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Biochimica cellulare

ppunti di biochimica cellulare basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Tortora dell’università degli Studi di Milano - Unimi, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea magistrale in biologia applicata alla ricerca biomedica. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biochimica cellulare docente Prof. P. Tortora

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La struttura del proteasoma 20S confrontata con quella della

chaperonina eucariotica

La somiglianza strutturale, almeno a grandi linee, tra GroEL e proteasoma 20 S è legata al fatto che la funzione di

entrambi i complessi multiproteici esige il confinamento di una cavità interna dall’ambiente citosolico in cui i essi

si trovano. Complessi dell'anello: il proteasoma 20S e GroEL.

(Sinistra) Il proteasoma 20S è composto da quattro

anelli sovrapposti, a sette elementi. Nel proteasoma

20S di T. acidophilum, i due anelli esterni

comprendono sette copie di una subunità alfa di 25,9

kilodalton e i due anelli interni comprendono sette

copie di una sottounità di beta 22,3-kilodalton.

Questi anelli costituiscono un canale centrale con tre

camere: due anticamere affiancano una camera

interna che ospita i siti catalitici (sfere gialle).

(Destra) La chaperonina GroEL è un omo-oligomero

formato da due anelli sette-membri di sottogruppi 57-kilodaltonici impilati all'indietro. Gli anelli GroEL

costituiscono un ampio canale aperto a entrambe le estremità del cilindro ma probabilmente bloccato all'equatore.

La subunità di GroEL è composta da una regione apicale (A), intermedio (I) e equatoriale (E). I siti vincolanti del

polipeptide (ovali gialli) sono dei patch idrofobici sulla faccia interna di ciascun dominio apicale.

50

Il proteasoma eucariotico

 Nel proteasoma 26S il complesso 20S porta legati due complessi 19S, ciascuno in corrispondenza di una

delle due aperture

 Nel citosol il proteasoma 20S si trova sia legato ai 19S (formando il citato complesso 26S), sia isolato

 Si ritiene che il 20S isolato degradi proteine denaturate (possono entrare nella cavità centrale anche senza

uno specifico meccanismo di controllo)

 Il 26S degrada per lo più (ma non solo) proteine in forma nativa dopo che sono state ubiquitinate

Una considerazione di carattere generale

Negli archibatteri è presente il proteasoma, ma non il sistema dell’ubiquitina. Questo si è quindi sviluppato nel

corso dell’evoluzione successivamente al proteasoma stesso. L’“invenzione” dell’ubiquitina è probabilmente una

modalità per semplificare i meccanismi di riconoscimento selettivo delle proteine substrato. Se esse fossero

riconosciute mediante segnali intrinseci (come sequenze specifiche e/o loro modificazioni post-traduzionali), il

proteasoma dovrebbe possedere un numero elevatissimo di siti di riconoscimento (tanti quanti sono le sequenze da

riconoscere). Un segnale estrinseco semplifica enormemente il problema, in quanto il proteasoma deve

riconoscere, in linea di principio, solo un segnale. Inoltre ciò facilita la regolazione del processo degradativo (la

proteina viene ubiquitinata solo c’è bisogno di degradare la proteina bersaglio) e probabilmente facilita il

controllo di qualità (la deubiquitinazione richiede tempo, e prima che questa sia completata, una proteina

erroneamente destinata al proteasoma potrebbe essere riconosciuta come tale e quindi rilasciata).

51

Conoscenze recenti sulla struttura del proteasoma

Nella struttura del proteasoma 19S ad

alta risoluzione ottenuta di recente è

visibile il canale centrale (nella cross

section) dove passano i substrati. Le

sei subunità adagiate sul proteasoma

20S contornano la maggior parte del

decorso di questo canale. Tali subunità

sono dette Rpt (Regulatory particle

ATPase) in quanto possiedono attività

ATPasica, e sono numerate da Rpt1 a

Rpt6. Ciascuna subunità è formata da

due dominii: un dominio ATPasico (in

diretto contatto con il proteasoma 20S, evidenziate in blu scuro) e uno non ATPasico detto (Oligosaccharide-

Binding, in blu chiaro), soprastante il dominio ATPasico. I dominii ATPasici sono detti AAA (ATPase Associated

with diverse cellular Activities), e si riscontrano anche in molte altre proteine (ad esempio i complessi procariotici

ClP). I dominii AAA srotolano le proteine substrato, e la loro estremità Cterminale è anche in grado di allargare il

poro di entrata del 20S al loro arrivo. Esistono inoltre diverse altre subunità, denominate collettivamente Rpn

(Regulatory particle non ATPase), strutturalmente e funzionalmente molto più disomogenee delle Rpt. Ad

esempio, Rpn1 lega altre subunità del proteasoma che si associano in modo non-stechiometrico (quindi possono

essere presenti in quantità diverse a seconda delle situazioni, e perciò non sono rappresentate in figura): tali

subunità sono recettori addizionali dell’ubiquitina. Rpn10 e Rpn13 hanno a loro volta attività di legame delle

catene di ubiquitina e Rpn2 ha un ruolo nell’orientarle propriamente verso il substrato proteico. Rpn11 è una

metalloproteasi ad attività deubiquitinasica. Altre sette subunità formano una sorta di pinza (in giallo) che si

estende dall’anello delle subunità a del 20S fino alla estremità distale del 19S (interagendo con Rpn2). Tale

complesso di subunità ha un ruolo strutturale ma sembrerebbe anche regolare allostericamente le attività delle

diverse subunità 19S. In sintesi le attività riscontrate nel proteasoma 19S sono: 1) srotolamento del substrato e

apertura del poro di ingresso del 20S in modo dipendente da ATP; 2) legame delle catene di ubiquitina; 3) taglio

dell’ubiquitina; 4) ruoli strutturali e regolativi. Nel proteasoma 19S le subunità cataliticamente attive sono b1, b2 e

b5, rispettivamente con attività caspasi-simile (attacca la catena polipeptidica a valle di residui acidi), tripsino-

simile (basici) e chimotripsino-simile (idrofobici voluminosi).

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Ubiquitina

 76 aa, 8.5 kDa

 stabile al calore

 si folda in una

struttura

globulare

 trovato in tutte le

cellule

 trovato in tutte le

cellule

eucariotiche

 umani e vitello

condividono il

96% di sequenze

 coinvolti in molti

processi cellulari 53

Gli aspetti base del meccanismo di ubiquitinazione

1. E1 Lega la Ub formando un legame ad alta

energia (=attivazione)

2. E2 trasferisce alla proteina substrato la Ub,

o direttamente o per il tramite dell’E3

3. E3 è la struttura principale di

riconoscimento delle proteine substrato

I geni dell’UPS (Ubiquitin-Proteasome System)

rappresentano circa il 5% del genoma!

 E1’s- 1-2 attivano l’enzima

 E2’s- 10-20 coniugano l’enzima

 E3’s- 500-800 ubiquitina ligasi, guida la specificità

 DUBs- 100 ubiquitina specifiche proteasi, regolatori del pathways

Esistono diversi tipi di E3: Nel caso degli HECT domain E3s, l’ubiquitina è traferita da E2 a E3, e quindi da E3

alla proteina substrato. Nel caso dei RING domain E3, l’ubiquitina è trasferita direttamente da E2 alla proteina

substrato, mentre E3 riconosce quest’ultima e fa da ponte con E2.

A) Il domino HECT di E3s si lega

all’affine E2s al dominio conservato

HECT e transientemente accetta

l’ubiquitina ad un residuo di

cisteina nella regione; una differente

regione dello stesso polipeptide lega

il substrato attraverso un elemento

nel “degron”.

B) Il dominio ad anello dell’E3s sono

impalcature proteiche che usano il

dominio ad anello per legare l’E2 e

un diverso dominio per legare il

substrato. Nel SCF e altri domini ad

anello a multisubunità E3s, l’anello e il substrato legano domini che si dispongono in polipeptidi separati.

Gli E3 sono responsabili del trasferimento dei substrati.

Il segnale specificamente riconosciuto dal complesso 19S del proteasoma è la tetraubiquitina, nella quale le unità

di ubiquitina sono legate tra loro a livello delle Lys48. Tale tetraubiquitina è riconosciuta con alta affinità (ca. 30

nM) dal 19S. Associazioni di più di 4 ubiquitine non comportano molto maggiore affinità; catene più brevi (3 o

meno) hanno un’affinità drasticamente ridotta (ciò dimostra appunto che il segnale fisiologico di destinazione al

proteasoma è la tetraubiquitina). 54

Esiste un ampio repertorio di modificazioni strutturali delle

proteine peptidi che le destina alla ubiquitinazione

Sono mostrate modificazione post-

traduzionali e altri meccanismi che

regolano il riconoscimento del substrato

affine da diversi E3s.

Quali sono i segnali di ubiquitinazione?

Il sistema dell’ubiquitina riconosce quasi

tutto. Riconosce i più diversificati tratti

strutturali. Il meccanismo di fosforilazione

è in cima alla lista perché è molto diffuso

per la modificazione delle proteine.

Spesso i segnali di ubiquitinazione sono

condizionali, ossia si attivano in determinate circostanze, ad es. una proteina viene fosforilata e dove viene

aggiunto il fosfato viene riconosciuto come segnale di ubiquitinazione.

Esistono diversi segnali ubiquitinici, che indirizzano le proteine substrato a destini diversi, tra i quali la

destinazione al proteasoma è soltanto una tra le tante (anche se comunque di primaria importanza)

L’ubiquitina è stata utilizzata nell’evoluzione come segnale di altro tipo e la diversità dei segnali si attua

realizzando legami isopeptidici di tipo diverso rispetto a quello caratteristico di ubiquitizzazione al proteasoma.

La prima ubiquitina si lega ad una lisina, generando una struttura a catena. Se i legami sono diversi si genera una

struttura 3D diversa e da origine dei tratti strutturali che hanno diverse caratteristiche rispetto a quello del K48.

Quindi il sistema dell’ubiquitina è stato utilizzato anche per l’endocitosi, riparazione del DNA, processo di

degradazione. 55

Gli enzimi deubiquitinanti (= ubiquitina idrolasi)

Negli eucarioti, esistono parecchie decine di enzimi deubiquitinanti. Alcuni sono associati al proteasoma (come

già descritto), mentre altri sono liberi nel citosol o associati ad altri comparti cellulari (vedere figura qui sotto).

Tale complessità si spiega anche con il fatto che esistono molti diversi tipi di ubiquitinazione (non solo K48 per la

degradazione proteasomale, ma anche K63, ecc.), e di conseguenza deve necessariamente esistere una batteria

molto diversificata di enzimi deubiquitinanti. Per quanto riguarda le deubiquitinasi associate a proteasoma 19S,

queste riconoscono le poliubiquitine K48 e le rimuovono secondo tre diverse modalità:

1. sequenzialmente dal residuo distale

(DUB1);

2. direttamente a livello del legame

isopeptidico instaurato con la proteina

substrato e conseguente rimozione in

blocco della tetraubiquitina (DUB2);

3. oppure disassemblando la tetraubiquitina

dopo che questa è stata distaccata da una

proteina substrato (DUB3).

Complessivamente, questi processi hanno il ruolo

di rendere la proteina substrato capace di accedere al canale centrale del proteasoma 20S (DUB1 e DUB2), di

consentire il “proofreading” (correzione di bozze: DUB1), dando tempo a una proteina scorrettamente associata al

19S di venire rilasciata, e infine di disassemblare le singole unità di ubiquitina rendendole disponibili per ulteriori

eventi di ubiquitinazione (DUB3). Sistema del proteasoma Ub. Il substrato è

coniugato da ramificazioni della catena

polyUb attraverso l’azione di E1, E2 e E3.

