché un enzima proteolitico deve essere tagliato, e quindi attivato,

proprio appena prima di essere secreto altrimenti digerirebbe tutto quello che trova (es.

nella pancreatite digestiva si perde questo controllo e c’è il processamento troppo precoce

degli enzimi digestivi che vanno a digerire il pancreas)

▪ Chi processa queste pro-proteine? C’è una batteria di enzimi. Il primo scoperto è Kex-2.

Questi enzimi tagliano a valle di due aa basici che possono essere arginina-arginina o



arginina-lisina, ma non lisina-lisina. Questi enzimi devono essere estremamente specifici

devono tagliare in un unico punto, sul confine tra la pro-sequenza e la proteina matura. Per

essere così specifici riconoscono anche alcuni aa a monte, ma con meccanismi complicati.

Possono tagliare anche in più di un solo punto, ma comunque rimangono pochi

ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI

È il meccanismo con cui tutte le cellule sono in grado di internalizzare in modo selettivo sostanze

che vengono dall’esterno. (non è l’unico modo di internalizzazione dal momento che c’è anche la

fagocitosi e la pinocitosi).

A livello della plasmamembrana ci sono molti recettori che interagiscono con diversi ligandi: hanno

un dominio extra e intra. Quello intra è predisposto per interagire con certe proteine adattatrici e

quando il ligando attracca il recettore dal lato extracellulare, rapidamente si innesca il processo di

formazione della vescicola. La vescicola si introflette e viene strozzata dalla dinamina e va a

fondersi al tardo endosoma. Tutte le cellule fanno endocitosi mediata da recettori perché tutte

necessitano di internalizzare composti che stanno al di fuori della cellula. un numero infinito di

proteine o complessi vengono internalizzati. È un processo estremamente attivo: il 2% della

superficie della cellula è occupato da recettori che sono destinati all’endocitosi. Essi sono spesso

raggruppati e a volte anche prima dell’arrivo del ligando sono direttamente già in contatto con la

clatrina.

Come fa il legame del ligando a innescare la formazione della vescicola? Nei casi di endocitosi, il

tratto transmembrana non può essere modificata, perciò il recettore non può cambiare di

conformazione per mandare il segnale dal lato extra a quello intra. Quello che succede è che il

dominio extracellulare si modifica in modo da diventare più affine a un altro dominio extra. Si

forma perciò un raggruppamento tra i vari recettori nella loro porzione extra

I due casi principali sono:

1) Endocitosi delle LDL

Le LDL sono uno dei molti complessi che trasportano colesterolo nel circolo sanguigno. Una

particella LDL ha un rivestimento fosfolipidico esterno contenente una singola molecola di

una proteina chiamata Apo100. Molte cellule di mammifero producono recettori di

superficie che legano ApoB100 ed enternalizzano LDL attraverso endocitosi mediata da

recettore. Questi recttori sono glicoproteine con un singolo segmento trasmembrana, un

segmento citosolico piuttosto breve ed un lungo N-terminale extracitoplasmatico che

contiene il dominio di legame per le LDL. Dopo l’endocitosi, LDL è trasportata ai lisosomi

attraverso il pathway endocitico e degradata dalle idrolasi lisosomali. I recettori delle LDL

invece si dissociano nel tardo endosoma dai loro ligandi, infatti il ph 5 porta ad un

cambiamento conformazionale del recettore che rilascia così l’LDL, questi recettori poi

vengono riciclati in superficie dove il ph neutro fa ritornare i recettori nella loro

conformazione ottimale per legare LDL.

2) Endocitosi della transferrina

Questo tipo di endocitosi è un’eccezione all’idea generale della dissociazione ligando

recettore nel tardo endosoma. La transferrina è una proteina che lega e distribuisce il Fe3+

a tutte le cellule. Può raggiungere tutte le cellule, può passare anche la barriera

questo

ematoencefalica dimostra che ha un ruolo essenziale. Il recettore infatti è

ubiquitario. Lo schema dell’endocitosi è una variazione sul tema generale: a pH acido (circa

5) non si stacca la transferrina complessata al ferro dal recettore, ma solo il Fe, perché la

transferrina perde affinità per il ferro. In questo modo la transferrina resta associata al suo

recettore, e viene riciclata in membrana insieme al suo il recettore. La variazione di pH

(circa 7) fa in modo che la transferrina viene rilasciata nell’ambiente extra perché è poco

affine al suo recettore.

Altri esempi

3) Ormoni peptidici

Attivano una cascata di eventi a valle e sono internalizzati in modo che lo stimolo viene

down regolato, cioè annullato in tempi brevi

4) Smistamento delle proteine sul lato apicale da quello basale

Una volta che viene sintetizzata una nuova proteina di membrana, questa deve essere

indirizzata nel dominio corretto. I meccanismi non sono ancora chiari, ma si sa che sono

necessari sistemi di riconoscimento che decidano se una proteina deve andare da un lato o

da un altro. Il risultato di questo sorting e della restrizione del movimento delle proteine

all’interno della plasmamembrana dovuto alle giunzioni strette è la formazione di distinti set

di proteine per i due domini della membrana. Generalmente GPI è un segnale che indica che

deve essere posto sul lato apicale. Ci sono molti segnali diversi.

Questo sorting basolaterale-apicale è stato investigato in colture i cellule MDCK ( ovvero

cellule canine di reni) una linea di cellule epiteliali polarizzate .

Nelle cellule infettate con il virus dell’influenza le particelle virali gemmano soltanto dalla

membrana apicale, mentre nelle cellule infettate con il virus della stomatite vescicolare le

particelle virali gemmano solo dalla membrana basolaterale.

Questo si verifica poiché particolari glicoproteine del virus dell’influenza (emoglutina) sono

trasportate dall’apparato di Golgi esclusivamente dalla membrana basolaterale a quella

apicale.

Il segnale di sorting risiede nella glicoproteina stessa e questo è stato dimostrato attraverso

tecniche di DNA ricombinante che prevedevano l’inserimento del gene che codifica per la

glicoproteina in cellule non infettate con virus.