Biochimica cellulare

Biochimica cellulare

Ciclo vitale delle proteine

Parleremo prevalentemente delle cellule eucariotiche. Una proteina appena sintetizzata si ripiega, ma in vivo vi è un repertorio di proteine che assistono al ripiegamento, gli chaperoni, che permettono di ottenere la proteina ripiegata in modo corretto. La proteina può essere rilasciata nel citosol oppure può essere smistata, mediante il processo di sorting, nel nucleo, nei mitocondri, perossisomi e nella via secretoria. La via secretoria include una serie di destinazioni diverse: il RE, il Golgi, i lisosomi, la plasmamembrana e la secrezione. Una proteina destinata alla via secretoria non è necessariamente secreta, in quanto può fermarsi nei compartimenti elencati prima.

Le proteine possono anche venire degradate. Vi sono due dispositivi per la degradazione:

• Lisosomi
• Proteasomi

La degradazione è uno dei fenomeni più regolati ed è selettivamente regolata. Ogni proteina può essere degradata a velocità diversa a seconda dello stato della cellula. Vi sono patologie associate al malfunzionamento di questi sistemi cellulari. Vi sono malattie da missfolding proteico (amilosi, neurodegenerative o sistemiche) dove si formano degli aggregati proteici che sono tossici e portano alla morte neuronale. Malattie genetiche mitocondriali che possono dare implicazioni neurologiche o muscolari. Vi sono anche malattie da accumulo lisosomali a seguito di deficienze di enzimi lisosomali, come enzimi che tagliano glicosamminoglicani. Il proteasoma è molto più selettivo rispetto ai lisosomi; tutt’oggi ci sono degli inibitori dei proteasomi usati come antitumorali. Con l’autofagia si formano delle vescicole che inglobano e degradano i lisosomi. Mal funzionamento dell’autofagia porta a condizioni di neurodegenerazione e cancro.

C. de Duve, premio Nobel 1974, riuscì a capire l’organizzazione strutturale e funzionale della cellula. Egli intuì che il lisosoma era un organello con funzione litica. L’ubiquitina è alla base della degradazione controllata delle proteine.

Definizione di chaperone

Le acquisizioni di Anfinsen hanno ritardato lo studio del folding in vivo. Le cose in vivo presentano complicazioni. Vi sono proteine che assistono al corretto ripiegamento: le proteine chaperon. Lo chaperon è una persona che accompagna una o più giovani nubili in modo da garantire un comportamento adeguato in una compagnia pubblica o mista. A livello molecolare, lo chaperon è qualsiasi molecola che aiuta al corretto folding.

Chaperon molecolari sono proteine monomeriche o più spesso oligomeriche che assistono il folding in vivo. Prevengono le off-pathways (ossia quelle forme portano lontano dalla forma nativa) e in generale accelerano le on-pathways. Il missfolding può avvenire a diversi stadi del ripiegamento. La proteina comincia a ripiegarsi già durante la sintesi. Non modificano il punto di arrivo del folding: la conformazione nativa (=dotata di attività biologica) della proteina presa in carico dagli chaperoni è sempre la stessa, in presenza e in assenza di chaperoni, ed è stabilita dalla struttura primaria come dimostrato da Anfisen. Però in assenza di chaperoni, una proteina può aggregare o rimanere intrappolata in una conformazione misfolded.

• Una proteina che deve piegarsi espone l’interno idrofobico verso l’interno.
• La concentrazione delle proteine in ambiente intracellulare è molto alta, quasi tutto il volume del citosol è costituito da proteine.
• Durante il ripiegamento espone dei tratti idrofobici che possono essere diversi dalla forma nativa. È un misfolded non associato all’aggregazione. Tutti gli esperimenti all’Anfinsen sono stati fatti su proteine semplici.

Durante il ripiegamento due eventi possono prevenire il raggiungimento della conformazione nativa:

1. Aggregazione
2. Missfolding

Il primo caso si produce a seguito di interazione inter-molecolari, il secondo a seguito di interazioni intra-molecolari scorrette. In entrambi i casi ciò deriva principalmente dal fatto che le sequenze o i residui che concorrono a formare il nucleo idrofobico durante il ripiegamento, e quindi prima della conclusione del folding, non sono ancora segregati all’interno della proteina; essi pertanto sono necessariamente esposti, in tutto o in parte. Data la loro natura idrofobica, essi tendono a interagire con altre strutture idrofobiche minimizzando la superficie esposta.