Nella catena di legame, molecole Ub 1 e 4

sono le prossime e distal Ubs,

rispettivamente; K denota un substrato di

residui di lisine. DUB1 è un enzima 19s

associato alla deubiquitinazione, che rimuove

le molecole di Ub sequenziamente dalla

catena terminale distale; DUb2 fissa la catena

al substrato e DUB3 disassembla la catena

non ancorata di inizio al capolinea. 56

DUBs proteasomali (approfondimento)

Il proteasoma 26S è un assemblaggio di proteine di 2,5 MDa, che è responsabile della degradazione della maggior

parte delle proteine citosoliche. È composto da due grandi sub-complessi corrispondenti al nucleo catalitico 20S

(CP, particella nucleare) e due copie della particella regolatrice 19S (RP; particella di regolazione) che possono

essere suddivisi in componenti di base e coperchio. La base contiene un anello di 6 ATPasi omologhe che

promuovono lo sviluppo del substrato e la traslocazione nella camera catalitica 20S attraverso un canale stretto

(13 Å). L’RP include due recettori di ubiquitina e tre distinte attività DUB tra le sue proteine costituenti.

Uno di questi, POH1 / PSMD14 / Rpn11 (qui di seguito denominato POH1), è costituito costantemente in

quantità stechiometriche ed è richiesto per l'assemblaggio RP. Gli altri due, USP14 (Ubp6 in lievito) e

UCH37 / UCHL5 (non presenti nel lievito), sono reversibilmente associati. È stato suggerito che DUBs

proteasomali siano coinvolti nel riciclaggio di ubiquitina, anche direttamente accoppiando questo al degrado

delle proteine, o in "lettura di prova-profreading" al proteasome, per cui alcune proteine possono essere

recuperate dalla degradazione. La deubiquilitazione è necessaria per il rilascio del substrato dalle proteine

dal recettore ubiquitina. Se il taglio della catena di ubiquitina sequenziale supera il dispiegamento /

translocazione del substrato, può provocare la dissociazione dal proteasoma e il recupero della proteina.

Viceversa, la deubiquilitazione ritardata porta all'occlusione di siti di legame del substrato e blocca il proteasoma.

Solo la rottura di siRNA di POH1 interferisce con l'assemblaggio di proteasomi, mentre l'esaurimento di USP14 o

UCH37 da soli aumenta i tassi di degradazione della proteina, ma il loro esaurimento combinato inibisce l'attività

proteasomica. Le cellule del lievito rispondono all'esaurimento di ubiquitina aumentando l'ortologo USP14 Ubp6,

che ripristina i livelli di ubiquitina.

Il topo di atassia (axj) presenta gravi tremori a 2-3 settimane di età, riflettendo la trasmissione sinaptica difettosa,

che risulta da una mutazione intronica, portando alla perdita di espressione completa di USP14. I fenotipi

osservati probabilmente riflettono l'esaurimento del pool sinaptico di ubiquitina osservato nei topi axj, in quanto

possono essere salvati sia dall'espressione specifica del neurone di Usp14 che dall'uccisione stessa.

57

Esempi specifici. La regola dell’N-terminale: sia in procarioti

sia in eucarioti la velocità di degradazione delle proteine è

determinata dal residuo all’N-terminale

Producendo una beta-galattossidasi con un

residuo X variabile, hanno calcolato il tempo

di dimezzamento. Si è notato che ci sono

alcuni aa che sono fortemente destabilizzanti.

Nei procarioti vi è un meccanismo molto

simile a quello dell’ N-terminale, ma meno

elaborata. Procarioti ed eucarioti condividono

un certo repertorio di aa come quelli basici e

quelli idrofobici come la leucina. La regola

del’N-terminale precede quello

dell’ubiquitina.

Negli eucarioti, certi residui all’N-terminale

sono riconosciuti dal sistema

ubiquitinaproteasoma e le proteine che li

contengono sono destinate alle degradazione.

In generale, un tratto strutturale presente su

una proteina che destina la proteina stessa alla

degradazione è detto degrone. Un N-

terminale che destina alla degradazione è detto N-degrone.

Gli N-terminali possono essere modificati a seguito di vari stimoli; in particolare un residuo stabilizzante può

essere sostituito da, o trasformato in un residuo destabilizzante (cioè che destina alla degradazione), modificando

così il turnover della relativa proteina. Quando ciò avviene, l’Nterminale è un segnale condizionale, cioè non

permanente, ma che compare in un determinato momento della vita della proteina. La figura che segue dà una

visione d’insieme del codice della regola dell’N-terminale.

Il controllo della degradazione

proteica attuato dalla regola dell’N-

terminale è essenzialmente

condizionale. Ciò si basa sul fatto

che esistono residui destabilizzanti

primari secondari e terziari. I

residui primari sono direttamente

riconosciuti dal sistema UPS,

diversamente da quelli secondari e

terziari, che però possono portare

alla comparsa all’N-terminale di un

residuo primario attraverso una

cascata enzimatica. Ad esempio,

un residuo destabilizzante

terziario può essere prima

convertito in un destabilizzante

secondario, e a questo evento può far seguito l'aggiunta enzimatica di un residuo destabilizzante primario,

destinando così la proteina alla degradazione. In cellule di lievito e di mammifero, per esempio, Asn e Gln

rappresentano residui destabilizzanti terziari che possono essere convertiti da enzimi deamidanti (deamidasi) in

residui secondari destabilizzanti, vale a dire, Asp e Glu, rispettivamente. I residui secondari, a loro volta, sono

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substrati per la coniugazione di Arg, catalizzata da una arginil transferasi. Infine, la Arg è riconosciuta

direttamente come residuo destabilizzante dai sistemi ubquitinanti e la proteina viene ubquitinata. Naturalmente il

sistema descritto ha senso in quanto si presta molto bene ad essere soggetto a meccanismi regolativi. È

interessante notare che l'organizzazione gerarchica della regola dell’N-terminale è evolutivamente conservata. Si

riscontra infatti anche nei procarioti.

Nei mammiferi, la cisteina non subisce una trasformazione enzimatica, ma è un sistema che è stato abilmente

sfruttato in risposta a stress ossidativi. Lo zolfo della cisteina si ossida e la forma ossidata viene riconosciuta

dall’ubiquitina e ciò serve come risposta a stress osssidativo.

Alcuni eventi cellulari regolati attraverso la regola dell’N-

terminale

Quali sono i processi controllati dalla degradazione di proteine mediante la regola dell’Nterminale, e quali

stimoli causano la destabilizzazione delle proteine mediante sostituzione di un residuo stabilizzante con uno

destabilizzante, o mediante l’aggiunta di un residuo destabilizzante? Le conoscenze al riguardo sono ad oggi

molto più limitate rispetto a quelle che si hanno circa le modalità descritte di indirizzamento dell’N-degrone al

sistema ubiquitina-proteasoma. Riportiamo qui di seguito due meccanismi accertati di controllo della

degradazione attraverso la regola dell’N-terminale

1) PTR2 è un importatore di di- e tripeptidi in lievito. L’espressione di PTR2 è indotta da aminoacidi, ma anche da

dipeptidi con residui N-terminali destabilizzanti. Dipeptidi e amminoacidi si legano a UBR1, che è una ubiquitina

ligasi (=E3) coinvolta nel controllo della degradazione inbase alla regola dell’N-terminale. Legandosi, accelerano

allostericamente la degradazione dipendente da UBR1 di CUP9, che è un repressore trascrizionale di PTR2. La

degradazione di CUP9 attiva la trascrizione PTR2 e aumenta la capacità della cellula di importare peptidi.

2) Un altro meccanismo di controllo della degradazione attraverso la regola dell’N-terminale nei mammiferi e nel

lievito è mediata dalla coniugazione dell’arginina, attraverso l’arginil-transferasi, a un aspartato, o

glutammato, o cisteina ossidata, all’N-terminale delle proteine bersaglio. Ciò ne stimola la degradazione.

L’azione della arginil-transferasi di topo o di lievito è inibita da emina (che differisce dall’eme per contenere Fe3+

anziché Fe2+. Anche in questo caso si tratta di un segnale di stress osssidativo). L’inibizione si attua attraverso

due meccanismi: un meccanismo redox che comporta la formazione di un ponte disolfuro tra i residui Cys71 e

Cys72 dell'enzima e inoltre l’attivazione della degradazione mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma

della arginil-transferasi medesima. In aggiunta, l’emina lega e inibisce la arginil-tRNA sintetasi, e ciò

impedisce la funzione della transferasi per mancanza del suo substrato (Arg-tRNA). Ciò porta alla mancata

arginilazione delle proteine bersaglio della arginil-trasferasi e alla loro stabilizzazione (vedi schema sotto).

Viene proposto che la regola dell’N-

terminale potrebbe coordinare l’azione

di piccoli effettori reagendo allo stato

ossidoriduttivo di eme, ossigeno, ossido

di azoto, tioli, e altri composti,

attraverso la degradazione

condizionale di specifici fattori di

trascrizione quali CUP9 (appunto

stabilizzati da emina).

Sequenze PEST

Sono sequenze statisticamente più ricche

della media di prolina, glutammato, serina, treonina (NON sono quindi sequenze consenso). La presenza di una

sequenza PEST comporta un elevato turnover per la proteina che la contiene. Esistono programmi per assegnare

un punteggio a putative sequenze PEST (da -50 a +50), a seconda della abbondanza relativa dei quattro

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amminoacidi. Al di sopra di una certa soglia (+5) è altamente probabile un elevato turnover. A tutt’oggi non è ben

chiaro il meccanismo con cui destinano alla degradazione, ed è possibile che diverse sequenze PEST stimolino la

degradazione secondo meccanismi diversi. Di certo nella larga maggioranza dei casi destinano le proteine al

proteasoma: sono spesso segnali di ubiquitinazione (ad esempio nel caso dell’oncosoppressore p53 o della

proteina IkB). Esistono però altri casi in cui sono segnali intrinseci di indirizzamento al proteasoma 26S, vale a

dire non richiedono l’ubiquitinazione. Il caso più noto e descritto è quello della ornitina decarbossilasi. Esistono

anche evidenze che alcune proteine con sequenze PEST siano substrati di calpaine, un tipo di proteasi citosoliche

attivate da calcio.

Ci si chiede se le sequenze PEST siano un segnale costitutivo di degradazione (vale a dire, destinano

permanentemente la proteina implicata alla degradazione) o condizionale (vale a dire sono attivati solo in

determinate condizioni metaboliche). Si ritiene che per lo più si tratti di segnali condizionali. Ad esempio la

fruttosio bisfosfatasi di lievito ha una sequenza PEST che viene fosforilata su una serina, e solo a seguito di ciò la

proteina viene indirizzata al proteasoma. Dati recenti suggeriscono che le sequenze PEST siano molto

frequentemente fosforilate (e ciò potrebbe generare il segnale per la loro degradazione nel proteasoma)

Notate che le sequenze PEST, in considerazione degli amminoacidi che contengono, sono sequenze polari e

disordinate; quindi devono essere esposte al solvente. Sono perciò facilmente riconoscibili e/o modificabili dai

sistemi intracellulari (contengono in particolare serina e treonina, amminoacidi fosforilabili). Osservazioni recenti

indicano che molte proteine con sequenze PEST sono intrinsecamente disordinate.

In sostanza, i dati disponibili suggeriscono che le sequenze PEST non rappresentino un unico ben definito segnale

di degradazione, ma che l’abbondanza dei 4 amminoacidi (P, E, S, T) generi sequenze particolarmente adatte a

farne dei degroni, secondo modalità diverse. Almeno due caratteristiche sono in linea con questa aspettativa: il

fatto che siano sequenze esposte e che siano fosforilabili.

60

Alcuni processi regolati dal sistema ubiquitina-proteasoma

hanno come target fattori di trascrizione e portano alla

riprogrammazione estensiva del corredo proteico

1) Il caso dell’NF-κB (Nuclear Factor κ chain transcription in B cells)

Attivazione del percorso di segnalazione NF-# B. (A) Nelle cellule a riposo, il fattore di trascrizione dimerico NF-

κB, composto da subunità p50 e p65, viene sequestrato nel citosol, legato all'iniettore I-κBα.

 Fase 1: L'attivazione della trimerica I-κB chinasi è stimolata da molti agenti, tra cui l'infezione virale,

radiazioni ionizzanti, legame delle citochine proinfiammatorie TNFα o IL-1 ai loro rispettivi recettori o

attivazione di uno qualsiasi dei diversi recettori simili a Toll Componenti di batteri invasivi o funghi.

 Fase 2: La subunità β della chinasi I-κB poi fosforila l'inibitore I-κBα, che quindi lega una ubiquitina E3.

 Fasi 3 e 4: La successiva polibiquitilitazione legata a lisi 48 a I-κBα lo predispone per il degrado da

proteasomi.

 Fase 5: La rimozione di I-κBα disattiva i segnali di localizzazione nucleare in entrambe le subunità di

NF-κB, consentendo la loro traslocazione al nucleo.

 Fase 6: Nel nucleo, NF-κB attiva la trascrizione di numerosi geni bersaglio, incluso il gene che codifica I-

κBα, che agisce per terminare la segnalazione, dei geni che codificano varie citochine infiammatorie

tutti i fattori agiscono per il tramite della chinasi dell’inibitore dell’ikBalfa, che fosforilato dvnta il substrato per il

sistema dell’ubiquitina.

La degradazione della proteina dipendente da fosforilazione

regola NF-κB

Mentre i percorsi di segnalazione spesso portano alla fosforilazione di residui specifici nei fattori di trascrizione,

modulando direttamente la loro attività, gli studi in entrambe le cellule di mammiferi e in Drosophila hanno

portato alla dissezione di un meccanismo evolutivamente conservato attraverso il quale l'attività del fattore di

trascrizione è regolata dalla stabilità della proteina. La stimolazione delle risposte immunitarie in un'ampia varietà

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di cellule di mammiferi porta all'attivazione del fattore di trascrizione NF-κB (Figura 20-49). NF-κB è stato

scoperto in esperimenti biochimici sulla base del suo requisito nelle cellule B per la trascrizione del gene della

catena leggera κ di immunoglobuline (fattore nucleare κ trascrizione in cellule B). Le proteine correlate in

Drosophila mediano la risposta immunitaria e regolano l'espressione di geni specifici durante la prima

embriogenesi. Studi biochimici in cellule di mammiferi e studi genetici in mosche hanno fornito importanti

riflessioni su come questo fattore di trascrizione sia attivato da segnali extracellulari.

NF-κB è un eterodimero di due proteine correlate di 65 kD e 50 kD (p65 e p50). Queste proteine condividono una

regione di omologia ai loro N-termini che è richiesto per il legame del DNA e la dimerizzazione. Una visione

chiave del meccanismo che regola NF-κB è venuta da studi di localizzazione subcellulare. Nelle cellule di riposo,

NF-κB si trova nel citoplasma. In risposta ad un segnale extracellulare, NF-κB si trasforma nel nucleo, dove si

lega a siti specifici del DNA e regola la trascrizione. NF-κB viene sequestrato in uno stato inattivo nel citoplasma

mediante un legame diretto ad un inibitore chiamato I-κB. Una singola molecola di I-κB si lega al dominio N-

terminale di ciascuna sottounità nell'eterodimer p50 / p65, mascherando così le sequenze di localizzazione

nucleare. In risposta al segnale, I-κB viene fosforilato in due residui di serine N-terminale da un complesso di I-

κB chinasi. L'I-κB fosforilato è destinato ad una ubiquitina e degradato nel proteasoma. Un anello di feedback

negativo regola l'attività di NF-κB come un bersaglio precoce di NF-κB nel gene I-κB. Come abbiamo appreso nel

Capitolo 13, la degradazione dipendente dalla fosforilazione dell'inibitore dipendente dalla ciclina-chinasi, Sic 1,

svolge un ruolo centrale nella regolazione della progressione del G1-S nel lievito S. cerevisiae. Sembra quindi

probabile che il degrado della proteina dipendente dalla fosforilazione possa emergere come meccanismo di

regolamentazione comune in molti processi cellulari diversi.

2) Il caso del fattore inducibile da ipossia (HIF)

In presenza di ossigeno, una prolina dell’HIF-a è permanentemente idrossilato e destinato alla degradazione da

VHL (una ubiquitina ligasi). In assenza di ossigeno la prolina in

questione perde il gruppo ossidrilico e quindi HIF può attivamente

promuovere la trascrizione di un repertorio di proteine che

fronteggiano lo stress da ipossia. 62

Il ciclo cellulare è regolato dal sistema dell’UPS attraverso il

controllo della degradazione di un’unica proteina (la ciclina

mitotica)

Modello di regolazione del ciclo cellulare nelle cellule eucariotiche. Il passaggio attraverso il ciclo, dalla fase G1

alla fase S, è controllato da una ciclina mitotica chinasi dipendente. Sono composte da una subunità ciclina

regolatoria e da una subunità catalitica chinasi dipendente CDK. Due complessi di ubiquitina ligasi, SCF e APC,

poliubiquitinano specifici substrati, inclusi inibitori della fase S (fase 5), securina (fase8) e ciclina mitotiche (fase

9) formando i substrati per la degradazione dal proteasoma. La proteolisi degli inibitori della fase S, attivati dalle

cicline CDK della fase S, portano alla replicazione del cromosoma. La proteolisi garantisce la degradazione di

complessi proteici che connettono i cromatidi fratelli durante la metafase, in modo tale da iniziare l’anafase, la

fase mitotica nella quale i cromatidi fratelli sono separati e trasportati ai poli opposti. La riduzione dell’attività

delle cicline mitotiche CDK causata dalla proteolisi di cicline mitotiche permette gli eventi mitotici più tardivi e la

citodieresi. Queste divisioni proteolitiche guidano il ciclo in una determinata direzione grazie all’irreversibilità

della degradazione proteica. 63

Regolazione dei livelli di cicline in Xenopus nei primi stadi embrionali. nell’anafase tardiva. L’anafase promuove

il complesso di cicline di poliubiquitinazione mitotica APC. Non appena le cicline sono degradate dal

proteasoma, l’attività delle MPF chinasi declina precipitosamente, portando alla telofase. L’attività dell’APC è

diretta attraverso le cicline mitotiche da un fattore specifico, chiamato Cdh, che è fosforilato e in tal modo

inattivato dal complesso ciclina CDK della fase G1. Una specifica fosfatasi, chiamata Cdc14, rimuove i fosfati

regolatori dal fattore specifico Cdh1 nell’anafase tardiva. Una volta che il fattore specifico è inibito in G1, la

concentrazione di cicline mitotiche aumenta, eventualmente raggiungendo livelli così alti che stimola l’entrata in

una successiva mitosi. 64

MHC

Immunoproteasoma: Oltre al normale proteasoma, che degrada di routine le proteine cellulari mediante

meccanismi di norma specifici e controllati dalla ubiquitinazione (il cosidetto proteasoma housekeeping), esiste

una variante denominata immunoproteasoma. L’immunoproteasoma è una forma specializzata di proteasoma,

coinvolta nella risposta immunitaria a livello dei tessuti. In particolare, esso produce i peptidi immunogenici che

tutti i tipi cellulari possono esporre sulla superficie ad opera dei maggiori complessi di istocompatibilità di classe I

(MHC class I).

Gli MHC I e gli MHC II

Oltre agli MHC I esistono anche gli MHC II. Mentre gli MHC I sono presenti a livello della plasmamembrana di

tutti i tipi cellulari, gli MHC II si trovano solo sulla plasmamembrana di cellule specializzate nella fagocitosi:

cellule dendritiche, macrofagi, linfociti B.

 Gli MHC I espongono peptidi generati intracellularmente e riconosciuti come estranei: si tratta

soprattutto di prodotti di degradazione di proteine virali, ma anche di proteine derivanti da altre

condizioni patologiche, in particolare la trasformazione tumorale o determinate mutazioni.

 Gli MHC II espongono invece peptidi derivanti da molecole o organismi riconosciuti come estranei,

e quindi antigenici, che si presentano nell’organismo a livello extracellulare, quali batteri, parassiti e

tossine. Questi sono fagocitati dalle cellule specializzate (menzionate sopra) e degradati di norma nei loro

lisosomi.

La struttura di MHC I e MHC II

Gli MHC I consistono di due proteine: la

catena maggiore formata da 3 dominii α

omologhi, e che presenta un tratto

transmembrana che la ancora alla membrana

medesima; la β 2-microglobulina, consistente

di un unico dominio, legato non

covalentemente alla catena maggiore. Gli

MHC II consistono di due catene di

dimensione praticamente uguale, ciascuna

formata da due dominii omologhi ( α1 e α 2 in

una delle due; β 1 e β 2 nell’altra catena).

Entrambe presentano un tratto transmembrana. 65

Come MHC I e MHC II innescano la risposta immunitaria

Le strutture di MHC I e MHC II sono costruite in

modo da formare un solco in cui si accomodano i

peptidi antigenici. Data la ampia diversità di antigeni e

dei peptidi che ne derivano, il legame a livello del

solco è largamente aspecifico, tanto in MHC I quanto

in MHC II. Tuttavia i peptidi che si legano a MHC II

sono dimensionalmente molto più eterogenei

(lunghezza da 8 a 30 residui) rispetto a quelli che si

legano a MHC I (lunghezza da 8 a 11 residui). La

variabilità in lunghezza molto minore di questi ultimi

è una diretta conseguenza del fatto che tali peptidi

sono generati da un proteasoma.

A seguito della esposizione dei peptidi antigenici a

livello di MHC I e MHC II, viene attivata la risposta immunitaria. Essa è mediata dai linfociti T, che mediante

specifici recettori legano gli MHC, come schematicamente illustrato nella figura che segue.

Come gli MHC I prendono in carico i peptidi antigenici

Gli MHC I sono proteine di membrana e

come tali sono proteine della via

secretoria. Ciò implica che sono

traslocati e inseriti in membrana co-

traduzionalmente, vale a dire a livello

membrana del reticolo endoplasmico

(ER) già durante la loro sintesi. I peptidi

prodotti dall’immunoproteasoma e

destinati agli MHC I sono accorciati da

peptidasi citosoliche, ed anche nell’ER

da altre peptidasi (in particolare TPPII:

Tripeptidyl protease II). I peptidi

antigenici così rimaneggiati vengono

legati da MHC I nell’ER. Esiste quindi

un sistema per la loro traslocazione,

come illustrato nello schema che segue.

In particolare, il loro trasporto nell’ER

avviene mediante il TAP (Transporter Associated with Antigen Processing) che è specializzato per questo scopo.

Nel lume dell’ER, TAP è associato con la tapasina, una proteina che stabilisce la sua interazione con gli MHC I

vuoti, permettendo il legame con i peptidi (vedere schema che segue).