Si noti che il misfolding deriva dal fatto che dei tratti idrofobici, che nella proteina nativa non sono destinati a interagire l’uno con l’altro, possono incontrarsi casualmente nel corso del folding e formare degli intermedi ripiegati in modo scorretto (misfolded) e dotati di una certa stabilità termodinamica, talché essi possono permanere indefinitamente se non sono trattati con chaperoni o in altro modo (es.: agenti chimici).

Folding funnel e stabilità termodinamica

Due rappresentazioni del folding funnel “imbuto di ripiegamento”: quella tradizionale e quella che include i fenomeni di aggregazione. In tutti i casi le pareti dell’imbuto sono frastagliate a indicare la possibilità di intrappolamento delle forme misfolded in minimi locali di energia libera. Si ritiene che la forma nativa rappresenti un minimo globale (non tenendo in conto della formazione di aggregati stabilizzati dalle interazioni intermolecolari).

L’imbuto di ripiegamento è un modo per rappresentare il ripiegamento di una proteina. In uno sguardo, esso include tutti i dati fondamentali. Tanto più l'imbuto è largo, maggiore è l'entropia. In ordinate vi è l'energia. La proteina sfoldata ha una quantità enorme di diverse conformazioni a livello statistico, ma man mano che la proteina si ripiega, diminuisce il numero di conformazioni possibili e ciò è spinto dall'energia, in quanto le forme intermedie sono sempre più stabili termodinamicamente. La forma nativa è quella che ha un minimo globale di energia, ossia non vi è una struttura più stabile di quella. Questo concetto sta alla base del principio enunciato da Anfisen. Vi sono dei minimi locali di energia libera, stati metastabili, dove una molecola, ripiegandosi, può incastrarsi. Tali minimi vengono definiti come buchi di minimi locali, che corrispondono a condizioni misfolded. In assenza di interventi esterni la proteina può rimanere in quello stato ed è per questo che si necessita degli chaperon, che garantiscono la corretta conformazione e impediscono che le proteine rimangano nei minimi globali energetici. Vi è un'altra coordinata verticale Q, che indica la frazione di interazioni native in qualsiasi stato del folding della proteina. Quando Q=1 indica la proteina nativa e aumenta di pari passo che procede il folding. In termini strutturali questi minimi locali indicano che dei tratti idrofobici si incontrano e associandosi formano degli intermedi stabili, ma misfolded.

In questo caso dobbiamo immaginarci una proteina che si ripiega, ma isolata da altre proteine e ciò è possibile solo in vitro. Tale condizione è possibile ottenerla diluendo la proteina numerose volte. Questo schema rappresenta lo stato reale delle cose. A destra vi sono molte interazioni intermolecolari, come accade realmente, e si creano aggregati molecolari. Negli aggregati amiloidi, ad esempio, la stabilità potrebbe anche essere maggiore rispetto alla forma nativa.

Chaperoni molecolari

La denominazione di chaperone molecolare include:

• Le chaperonine, un tipo di chaperoni la cui struttura è fatta in modo da formare una cavità in cui sono confinate le proteine in via di ripiegamento, prevenendone così l’aggregazione.
• I chaperoni in senso stretto, che non presentano cavità, ma solo superfici idrofobiche esposte che si legano a quelle delle proteine in via di ripiegamento.

Per quale ragione l’aggregazione è un rischio sempre incombente nel corso del ripiegamento proteico in vivo? La ragione è che la concentrazione intracellulare delle proteine è elevatissima: 300-400 g/Litro (la concentrazione plasmatica è di 70mg/ml). Se immaginiamo che il processo di aggregazione avvenga a seguito dell’incontro di due molecole proteiche (che indichiamo con A), avremo che la velocità del processo (v) è data da:

Le reazioni di secondo ordine prevedono che due molecole si incontrino per poter reagire e dare i prodotti. L'incontro è drasticamente favorito dalla concentrazione dei reagenti. Secondo la cinetica chimica, si tratta di un processo del secondo ordine. È facilmente dimostrabile che la velocità del processo quadruplica se raddoppia la concentrazione dei reagenti, centuplica se decuplica la concentrazione dei reagenti, e così via. In breve, è un processo drasticamente favorito dalla elevata concentrazione dei reagenti, e quindi l’alta concentrazione intracellulare delle proteine è il fattore determinante nel promuovere l’aggregazione proteica (tanto più che almeno in certi casi l’aggregazione potrebbe avvenire con una cinetica di ordine superiore al secondo, e quindi essere ancora più dipendente dalla concentrazione di quanto non sia rappresentato dal semplice esempio che abbiamo proposto).