66

L’immunoproteasoma

Gli MHC di classe I espressi alla superficie cellulare presentano all’ambiente esterno peptidi antigenici in modo

che possano essere specificamente riconosciuti dai linfociti T citotossici (CTL). Queste cellule T specializzate

sono in grado di individuare altre cellule che esprimono al loro interno molecole proteiche estranee o aberranti

(cioè mutate) e successivamente rimuovere queste cellule indesiderate dal corpo. Questo sofisticato sistema di

riconoscimento dipende totalmente dalla presentazione di peptidi antigenici nel solco degli MHC I. La

generazione di questi peptidi richiede la degradazione delle proteine in frammenti peptidici di ben definite

dimensioni. Gli MHC I sono espressi su tutte le cellule nucleate dell’organismo, incluse le cellule specializzate

nella presentazione degli antigeni, come le cellule dendritiche. Essenzialmente, tutte le cellule producono peptidi

antigenici facendo uso delle proteasi normalmente coinvolte nel turnover delle proteine. Si tratta innanzitutto del

sistema ubiquitina-proteasoma, anche se oggi sono note diverse altre proteasi e peptidasi. Il sistema immunitario

ha sfruttato il proteasoma per selezionare, dai peptidi derivanti dai prodotti di degradazione delle proteine, quelli

adatti alla presentazione alla superficie cellulare. Pertanto, la generazione di peptidi antigenici può essere

considerato in buona parte come un sottoprodotto del turnover proteico basale.

Nei vertebrati si sono anche evolute delle subunità specializzate del proteasoma, il cui ruolo è essenzialmente la

produzione di antigeni da destinare alle MHC I per la “presentazione” extracellulare. Subunità specializzate sono

presenti nella componente catalitica 20 S degli immunoproteasomi (figura a lato), ma anche nei loro complessi

regolatori, come nell’attivatore PA28 del proteasoma (figura sotto). Sebbene il proteasoma sia il principale sistema

proteolitico responsabile della produzione dei peptidi antigenici, recenti evidenze suggeriscono che altre peptidasi

contribuiscono significativamente alla produzione del pool dei peptidi. Ad esempio, il proteasoma è

principalmente responsabile della generazione del C-terminale corretto del peptide che verrà presentato a livello

dell’MHC I, mentre l’Nterminale è spesso prodotto da successivi tagli proteolitici. In secondo luogo, una parte dei

peptidi può essere generata indipendentemente dal proteasoma. Ciò indica che altre eso- ed endo-peptidasi sono

coinvolte. Il prpoteasoma 20S è costituito da 28 subunità da 21 a 31 kDa,

che sono arrangiate in 4 anelli sfalsati ad eptameri. L’anello

esterno contiene le subunità alfa, l’anello interno le subunità beta.

3 delle sette subunità beta in ogni anello beta ospita un sito

attivo. In totale ci sono 6 siti attivi dentro al complesso 20S. Il

regolatore 19S, il quale si attacca ad entrambe le parti del core

del 20S, è composto da 6 subunità ATPasi e da 2 subunità non

ATPasiche, e il coperchio, che contiene 8-10 subunità no-

ATPasiche. Mediante induzione con IFN-gamma, la sintesi delle

3 subunità beta, tutte con i siti attivi, è inclusa. Queste vengono

chiamate immunosubunità, LMP2 MECL1 e LMP7, sono

incorporate nel complesso di nuova sintesi del core del 20S e formano, assieme ad altre subunità, il nuovo

immunoproteasoma.

Si ritiene che le proteine cellulari degradate come parte del normale turnover proteico dipendente dal proteasoma

siano la principale fonte di peptidi antigenici. Poiché la maggior parte delle proteine cellulari sono presenti in

piccole quantità, sono metabolicamente stabili e/o compartimentate, questo solleva la questione di come il

proteasoma possa prendere in carico tali proteine. A questo riguardo è stato osservato che una grande percentuale

di proteine di nuova sintesi sono prodotti difettosi della traduzione e sono rapidamente ubiquitinate e degradate

dai proteasomi. Queste possono quindi essere una fonte importante per la generazione dei peptidi antigenici.

67

Una questione dibattuta circa la generazione dei peptidi e la loro presentazione a livello delle MHC I riguarda

l'efficienza del macchinario che produce antigeni: in altre parole, quante molecole proteiche devono essere

elaborate dal proteasoma per produrre un complesso stabile MHC I-peptide? Esperimenti in vitro sembrano

indicare che non più di una molecola degradata su 10 produce peptidi antigenici , suggerendo che il proteasoma

sia meno efficiente di quanto ipotizzato. È stato inoltre valutato che devono essere degradate tra 994 e 3122

molecole proteiche per la formazione di un unico complesso stabile con l’MHC I alla superficie cellulare, quindi

con una efficienza media di 1 su 2000.

INF-gamma induce dei cambiamenti al complesso del proteasoma, basato sulla struttura del proteasoma di lievito.

a) il proteasoma 20S house-keeping è rappresentato come una struttura cilindrica di 4 anelli delle 7 subunità alfa

del proteasoma e da 7 subunità beta del proteasoma; può

formare un complesso con 2 ATPasi. b) negli umani, INF-

gamma induce l’espressione dell’immunoproteasoma. Il

proteasoma 20S house-keeping contiene 3 subunità beta

catalitiche X, Y e Z, mentre l’immunoproteasoma contiene

la subunità IFN-gamma inducibile LMP2. IFN-gamma

induce anche l’espressione dei protesomi regolatori PA28,

il quale forma un eteromultimero composto da PA28alfa e

PA28beta. c) Il proteasoma 20S house-keeping e

l’immunoproteasoma sono asssociati entrambi con il

complesso dell’ATPasi o PA28 o con entrambi.

La citochina immunomodulatoria IFN-g, che è prodotta dai

linfociti T helper 1 attivati, da CD8+, da CTL e da cellule

natural killer (NK), stimola la presentazione dell'antigene

upregolando l’MHC I e le subunità specifiche per l’immunoproteasoma. L’IFN-g altera infatti qualitativamente

l'attività del proteasoma causando l’incorporazione di tre immunosubunità: LMP2 (ib1), LMP7 (ib5) e MECL-1

(ib2) sostituendo le rispettivesubunità costitutive b1, b5 e b2 nel proteasoma 20 S. Esistono quindi due tipi di

proteasomi, quelli costitutivi e gli immunoproteasomi, che si esprimono sotto l'influenza di citochine come l’IFN-

g. Studi in vitro hanno dimostrato che gli immunoproteasomi sono più efficienti nella generazione di diversi

peptidi antigenici virali che non i proteasomi costitutivi. In particolare, è stato dimostrato che topi knock-out per

le subunità LMP2 e LMP7 possiedono un repertorio di CTL alterati, e ciò influenza la specificità della risposta

immunitaria. Questo mette in evidenza l'importanza di LMP2 e LMP7 per la risposta immunitaria cellulare.

Degradazione proteasomale

indipendente da ubiquitina

Esistono casi documentati di proteine degradate dal proteasoma secondo modalità che non prevedono l'intervento

dell’ubiquitina. Ciò può realizzarsi sia ad opera del proteasoma 26S, sia ad opera del proteasoma 20S, cioè il

complesso proteolitico privo dei complessi regolativi 19S. Esistono infatti chiare evidenze che una frazione

significativa del proteasoma è presente in cellula sottoforma del complesso 20S.

• Nei casi in cui la degradazione indipendente da ubiquitina avviene ad opera del proteasoma 26S, si devono

ipotizzare dei segnali intrinseci nelle proteine substrato (= sequenze specifiche) che vengono riconosciuti da parte

del complesso regolativo 19S. Questo è il caso già nominato dell'ornitina decarbossilasi, ma ce ne sono diversi

altri. Ad esempio, lo stesso oncosoppressore p53 viene degradato attraverso una via dipendente da ubiquitina e

una indipendente.

• Esistono poi proteine che sono degradate dal proteasoma 20S (quindi il solo complesso proteolitico). È evidente

che in questo caso la degradazione è indipendente da ATP. Deve quindi trattarsi necessariamente di proteine in

68

conformazione estesa. Esistono evidenze che proteine destinate a questa via degradativa siano quelle naturalmente

prive di struttura globulare (IDP). Altre proteine che seguono questa via sono quelle che hanno subito un danno

ossidativo (che tratteremo più oltre), quelle che non si ripiegano correttamente a causa di mutazioni, come pure

quelle che sono andate incontro a misfolding per ragioni di diversa natura.

• Non è chiaro quale sia il segnale che destina le proteine alla degradazione operata dal proteasoma 20S. Sembra

che una aumentata idrofobicità di superficie (che la stessa ossidazione delle proteine può provocare) possa essere

un segnale di riconoscimento. Probabilmente esistono però anche altri meccanismi, basati ad esempio sulla

interazione con ulteriori fattori proteici accessori che legano la proteina substrato e la destinano al proteasoma.

• È infine opportuno menzionare che in base a talune evidenze, sembra che alcune proteine vengano ubiquitinate e

destinate alla degradazione a seguito della loro denaturazione. In questo caso il segnale della ubiquitinazione sono

sequenze interne esposte a seguito della denaturazione.

1 - Degradazione di proteine modificate ossidativamente (da

ROS = specie reattive dell’ossigeno)

Si tratta di fenomeni complessi e che interessano molti degli amminoacidi componenti le proteine. Sono

interessati in particolare triptofano, tirosina, istidina e cisteina e metionina (la cisteina va incontro a ossidazione

del gruppo –SH, che diventa –SO3. Lo zolfo della metionina può addizionare un ossigeno, diventando metionina

sulfone. Il processo ossidativo può anche portare alla frammentazione delle proteine. La tirosina può dimerizzare

producendo il bifenile, una struttura in cui due anelli aromatici di due tirosine si legano covalentemente. Di

conseguenza le proteine possono produrre oligomeri (dimeri, trimeri, tetrameri, ecc.) che, dato il meccanismo di

formazione, sono strutture ramificate. Anche altre reazioni causate dai ROS portano alla formazione di “cross-

links”.

2 - Degradazione di proteine modificate ossidativamente

Una ossidazione blanda delle proteine porta alla loro denaturazione con conseguente esposizione del nocciolo

idrofobico. Proteine in queste condizioni sembra siano degradate dal proteasoma 20 S (senza consumo di ATP),

come è il caso più generale delle proteine denaturate anche per altre ragioni. Di conseguenza la degradazione delle

proteine ossidate sembrerebbe essere un caso particolare della strategia più generale di rimozione delle proteine

denaturate.

Nel caso di ossidazione estensiva, le proteine non possono essere più prese in carico dal proteasoma,

probabilmente per il fatto che formano grossi aggregati in cui le singole catene sono unite l'un l'altra attraverso

cross links generando strutture ramificate. In questo caso sono accumulate a livello dell'aggresoma, un centro di

raccolta di aggregati proteici che si trova presso l’MTOC (microtubule organizing center). Esiste infatti un sistema

che raccoglie le proteine aggregate nell’aggresoma,trasportandole lungo i microtubuli. Le proteine raccolte

nell’aggresoma sono poi inglobate dal lisosoma mediante autofagia e proteolizzate. Un’altra condizione in cui le

proteine vengono convogliate all’aggresoma è quando il sistema del proteasoma è sovraccarico (ad es. a causa di

stress termico) e non è più in grado di smaltire interamente le proteine destinate alla degradazione.

69

Il proteasoma come bersaglio per la

terapia tumorale

Il proteasoma 26S degrada parecchie oncoproteine, fattori di trascrizione, cicline e inibitori delle chinasi ciclina-

dipendenti, e altre importanti proteine regolatorie. L’alterata regolazione degli eventi cellulari legati a queste

proteine può portare allo sviluppo del cancro. Pertanto il proteasoma è diventato un bersaglio interessante per il

trattamento di numerosi tumori. Diversi inibitori del proteasoma che hanno come target le attività proteolitiche del

proteasoma 26S sono stati sviluppati e testati per la loro attività anti-tumorale. Questi inibitori del proteasoma

hanno dimostrato notevoli effetti anti-tumorali inducendo apoptosi in diversi tipi di tumore. Inoltre si sono

dimostrati capaci di indurre l’arresto del ciclo cellulare, di inibire l'angiogenesi, l'adesione cellulare, la migrazione

cellulare, le risposte infiammatorie, e la risposta di riparazione del DNA. Un certo numero di inibitori del

proteasoma sono ora in sperimentazione clinica per il trattamento del mieloma multiplo e di tumori solidi. Il

bortezomib è un inibitore del proteasoma già utilizzato in clinica per il trattamento del mieloma multiplo e per

certi tipi di linfoma.

Chaperoni-proteasi Clp batterici (ma

non solo batterici)

- Nei batteri non esiste proteasoma; bensì la funzione di questo è quasi interamente sostenuta dai membri della

famiglia delle proteasi Clp (ClpAP, ClpCP, ClpEP, ClpXP, HslUV). Tutti i complessi Clp hanno un'architettura ad

anelli sovrapposti e consistono di due elementi funzionali: un nucleo proteolitico cilindrico e anelli ad attività

chaperonica e ATPasica (Fig. 1). Il chaperone è responsabile del riconoscimento del substrato, srotolamento e

introduzione della catena polipeptidica estesa attraverso uno stretto poro nel compartimento proteasico, in cui i siti

attivi proteolitici sono segregati dalla soluzione esterna. 70

Come assetto generale assomiglia molto ad un proteasoma.

Tutti i chaperoni oligomerizzano in esameri toroidali con un poro centrale e sono membri della grande famiglia

AAA di ATPasi (ATPases Associated with various cellular Activities).

- Il cilindro proteolitico possiede diversi siti attivi con serine o treonine catalitiche, che consentono l'idrolisi delle

proteine in peptidi di 5-10 aminoacidi. L’esatto meccanismo che porta ad una tale distribuzione delle dimensione

dei peptidi uscenti non è ancora chiara. In ogni caso, come per il proteasoma, si tratta di una degradazione

processiva.

- L'architettura a due componenti proteasi-chaperone di Clp e l'esistenza di due diversi tipi di complessi

proteolitici (ClpP e ClpQ) e di molteplici chaperoni, si traduce in un ampio repertorio di complessi proteasi-

chaperone. ClpP può interagire con diversi chaperoni, vale a dire ClpA, ClpC, ClpE, e ClpX, formando i

rispettivi complessi. Al contrario, ClpQ interagisce esclusivamente con il chaperone ClpY formando ClpYQ (noto

anche come HslUV) (Fig. 1). Tra i chaperoni- ATPasi esistono due classi distinte: la classe I contiene due moduli

AAA consecutivi per protomero (ad esempio ClpA, ClpC e ClpE) e la classe II contiene un solo tipo di modulo

AAA (come nel caso di ClpX e ClpY). I moduli AAA sono dominii di legame dell’ATP. Quasi tutti i batteri

contengono il ClpXP. Questo rende ClpXP la più diffusa tra le proteasi Clp (Tabella 1). ClpA e ClpC sono

ortologhi e solitamente i batteri ospitano o l’uno o l'altro. Tutti i chaperoni Clp formano strutture ad anello

omoesameriche, che delimitano un poro centrale attraverso cui le molecole di substrato vengono traslocate per

arrivare ai siti proteolitici (Fig. 1). Tuttavia il complesso proteolitico ClpP ha una struttura eptamerica! (ma non il

ClpQ, che è esso stesso esamerico). Solo 3-4 molecole di ATP si legano ai chaperoni esamerici.

- Il riconoscimento di molti substrati proteici sembra piuttosto non specifico, e ciò è giudicato importante in

vista della degradazione delle proteine parzialmente o totalmente denaturate che si possono formare in

condizioni di stress.

- Tuttavia, come logico, esistono anche altri segnali di riconoscimento delle proteine bersaglio, che si basano su

caratteristiche intrinseche delle proteine stesse. Il più noto di questi è l’N-degrone, che viene tipicamente destinato

al complesso ClpAP.

- Dopo che il substrato è stato assunto dal chaperone, deve essere srotolato per passare attraverso lo stretto canale

di entrata della proteasi. Ci sono tre elementi strutturali fondamentali presenti in tutti le proteasi Clp, che

71

permettonoquesto processo: uno stretto foro di entrata che impedisce il passaggio di proteine strutturate; un lungo

canale centrale e dei loop posizionati lungo questo canale, la cui conformazione viene modificata dalla idrolisi di

ATP; essi entrano in contatto con la catena del substrato.

- Un altro membro procariotico di delle Clp di classe I è ClpB, che ha una attività disaggregasica, cioè scompone

gli aggregati nelle singole molecole proteiche e le destina al refolding con il concorso del sistema dell’Hsp70, ma

non si associa ai sistemi proteolitici ClpP o ClpQ.

- In lievito esiste un omologo eucariotico di ClpB, denominato Hsp104, con ruolo disaggregasico. Inoltre esso è

coinvolto nel conferimento di una conformazione prionica a certe proteine, ma anche nella prevenzione della loro

aggregazione. 72

Traffico delle proteine

Una tipica cellula di mammifero contiene sulle 10 mila proteine di diversi tipi; una cellula di lievito

sulle 5 mila. La maggior parte sono sintetizzate nel citosol, da ribosomi, e rimangono nel citosol.

Tuttavia molte di loro vengono trasportate a livello della membrana, oppure in compartimenti

cellulari, come nel caso di molti recettori ormonali che sono trasportati verso la superficie di

membrana

Si può parlare quindi di protein targeting (indirizzamento delle proteine a) o di protein sorting

(smistamento delle proteine). L’indirizzamento è basato su segnali presente a livello delle

proteine.

I ribosomi sintetizzano i peptidi nascenti nella via secretoria e sono indirizzati attraverso il reticolo

endoplasmatico da una sequenza segnale (fase 1 e 2). Dopo che la traduzione è completata nel RE,

queste proteine possono essere trasportate al complesso di Golgi, mediante trasporto vescicolare

(fase 3). Inoltre il sorting indirizza le proteine sia alla membrana plasmatica che verso i lisosomi

a

(fase 4 e 4b). A destra (via no-secretoria): sintesi delle proteine che non presentano sequenza

segnale e la loro sintesi è completata nei ribosomi (fase 1). Queste proteine, che non contengono

sequenza segnale, sono rilasciate nel citosol e rimangono lì (fase 2). Proteine che presentano una

sequenza specifica per un organello sono prima rilasciate nel citosol (fase 2), ma successivamente

sono importate nei mitocondri, cloroplasti, perossisomi o nel nucleo (fase 3-6). Proteine

mitocondriale e cloroplastiche, tipicamente, passano attraverso la membrana esterna e la membrana

interna per entrare nella matrice o nello spazio stromale. Altre proteine sono indirizzate verso altri

sottocompartimenti di questi organelli. 73

Il traffico vescicolare ha a che fare con una parte

solamente del processo di smistamento che è

collegato con la via secretoria. Le destinazioni diverse

dal citosol sono: mitocondri, cloroplasti, perossisomi,

nucleo, via secretoria. La via secretoria è costituito

dal RE dal quale si generano le cisterne che

compongono l’apparato di Golgi (cis, quelle più

vicino al RE; medial e trans, che sono funzionalmente

distinti). Dal Golgi le proteine possono andare o ai

lisosomi oppure alla plasmamembrana. Inoltre le

proteine possono anche essere secrete. Le proteine

della via secretoria non sono necessariamente proteine

secrete, ma si definiscono le proteine della via

secretoria tutte quelle che si localizzano all’interno di

uno qualsiasi dei compartimenti che compongono la

via secretoria (RE, lisosomi, plasma membrana,

apparato di Golgi).

Sequenze segnale della via secretoria

Ci sono delle sequenze segnale che permettono di indirizzare le varie proteine, che rappresentano

condizione necessaria e sufficiente affinché la proteina arrivi alla sua destinazione finale. Per

conoscere se una sequenza è condizione necessaria e sufficiente, si può produrre una variante della

proteina senza sequenza segnale e si vede che la proteina non procede più verso il corretto

indirizzamento. Per verificare se la sequenza è sufficiente si prende quella sequenza e la si aggiunge

nella sequenza di un’altra proteina e si vede se questa viene indirizzata verso la destinazione

predisposta.

Le sequenze segnale si trovano molto spesso all’N-terminale, ma possono trovarsi anche in altre

collocazioni. Queste sequenze devono essere diverse l’una dall’altra per destinare ai diversi

comparti. Molto spesso sono costituiti da aa idrofobici, e qualche volta anche da aa aromatici,

quindi sono sequenze fortemente idrofobiche, anche se vi è una grossa variabilità. La lunghezza

della sequenza può esser molto variabile. È sufficiente che sia una sequenza abbastanza lunga e a

larga prevalenza idrofobica. Queste sequenze si accomodano in un sito di riconoscimento di un

recettore specifico. Se una sequenza segnale è condizione necessaria e sufficiente affinché una

proteina venga destinata ad un certo comparto, implica la necessità dell’esistenza di un recettore che

riconosca la sequenza segnale. Per ognuna delle diverse destinazioni vi è un recettore specifico.

Il traslocone e la traslocazione post-traduzionale

1. Qual è la natura delle sequenze segnale, e quali sono le differenze tra una sequenza segnale

e l’altra?

2. Qual è il recettore per le sequenze segnale?

3. Qual è il canale di traslocazione che permette il trasferimento delle proteine attraverso il

doppio strato? In particolare, il canale è abbastanza stretto in modo tale che le proteine

passi solo in uno stato piego oppure accomoda domini folded?

74

Qual è la sorgente energetica che guida il trasferimento attraverso la membrana?

Le proteine sono traslocate co-traduzionalmente, ossia mentre vengono sintetizzate vengono

traslocate all’interno del lume del reticolo. Nei mitocondri, cloroplasti, perossisomi e nucleo, ciò

non accade, vengono prima sintetizzate e successivamente traslocate.

I ribosomi, se sintetizzano proteine destinate al lume del reticolo, sono adesi ad esso e la proteina

viene traslocata al lume, attraverso una struttura che viene definita come traslocone.

Come si fa a sapere che la traslocazione, all’interno del reticolo endoplasmatico, è co-

traduzionale?

In esperimenti condotti su cellule, andando a formare degli omogenati, si è visto, che il RE una

volta sottoposto ad omogenizzazione, tendeva a riassemblarsi, in piccoli frammenti chiamati

microsomi. Si prende l’omogenato e lo si tratta con un detergente, che è in grado di sciogliere la

membrana. Si aggiunge una proteasi e si vede che la proteina secretoria si spezzetta, mediante

elettroforesi. Se non si aggiunge il detergente ma solo la proteasi non si vede nulla. Ciò sta ad

indicare che la proteina passa direttamente da ribosoma al lume del reticolo endoplasmatico, infatti

se non sciolgo il microsoma, la proteasi non riesce a raggiungere la proteina. I microsomi

presentano la stessa orientazione del RE

Si può fare la sintesi proteica cell free in cui non sono presenti i microsomi all’inizio. Quindi si ha

la sintesi di una proteina con la sequenza segnale per il reticolo endoplasmatico, vengono poi

aggiunti i microsomi, ma non succede nulla (nel senso che nei microsomi non si vede che vi è la

proteina). Nell’altro esperimento si hanno già i microsomi, vi è la sintesi della proteina e nei

microsomi, dopo la centrifuga, si ritrova la proteina. Questo dimostra che la traslocazione è co-

traduzionale.