In termini semplificati potremmo dire che gli chaperoni promuovono il folding corretto non solo prevenendo l’aggregazione, ma anche abolendo le interazioni intra-molecolari scorrette. Dopo la loro azione, la proteina può ricercare nuovamente (e iterativamente) le interazioni corrette.

Lo chaperone può intervenire sulla proteina e interagire con un tratto idrofobico che era in associazione con un altro tratto idrofobico in conformazione misfolded e può eliminare tale interazione. La proteina è nuovamente in grado di cercare la conformazione corretta. Se lo chaperone interviene molte volte, la proteina viene messa in condizione di dover cercare sempre la conformazione corretta.

Sulla base di questa modalità generale di azione del chaperone ci si può domandare perché il folding alla fine evolva (quasi) sempre verso la forma nativa (correttamente ripiegata). Per dare una risposta a questo riguardo si deve assumere che, almeno di norma, il grado di stabilità delle diverse interazioni idrofobiche implicate si ponga nella sequenza seguente:

Se l'interazione tra chaperone e tratto idrofobico della proteina è maggiore dell'interazione tra tratto idrofobico e tratto idrofobico lo chaperon entra, ma lo chaperon potrebbe rimanere legato alla proteina. Gli chaperoni, pertanto, ciclano sempre tra una conformazione ad alta affinità verso una a bassa affinità.

Si pensava che tale processo fosse spontaneo e che non richiedesse utilizzo di ATP, in quanto è una trasformazione che avviene in discesa.

Sulla base di questi presupposti la proteina in via di ripiegamento converge ultimamente verso la conformazione nativa, come illustrato nella figura successiva. Questa dinamica va sotto il nome di kinetic partitioning (ripartizione cinetica). La proteina nell’immagine è appena stata sintetizzata ed è ancora in uno stato unfolded. Vi possono essere delle interazioni che portano la proteina ad una conformazione missfolded e allora può intervenire uno chaperon che le fa raggiungere la forma nativa. Successivamente la proteina viene rilasciata ed è libera di proseguire la sua strada. Il concetto di ripartizione cinetica consiste nel portare la proteina alla forma nativa.

Heat shock proteins (Hsps)

Sono proteine sovraespresse a seguito di shock termico, ma generalmente anche in una molteplicità di condizioni di stress (freddo, ipossia, stress ossidativo). Le Hsps sono per lo più chaperoni, ma esistono anche Hsps che non lo sono. Inversamente, non tutti i chaperoni sono sovraespressi in condizioni di stress. Con il termine heat shock proteins si va ad indicare una definizione fenomenologica.

Nel seguente esperimento, diverse cellule sono state sottoposte a temperature diverse. Con sds-page si può notare che a 45°C si ha la comparsa di un gruppo particolare di proteine. Tali proteine sono degli chaperon di tipo Hsps.

I principali chaperoni molecolari

• Sistema delle Hsps70: Questi chaperoni si trovano in tutti gli organismi. Hsp 70 (70 indica la massa molecolare) si trova sia in eucarioti e procarioti e sono quelli che di default intervengono in qualsiasi situazione. Hsp70 è assistita da Hsp40 e da fattori nucleotidici. Negli eucarioti ci sono molti fattori di scambio nucleotidico a differenza dei procarioti, dove si ha un solo fattore di scambio nucleotidico. Il ripiegamento in vivo può essere o co-traduzionale (la proteina è già ripiegata durante la sintesi, avviene soprattutto negli eucarioti) o post-traduzionale (proteina viene sintetizzata e poi ripiegata). Si ha consumo di ATP. Hsp70 e DnaK sono omologhi e hanno essenzialmente la stessa struttura e lo stesso meccanismo di funzionamento, come anche Hsp40 e DnaJ.
• Chaperonine: Le chaperonine hanno una cavità centrale che accoglie la proteina, che in questo caso, non interagisce con altre proteine. La superficie interna della cavità cicla da conformazione ad alta affinità a conformazione a bassa affinità. Le chaperonine eucariotiche e procariotiche, Hsp60 e GroEL (scoperto in E.coli una mutazione di questi geni che erano incompatibili con la crescita), non sono omologhe. Anche gli eucarioti hanno chaperonine procariotiche che sono localizzate nei mitocondri. GroES crea un cappuccio che confina la cavità di GroEL. Solo le chaperonine eucariotiche sono formate da due subunità. Le chaperonine possono solo fare folding post traduzionale. Le proteine per poter essere trattate dalle chaperonine devono essere completamente distaccate dal ribosoma.
• Chaperone associato a ribosoma: Vi è un canale di uscita, nei ribosomi, per la catena polipeptidica in via di sintesi. Negli eucarioti vi è uno chaperone associato al ribosoma che non è omologo a quello dei procarioti, ma svolgono la stessa funzione: ricevono il peptide in uscita e lo portano alla sua conformazione nativa. Può essere una modificazione di tipo solo co-traduzionale e non consumano ATP, in quanto sfruttano la propulsione del ribosoma.
• Prefoldina: È solo eucariotica e ha un ruolo del tutto passivo senza consumo di ATP. Prenderebbe in consegna le proteine e le consegnerebbe a TRIC chaperonina eucariotica.
• Small Hsps: Sono piccole proteine. Se vi è una condizione di stress molto elevata, molte proteine tendono ad esprimere l'interno idrofobico, ma le small HSPS legano tali proteine e attendono l’arrivo di altri chaperon che siano in grado riportarle nella conformazione nativa.