Questo esperimento mostra che i microsomi devono

essere aggiunti prima che i primi 70 aa siano legati

insieme in modo da completare le proteine secretoria

ed essere localizzate nel lume del microsoma. In

questo modo, i primi 40 aa sono protrusi dal ribosoma,

includendo anche il la sequenza segnale che dopo sarà

spaccato, e i seguenti 30 aa sono ancora sepolti

all’interno del canale dl ribosoma.

Il trasporto di molte proteine secretorie attraverso il

lume del RE avviene mentre il peptide nascente è

ancora legato al ribosoma e si sta allungando, questo

processo prende il nome di traslocazione co-

traduzionale. 75

Una volta che la sequenza segnale emerge dal ribosoma, esso è legato da una particella di

riconoscimento del segnale SRP. L’SRP si lega la catena del polipeptide nascente, ancora legato al

ribosoma. Questa interazione è molto forte ed è garantita dal legame del GTP sia con SRP che con il

suo recettore. Il peptide nascente dal ribosoma viene indirizzato al traslocone che permette

l’apertura del suo canale di traslocazione permettendo la crescita del polipeptide, il quale è trasferito

da un sito di legame idrofobico al canale centrale. Sia SRP e il suo recettore, una volta disassociati

dal traslocone, il loro legame è garantito dall’idrolisi del GTP e sono pronti per iniziare l’inserzione

di una altro polipeptide. Quando il polipeptide si allunga, esso passa attraverso il traslocone per

finire nel lume del RE, dove la sequenza segnale è rimossa ed è rapidamente degradata. Il

polipeptide continua ad allungarsi fino a quando l’mRNA è tradotto attraverso il 3’. Siccome il

ribosoma è attaccato al traslocone, l’allungamento della cane è estrusa durante la traslocazione nel

lume del RE Proteina in via di sintesi, presenta un recettore SRP

(particella di riconoscimento segnale). Esso ha un solco

in cui si inserisce la sequenza. La SRP si associa anche al

ribosoma andando a formare un complesso ternario:

ribosoma, SRP e catena polipeptidica. SRP è solubile nel

citosol. SRP, ha a sua volta un recettore, fatta da due

subunità: proteina integrale di membrana e proteina

periferica. SRP e il suo recettore hanno attività

GTPasica, quindi quando legano GTP e lo idrolizzano, la

proteina viene trasferita nel canale centrale del

traslocone. L’idrolisi del GTP causa il distacco dell’SRP,

l’entrata della proteina nel canale centrale del traslocone.

La sequenza segnale che emerge a livello del lume del

RE viene tagliata da una peptidasi, che ha un dominio solubile. Quando termina la sintesi proteica,

la proteina si ripiega nel lume e il rilascio della proteina va perdere l’associazione tra il ribosoma e

il traslocone. L’eliminazione della sequenza segnale è essenziale perché potrebbe venir meno la

stabilità della proteina.

SRP riconosce la sequenza segnale e si associa al ribosoma e instaura la sintesi proteica per un

breve periodo di tempo, esse serve anche al ribosoma per arrivare al traslocone e blocca tutto per

tempi brevissimi. 76

SRP è costituito da una lunga

molecola di RNA che funge da

sistema di connessione per le

varie proteine. P54 lega la

sequenza segnale. l’RNA

presente, sembrerebbe derivare

da un ribosoma che si è staccato.

Vi è un monologo procariotico

che è altamente omologo alla P54

FFH. Esistono interazioni di

proteina ligando che sono di

elevatissima specificità.

Ribonucleoproteina. P54 lega la

sequenza segnale idrofobica. Il

soldo idrofobico è tappezzato da metionine e con bassa

specificità lega le sequenze segnale (basta che non

abbiano residui carichi e abbondino di residui

idrofobici). Questa struttura è batterica, ma è omologa a

quella eucariotica, basta il 40% di omologia. Si può

vedere anche il recettore per SRP. I due pattern legano

ciascuno una molecola di GTP, quando le due molecole

si legano l’uno all’altro, le due molecole si adattano

all’interfaccia, generando i due siti di legame per le due

molecole di GTP e al contempo attiva l’attività

GTPasica.

Il traslocone

Nel corso della sintesi di proteine destinate all’ER, la

catena in via di elongazione è trasferita al traslocone,

passando nel canale centrale che esso possiede, senza

essere mai esposta al citosol e restando sempre estesa (=

non ripiegata).

- E’ stato effettuato un esperimento di cross-linking su

un sistema acellulare (cell free) consistente di

microsomi, ribosomi e tutte le componenti necessarie

per la sintesi proteica. In tale sistema il mRNA

codificava una proteina di 70 aa senza stop codon, e

quindi incapace di essere rilasciata dal ribosoma. La

catena in via di elongazione restava così bloccata nel

canale.

- Nella sequenza di tale proteina era stata inserita una lisina modificata, capace di effettuare cross-

linking con proteine adiacenti se fotoattivata. 77

- A seguito di flash di luce la catena in via di elongazione realizzava cross-linking con la proteina

TRAM (TRanslocating chain-Associated Membrane protein) e con la proteina Sec61alfa. Sono state

così identificate due proteine del traslocone di mammifero. Si chiama Sec perché mutazioni a carico

di questa proteina portavano a modificazioni e difetti nella via secretoria.

- Sec61alfa è simile in sequenza alla proteina codificata dal gene sec61 di lievito. Mutanti di sec61

sono mutanti di classe A.

Proteine del traslocone di mammifero

- Il complesso Sec61alfa e la proteina TRAM sono necessari e sufficienti per la traslocazione (il

traslocone contiene 3-4 complessi Sec61).

Catena polipeptidica che non si stacca dal ribosoma e dove sono presenti delle lisine modificate che

sono foto-attivabili (con un flash di luce a lunghezza d’onda opportuna le lisine generano un legame

covalente, con le molecole). Il polipeptide rimane incastrato e si estende lungo lo spesso del

traslocone della membrana, si ha un flash di luce e si forma un legame covalente. Ciò ha consentito

di isolare la proteina in via di elongazione.

Il complesso SRP e sec61 sono necessarie per la traslocazione al reticolo.

Sec61 garantisce impermeabilità, a livello del traslocone, a tutto tranne che alla proteina che deve

passare. Ciò mette in evidenza l’esigenza fondamentale di

consentire il passaggio della proteina specifica e di impedire il

passaggio di molecole più piccole. Se gli ioni diffondessero

senza controllo potrebbe alterare la cellula.

Dati strutturali sulla proteina archibatterica SecY (omologa di

Sec61) dimostrano molti elementi importanti in relazione al

meccanismo di funzionamento del traslocone.

1) Le eliche transmembrana racchiudono un canale centrale

conformazione a clessidra (hourglass). La strettoia (gasket) è

determinata da un certo numero di isoleucine;

2) Quando le catene polipeptidiche non stanno transitando, la

strettoia è occlusa da un “otturatore” (plug), consistente di una

breve alfa elica. Tale dispositivo è della massima importanza

perché impedisce il transito di molecole anche piccole da ER a

citosol e viceversa;

3) La struttura evidenzia infine che tratti idrofobici transmembrana delle molecole in transito

possono spostarsi lateralmente, uscendo dal traslocone e inserendosi nella membrana medesima,

grazie alla separazione reversibile di due eliche del SecY.

78

Ci sono delle proteine destinate alla via secretoria che sono trasferite post-traduzionalmente.

Perché una proteina destina alla via secretoria, potrebbe essere trasferita post-traduzionalmente?

Perché è troppo corta. SRP entra in contatto con la proteina quando la sintesi della proteina ha

totalizzato 70aa, e quindi se una proteina è più corta si distacca prima che possa avvenire il contatto.

È il caso dell’alfa-melting factor, che è un ormone secreto.

Si ammette che vi sia un meccanismo di tipo “ratchet”

(ruota dentata può girare in una sola direzione). Il dente

d’arresto impedisce il movimento a ritroso della ruota

dentata. Ciò simbolizza il meccanismo unidirezionale di

traslocazione post-traduzionale nel reticolo endoplasmico,

per la destinazione alla via secretoria. Le catene polipeptidiche

restano estese, entrano nel

traslocone e in assenza di

ulteriori ausili, fanno avanti e

indietro, perché non hanno

una direzione referenziale. Vi

è un chaperone BIP (omologo

a HASP70) che viene attivato

dal complesso di membrana

Sec63, che porta all’idrolisi di

ATP e lega la proteina e

impedisce la

retrotraslocazione. La

proteina cercherà di andare

ancora avanti e indietro, ma

vi saranno dei vincoli dati da

BIP impedendo la

retrotraslocazione. Tale

traslocazione non potrà mai avvenire senza spesa di energia, in quanto la diffusione contro gradiente

non potrà mai essere spontanea termodinamicamente. Affinché il ciclo si richiuda l’ADP deve

essere scambiato con ATP quando la proteina viene rilasciata.

79

Inserzione delle proteine di membrane nelle membrane della

via secretoria

Diverse modalità inserzione di proteine in membrana via secretoria:

 I tratti transmembrana negli eucarioti sono solo alfa-elica, a differenza dei procarioti che

presentano anche foglietti-beta o barili-beta.

 vi sono tutta una serie di modalità di inserzione, distinte in base alla topologia, che indica

soprattutto da quale lato si localizza N-t e il C-t.

 molte hanno un tratto transmembrana e altre solo uno.

Le proteine di tipo I hanno un taglio all'N-terminale e sono ancorate sulla membrana con la loro

regione N-terminale idrofilica sulla faccia luminare (nota anche come faccia esoplasmica) e la loro

regione C-terminale idrofilica sulla faccia citosolica.

Le proteine di tipo II non contengono una sequenza segnale ER tagliata e sono orientati con la

loro regione N- terminale idrofilica sulla faccia citosolica e la loro regione C-terminale idrofilica

sulla faccia exoplasmica (cioè, opposto alle proteine di tipo I).

Le proteine di tipo III presentano un segmento idrofobico a membrana al loro N-terminale e

quindi hanno lo stesso orientamento come le proteine di tipo I, ma non contengono una sequenza

segnale tagliata.

Infine, le proteine ancorate a coda hanno un segmento idrofobico al loro C-terminale che

attraversa la membrana. Queste diverse topologie riflettono meccanismi distinti utilizzati dalla

cellula per stabilire l'orientamento dei segmenti transmembrana, come vedremo a breve.

Le proteine che formano la classe topologica IV contengono due o più segmenti di membrana e

sono a volte chiamate proteine a membrana multipasso. Ad esempio, molti delle proteine di

trasporto delle membrane discusse nel capitolo 11 e i numerosi recettori accoppiati a G-proteine

discusse nel capitolo 15 appartengono a questa classe.

Alcune proteine a membrana ancorate a lipidi sono anche sintetizzate sul ER. Queste proteine di

membrana non dispongono di un segmento di membrana idrofobico;

Sono legati ad un ancoraggio fosfolipidico anfipatico che è incorporato nella membrana (Figura 13-

10, a destra). 80

Citocromo p450 si localizza nella membrana del RE con il dominio funzionale a livello citosolico.

Trasportatori e canali presentano più alfa-eliche per mettere il trasporto.

Ci sono due tipi di sequenze all’interno delle proteine di membrana: stop-transfer anchor

sequence e anchor sequence. Queste sequenze sono idrofobiche e hanno uno spessore

corrispondete allo spesso della membrana 3,3 nm. Sono lunghe circa 22 aa. Entrambe le sequenze si

inseriscono all’interno della membrana. Nel tipo I stop-transfer anchor sequence si ancorano alla

membrana, fermano il trasferimento ma fermano il trasferimento in quanto non si legano con l’SRP.

Tipo I

Una proteina di tipo I

come sopra descritta:

all'inizio si comporta

come una proteina

solubile inviata al

lume. C'è poi il segnale

e avviene la

elongazione. Le prime

fasi del processo non si distinguono a differenza delle proteine solubili. Le interazioni che la

sequenza ionstaura con il traslocone sono forti e il traslocone si apre (2 fascetti si divaricano) e la

sequenza si immerge nello spessore della membrana, a questo punto il ribosoma si distacca perchè

la catena polipeptidica si stacca dal traslocone. Al C-t c'è una piccola coda che non ha nessun ruolo

funzionale. Al passaggio 4 il tipo I si muove dallo strato fosfolipidico. Si capisce perchè si parla di

sequenze di ancoraggio (SPA).

L'esperimento ovvio è stato quelli di inserire all'interno delle sequenze aa carichi e questo fa si che

la proteina venga secreta e non rimane a livello.

Nello specifico: Oltre a una sequenza di segnali N-terminale che li indirizza alla ER, tutte le

proteine transmembrana di tipo I possiedono una sequenza idrofobica interna di circa 22 aminoacidi

che diventa la membrana-spanning a elica. La sequenza di segnali N-terminale di una proteina di

tipo I nascente, come quella di una proteina secreta solubile, inizia la traslocazione co-

translazionale della proteina attraverso l'azione combinata del recettore SRP e SRP. Una volta che

81

l'N-terminale del polipeptide crescente entra nel lume della ER, la sequenza segnale è tagliata e la

catena crescente del polipeptide continua ad essere estrusa attraverso la membrana ER. Però,

quando la sequenza diventerà un dominio transmembrana entra nel translocone, arresta il

trasferimento della proteina attraverso il canale consentendo al segmento transmembrana di

spostarsi lateralmente dal canale nella membrana

(Figura 13-11). Il meccanismo che consente il movimento laterale è lo stesso per l'apertura del

translocone che accettare una sequenza segnale: due fasci di cinque-elica di Sec61α cerniera aperta

per consentire al segmento di transmembrana idrofobico di spostarsi lateralmente oltre la sequenza

segnale idrofobica con sito di legame attraverso il bordo aperto del translocone (vedi Figura 13-8).

Quando il peptide esce dal translocone in questo modo, l'idrofobicità del segmento transmembrana

lo ancorano nell'interno idrofobico della membrana. Poiché tale sequenza funziona sia per impedire

il passaggio della catena del polipeptide attraverso il translocone e diventare un duplice segmento di

transmembrana idrofobica nella membrana, viene chiamata sequenza di ancoraggio di arresto.

Una volta interrotta la translocazione, la traduzione continua sul ribosoma, ancora ancorato al

traslocone non occupato e chiuso. Dalla catena proteica che viene sintetizzata, C-terminale si estrae

sul lato citosolico della membrana. Quando la traduzione è completa, il ribosoma cvene rilasciato

dal translocone, e il C-terminus della proteina di tipo I appena sintetizzata rimane nel citosol. Il

sostegno di questo meccanismo è derivato da studi in cui CDNA che codifica vari recettori mutanti

per la crescita umana Ormone (HGH) sono stati espressi in cellule di mammiferi coltivate. Il

recettore HGH di tipo selvatico, una tipica proteina di tipo I, viene trasportato normalmente alla

membrana plasmatica. Tuttavia, un recettore mutante che ha caricato residui inseriti nel singolo

segmento di membrana, o che manca la maggior parte di questo segmento complessivo, viene

traslocato interamente nel lume ER e viene eventualmente secreto dalla cellula come una proteina

solubile.

Questi tipi di esperimenti hanno dimostrato che il segmento idrofobico di membrana del recettore

HGH, e di altre proteine di tipo I, funziona sia come sequenza di stop-transfer, sia come ancoraggio

a membrana che impedisce il C-terminale delle proteine ancorate alla membrana ER.

Tipo II

Ci sono differenze importanti.

Una seq di tipo II non ha all'N-t

nessuna seq segnale. L'N-t è

indistinguibile da quello di una

proteina solubile. La seq segnale

compare a un certo livello lungo

la seq complessiva (all'interno).

La proteina viene sintetizzata nel

citosol, la seq segnale viene presa in carico da SRP, e poi dal traslocone e recettore. IL traslocone

che riceve la seq segnale (chè è di ancoraggio), la sequenza viene trasferita nello spessore della

membrana continua la sintesi della proteina nel traslocone e quindi il C-t terminale va a finire dal

lato luminale. 82

Tipo III

l'inserzione avviene in un modo simile. Si pensa che dal lato citosolico ci sia un cluster ricco di

lisina e arginina. Se si mettono questi a valle della sequenza idrofobica l'N-t va a finire dal lato

citosolico. E' simile al tipo 2 tranne che il segmento trasmembrana sia orientato con la porzione N-t

verso il citosol.

Signal anchor sequence sono riconosciute dall'SRP.

Nello specifico:Proteine di tipo II e di tipo III A differenza delle proteine di tipo I, tipo II e le

proteine di tipo III non dispongono di unan sequenza segnale N-terminale ER staccabile. Invece,

entrambi dispongono di una sequenza di ancoraggio di segnali idrofobobica che funziona sia come

sequenza segnale ER e un'ancora di membrana. Ricordiamo che tipo II e le proteine di tipo III

hanno orientamenti opposti nella membrana (Vedere la Figura 13-10); Questa differenza dipende

dall'orientamento che le rispettive sequenze di ancoraggio di segnale assumano all'interno del

translocone. La sequenza di ancoraggio del segnale interno delle proteine di tipo II dirige

l'inserimento della catena polipeptidica nascente nella membrana ER in modo che il N-terminale

della catena affronta il citosol, utilizzando lo stesso meccanismo dipendente dalla SRP descritto per

le sequenze di segnali (Figura 13-12a). Comunque, la sequenza di ancoraggio del segnale interno

non è cava e alla fine si muove lateralmente dal sito di legame di sequenza di segnali al bordo del

translocone direttamente nel bilayer fosfolipidico, dove funge da ancoraggio alla membrana. Il

continuo allungamento, la regione C-terminale della catena crescente viene estrusa attraverso il

translocone nel lume ER da traslocazione cotranslazionale.

Nel caso di proteine di tipo III, la sequenza segnale di ancoraggio, che si trova vicino al N-

terminale, dirige l'inserimento della catena nascente nella membrana ER con

Il suo N-terminale rivolto verso il lume, in un orientamento opposto a quella del segnale-ancoraggio

nelle proteine di tipo II. Il segnalatore della sequenza di proteine di tipo III funziona anche come

sequenza di arresto e impedisce ulteriormente l'estrusione della catena allungata nel lume ER

(Figura 13-12b). Continua l'allungamento del C-terminale della catena all'ancora di segnale la

sequenza procede come avviene per le proteine di tipo I, con la sequenza idrofobica che si muove

lateralmente fuori dal traslocone per ancorare il polipeptide nella membrana ER (Vedere la Figura

13-11).

La differenza fondamentale tra le proteine di tipo II e tipo III è l'orientamento del segmento di

transmembrana idrofobica in quanto si lega alla legatura idrofobica del sito segnale-sequenza ai

margini di Sec61α. La caratteristica più importante delle sequenze di ancoraggio di segnali che

determinano il loro orientamento ad un alta densità di amminoacidi positivamente caricati adiacenti

ad una estremità del segmento idrofobico. Questi positivamente residui caricati tendono a rimanere

sul lato citosolico della membrana, piuttosto che attraversare la membrana nella ER

lumen. Così la posizione dei residui carichi detta orientamento della sequenza di ancoraggio del

segnale all'interno del translocone. così come se il resto della catena del polipeptide continua a

passare nel lume ER: le proteine di tipo II tendono

Per avere residui positivi sul lato N terminale della loro sequenza di segnali-ancoraggio, orientando

il N-terminale nel citosolo e consentendo il passaggio del lato C-terminale del ER (vedere la Figura

13-12a), mentre le proteine di tipo III tendono ad avere residui positivi di carica sul lato terminale C

83

sulla loro sequenza di segnali-ancoraggio, che limitano il C-terminale al citosol (vedi Figura 13-

12b). Si noti che il segmento idrofobo di una sequenza di segnale di tipo II presuppone lo stesso

orientamento in Sec61α come la sequenza di segnale di una proteina secreta

Proteine, e che in molti aspetti le sequenze segnale-ancoraggio si comportano esattamente come

sequenze di segnali, anche se non sono ceduti.

Una dimostrazione sperimentale impressionante dell'importanza della carica affiancata nella

determinazione dell'orientamento nella membrana è fornita da neuraminidasi, una proteina di tipo II

nel rivestimento superficiale del virus dell'influenza. Tre residui di arginina sono situati appena N-

terminali alla sequenza di ancoraggio del segnale interno in neuraminidasi. Mutazione di questi tre

residui carichi positivamente a residui di glutammato con carica negativa provoca neuraminidasi per

acquisire l'orientamento inverso.

Proteine ancorate per la coda alla memebrana

Hanno semplicemente un dominio dal lato

citosolico si riconoscono tra loro e fondono le

membrane. Per i recettori serve anche qualcosa dal

lato citosolico perchè una volat eche riceve il

ligando innesca dei processi intracellulari. Proteine

come snert non hanno nulla a livello citosolico. La

sequenza è assolutamente al C-t e questo comporta

un piccolo problema: la coda idrofobica al C-t,

ovvero una seqiemza segnale che però non ha senso

il suo riconoscimento dall'SRP alla fine della

sintesi. esiste un recettore al C-t che riconosce la

proteina in via di sintesi, il recettor eè Jet3 che possiede un recettore a sua volta (dimero) Jet2

questo comporta spesa di ATP (non GTP). Con meccanismo simile al traslocone, la seq si sposta

latermalmente.

Nello specifico: Per tutte le classi topologiche di proteine che abbiamo considerato finora,

l'inserzione di membrana inizia quando l'SRP riconosce una sequenza topogenica idrofobica che

emerge dal ribosoma. Riconoscimento di proteine ancorate a coda, che hanno una singola sequenza

idrofobica topogenica al C-terminale, presenta un unico challenge perché diventa il C-terminale

idrofobico disponibile per il riconoscimento solo dopo che la traduzione è stata completata e la

proteina è stata liberata dal ribosoma.

Inserimento di proteine ancorate alla coda nella membrana ER non impiega un SRP, un recettore

SRP o un translocone, ma dipende invece da un percorso dedicato a questo scopo, come descritto

nella Figura 13-13. Questo percorso comporta un ER da un recettore integrale di membrana

dimerico noto come Get1 /Get2. La proteina ancorata a coda viene rilasciata da Get3, e la porzione

transmembrana di Get1 / Get2 partecipa all'inserimento dell'ancora di coda nella membrana ER.

Questo processo è meccanicamente simile al targeting di tipo II e le sequenze segnale di tipo III di

tipo III alle ER e dalla SRP e dal Recettore SRP. Una grande differenza tra i due processi di

targeting è che Get3 coppie targeting e trasferimento di tailanchored di proteine all'idrolisi di ATP,

mentre le coppie di SRP coppie di proteine che mirano all'idrolisi di GTP. Inoltre, il recettore SRP

reclutano il complesso SRP-ribosoma alla ER, e in una fase separata, il translocon inserisce

84

l'ancoraggio della sequenza segnale nella membrana, mentre Get1 / Get2 evidentemente esegue

entrambe le funzioni, reclutando Get3 alla membrana ER e catalizzando l'inserimento dell'ancora di

coda nel Bilayer a membrana.