Vi sono differenze nelle modalità con cui gli chaperoni assistono i diversi organismi dei diversi regni (eubacteria, archea e eukaria). A livello molecolare, il citosol eucariotico è molto più simile a quello archibatterico che non a quello eubatterico (vale a dire, i procarioti in senso stretto):

Esempi di strutture o eventi molecolari simili:

• Inizio sintesi proteica: in eucarioti e archibatteri inizia con Met (nei procarioti con formil-Met)
• Strutture molecolari molto simili in eucarioti e archibatteri:
  • DNA polimerasi
  • Proteina Rec
  • Proteasoma
  • Aspartil-tRNA sintetasi
  • Presenza di introni
  • Alcuni chaperoni molecolari

Si ritiene pertanto che il citosol eucariotico sia una derivazione di quello archibatterico. Negli eubatteri, all'uscita del canale del ribosoma si ha DnaK simile a Hsps40 degli eucarioti. Le chaperonine trattano un repertorio molto ristretto delle proteine, infatti negli eubatteri, la maggior parte delle proteine si ripiega senza l'aiuto degli chaperoni, ma comunque una frazione importante del totale, senza chaperoni non riuscirebbe a raggiungere la forma nativa.

1. Eubatteri. Catene nascenti probabilmente interagiscono generalmente con TF, le proteine più piccole (circa 65 a 80% del totale) piegano rapidamente durante la sintesi, senza ulteriore assistenza. Le catene più lunghe (dal 10 al 20% del totale) interagiscono successivamente con DnaK e DnaJ che le ripiegano in più cicli, che dipendono dall’ATP per il legame e per il rilascio. Circa il 10 al 15% delle catene vengono ripiegate dal sistema di chaperonine - GroEL e GroES -. GroEL non si lega a catene nascenti ed è quindi probabile che riceva una frazione apprezzabile dei suoi substrati dopo la loro interazione con DnaK.
2. Archaea. Solo alcune specie di archea contengono DnaK / DnaJ. L'esistenza di un ribosoma-bound NAC omologo, così come l'interazione di PFD con catene nascenti, non è ancora stata confermata sperimentalmente.
3. Eukarya - l'esempio del citosol mammiferi. Come TF, NAC probabilmente interagisce con catene nascenti. La maggior parte delle piccole catene può piegare al momento del rilascio del ribosoma, senza ulteriore assistenza. Circa il 15 al 20% delle catene raggiunge i loro stati nativi in grazie alla relazione con Hsp70 e Hsp40, e una frazione di questi devono essere trasferiti da Hsp90 per la piegatura. Circa il 10% di catene sono co o post-traduzionali e vengono trasferite dalla chaperonina Tric in una reazione mediata da PFD.

Un quadro sintetico delle proprietà dei maggiori chaperoni molecolari

Sistema delle Hsp70

• DnaK (Hsp70 negli eucarioti)
  • È un monomero
  • Dominio N-term.: 44 kDa. Ha attività ATPasica
  • Dominio C-term.: 27 kDa. Consiste di un sub-dominio a b-sandwich con la fenditura dove viene legato il peptide substrato (in conformazione estesa) e il “latch” (chiavistello) con struttura ad a-elica. All’estremità C-terminale è presente la sequenza EEVD (glutammato, valina e aspartato), implicata nell’interazione con altri chaperoni.
• DnaJ (Hsp40 negli eucarioti)
  • Monomero di 40 kDa
  • Dominio N-term.: lega DnaK
  • Dominio C-term.: lega il peptide substrato