Tipo IV

La Figura 13-14 sintetizza le modalità di sequenze topogeniche transmembrana a singolo passaggio

e multipass proteine. Nelle proteine multiassiali (tipo IV), ciascuna delle membrane-Gli alogeni a

catena agisce come una sequenza topogenica nella

Modi che abbiamo già discusso: può agire per dirigere la proteina alla ER, per ancorare la proteina

nella membrana ER, o per arrestare il trasferimento della proteina attraverso la membrana. Le

proteine MultiPass cadono in uno dei due tipi,

A seconda che il N-terminale si estenda nel citosolo o lo spazio esoplasmatico (ad esempio, il lume

dell'ER o la cellula esterna). Questa topologia a N terminale è di solito determinata dal segmento

idrofobo più vicino al N-terminale e alla carica delle sequenze che lo fiancheggia. Se una proteina

di tipo IV ha un numero pari di eliche a membrana transmembrana, il suo N-terminale e C-

terminale saranno orientati verso lo stesso lato della membrana (Figura 13-14d). Al contrario, se una

proteina di tipo IV ha un numero dispari di α eliche, le sue due estremità avranno opposto di

orientamenti (Figura 13-14e).

Proteine multipasso sono di tipo IV: di tipo A e tipo B

4A ha numero pari e N e C terminali sono dallo stesso lato

4B ha numero dispari e quindi N e C terminali sono da lati opposto

inserzione delle proteine multipassono sono diverse come il GLUT.

 A: numero pari N e C-t sono dallo stesso lato

 B: numero dispari. N e C-t sono ai lati opposti

Organizzazione delle sequenze topogeniche (quelle che vanno a finire all’interno della membrana)

vi è un alternarsi di sequenze

stop trasnfer anchor STA e

signal anchor SA.

A Phospholipid Anchor Tethers Some Cell-Surface Proteins to

the Membrane

Non due volte da una sequenza di aminoacidi idrofobici, ma da una molecola anfipatica

covalentemente attaccata, glicosilfosfatidilinositolo (GPI) (Figura 13-15a; Anche il Capitolo 7).

85

Queste proteine sono sintetizzate e inizialmente ancorate alla membrana ER esattamente come le

proteine transmembrana tipo I , con una sequenza segnale N-terminale scolpito e una sequenza di

ancoraggio interno di arresto dirigere il processo (vedere la Figura 13-11). Tuttavia, una breve

sequenza di aminoacidi nel dominio lume, adiacente al dominio della membrana, è riconosciuto da

una transamidasi situata all'interno della membrana ER. Questo enzima fissa simultaneamente lo

stop transfer originale sequenza di ancoraggio e trasferisce la porzione luminosa Della proteina ad

un ancoraggio GPI preformato nella membrana (Figura 13-15b). Perché cambiare un tipo di

ancoraggio a membrana per un altro?

Attacco dell'ancora GPI, che determina la

rimozione del dominio idrofilo rivolto dal

citosolo dalla proteina, possono avere diverse

conseguenze. Proteine con ancoraggi GPI, per

esempio, può diffondersi relativamente

rapidamente nel piano del bilayer di

fosfolipidi. Al contrario, molte proteine sono

ancorate da membrane-spanning α eliche sono

impediti, muovendosi lateralmente nella

membrana perché il loro citosolfacing i

segmenti interagiscono con il citoscheletro.

Inoltre, l'ancoraggio GPI mira alla proteina

allegata al dominio apicale della membrana plasmatica (invece del dominio basolaterale ) in alcune

cellule epiteliali polarizzate.

GPI sono proteine che si ancorano alla membrana. Hanno componenti oligosaccaridiche, acido

fosfatidico e inositolo. Queste proteine si ancorano alla membrana attraverso delle catene alifatiche

di acido fosfatidico (glicerolo con due gruppi alcolici esterificati, quello centrale e uno esterno, il

terzo esterno è esterificato con un fosfofato).

Molte proteine di cellule eucariotiche sono ancorate alle membrane mediante collegamento

covalente al glicosil-fosfatidilinositolo (GPI). Queste proteine non dispongono di un dominio

transmembrane, non hanno coda citoplasmatica e sono quindi localizzate esclusivamente sul lato

extracellulare della membrana plasmatica.

Le proteine ancorate GPI formano una famiglia diversificata di molecole che comprende enzimi

associati alla membrana, molecole di adesione, antigeni di attivazione, marcatori di

differenziazione, componenti del cappotto protozoo e altre glicoproteine varie. Nel rene sono state

identificate diverse proteine ancorate a GPI, tra cui uromodulina (glicoproteina Tamm-Horsfall),

anidrasi carbonica tipo IV, fosfatasi alcalina, Thy-1, BP-3, aminopeptidasi P e dipeptidilpeptidasi.

86

Le proteine ancorate GPI possono essere rilasciate dalle membrane con fosfolipasi specifiche e

possono essere recuperate dal pellet detergente-insolubile dopo il trattamento Triton X-114 delle

membrane. Tutte le proteine ancorate a GPI vengono inizialmente sintetizzate con un'ancora

transmembrana, ma dopo la traslocazione attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico,

l'ectodominio della proteina viene ceduto e collegato covalentemente ad un ancoraggio GPI

preformato mediante un enzima transamidase specifico.

Almeno una malattia umana, l'emoglobinuria notturna parossistica, è il risultato di un'adeguata

ancoraggio GPI ancoraggio alle proteine della membrana plasmatica. Anche se rimane oscuro

perché così tante proteine sono dotate di un'ancora GPI, la presenza di un'ancora GPI conferisce

alcune caratteristiche funzionali alle proteine:

(1) è un forte segnale apicalo di targeting nelle cellule epiteliali polarizzate; (2) Le proteine ancorate

GPI non si aggregano in pozzi rivestiti con clatrina ma invece sono concentrati in domini lipidici

specializzati nella membrana, incluse le cosiddette vescicole pinocitose lisce o caveoli; (3) Le

proteine ancorate GPI possono agire come antigeni di attivazione nel sistema immunitario; (4)

quando l'ancoraggio GPI è ceduta da PI-fosfolipasi C o PI-fosfolipasi D, possono essere generati

altri messaggeri per la trasduzione del segnale; (5) l'ancoraggio GPI può modulare la presentazione

di antigene mediante molecole complesse di complessi di istocompatibilità.

Tutte le proteine tipo I, II, III, IV hanno tratti brevi che si ancorano al citoscheletro e hanno una

lovcalizzazione a livello della membrana che è fissa! Non si spostano con grande dinamismo

rispetto al punto dove sono collocate. Le proteine legate a GPI non sporgono dal lato citosolico e

quindi non hanno alcun ancoraggio nper cui possono scorrere lateralmente alla membrana in quanto

non hanno una posizione fissata. Perché cambiare un tipo di ancoraggio a membrana per un altro?

l'attacco dell'ancora GPI, che porta alla rimozione del dominio idrofilo rivolto dal citosolo dalla

proteina, può avere diverse conseguenze. Proteine con ancoraggi GPI, per esempio, può diffondersi

nel piano del bilayer fosfolipidico della membrana. Al contrario, molte proteine ancorate a

Membrana-spanning? Le eliche sono immobilizzate nella membrana. Perché i loro segmenti rivolti

verso citosol interagiscono con il citoscheletro. Inoltre, l'ancoraggio GPI mira alla proteina allegata

al dominio apicale della membrana plasmatica in alcune cellule epiteliali polarizzate, come

discutiamo Capitolo 17. Alcune proteine della membrana sono legate al lato citosolico della

membrana plasmatica da altri tipi di ancoranti lipidici (Vedi Figura 5-15). Un esempio importante è

la proteina Ras, che svolge un ruolo chiave nelle vie intracellulari di segnalazione Discusso nel

Capitolo 14.

La topologia di una proteina di membrana può essere predetta in base alla sua sequenza. La

predizione di una proteina, come proteina di membrana, è tra i più facili.

Per predire la topologia di una

proteina di membrana viene

allestito il profilo di idropatia

della proteina. Si assegna ad

ogni aa una misura della sua

idrofobicità. La idrofobicità di

un aa è una proprietà chimico-

fisica che può essere

quantificata. Più questi valori

87

sono positivi più l’aa + idrofobico. Si creano delle finestre facendo la media dell’idropatia

includendo un certo numero di aa a valle e a monete dell’aa considerato. Questi profili sono stati

ottenuti facendo delle finestre di 20 aa, che corrisponde allo spessore della membrana. Facendo

questo lavoro su tutta la sequenza, si vedono dei tratti che sono nettamente al di sopra dello zero,

che è il valore neutro (al di sopra sono idrofobici e al di sotto idrofilici). Se si analizza una sequenza

che presenta al picco un valore di 2-3 sono quasi certo che esso sia un tratto transmembrana. Tutte

le sequenze che per un tratto sufficientemente lungo, abbiano una idrofobicità al di sopra di un

valore medio. Questo sistema si può usare quando si analizzano sequenze delle quali non si hanno

informazioni. Isolando una proteina si è in grado di dire se la proteina è transmembrana o meno.

Quando si sequenza il genoma, in quella fase non si sa nulla sulla proteina.

Si scioglie una molecola in una miscela dove vi è una fase polare e una idrofobica. Sulla fase

idrofobica possono essere idrocarburi, etanolo ecc. per quantificare la idrofobicità di un aa, si va a

vedere come si ripartisce tra la fase polare e la fase idrofobica.

Scale di idrofobicità degli amminoacidi

Il profilo di idrofobicità di una sequenza amminoacidica può essere un elemento importante per

prevederne la struttura. Tale profilo identifica all’interno della sequenza medesima le posizioni in

cui si trovano amminoacidi idrofobici e quelle in cui si trovano amminoacidi idrofilici. Tuttavia

l’idrofobicità non è una proprietà “tutto o nulla”, ma può essere invece quantificata per ciascun

amminoacido. Ciò può complicare la trattazione sperimentale dei metodi che tentano di predire la

struttura delle proteine in base a questo stesso parametro, ma fornisce alla fine metodi più affidabili.

Vediamo dunque come si può definire l’idrofobicità. Allo scopo immaginiamo di avere due fasi

immiscibili, una acquosa e una apolare. La fase apolare può essere ad esempio l’esano.

Immaginiamo inoltre di mescolare le due fasi dopo avere disciolto in una delle due un amminoacido

di nostro interesse, che denominiamo Xaa. Dopo avere rimescolato e quindi separato le due fasi,

l’amminoacido sarà ripartito tra le due a determinate concentrazioni, come raffigurato

schematicamente nella figura qui sotto, dove la fase acquosa è rappresentata in azzurrino, quella

apolare in giallo e le molecole di amminoacido in rosso. Si può ora definire come segue un

coefficiente di ripartizione KR:

L’idrofobicità è il DG di trasferimento (DGtr) dalla fase apolare all’acqua, cioè:

Di conseguenza, quanto più un amminoacido è apolare, tanto più positivo sarà il suo valore di

idrofobicità. Sulla base della definizione data, l’idrofobicità si misura in cal/mole (o kcal/mole). Il

simbolo con cui normalmente la si rappresenta è una H.

Questo approccio concettualmente semplice viene complicato dal fatto che non è ovvio quale debba

essere il solvente nella fase apolare (mentre è ovvio che il solvente della fase polare debba essere

l’acqua). Ne sono stati usati diversi per definire la scala di idrofobicità, in particolare esano, ottano,

ma anche etanolo. Poiché l’etanolo si mescola con l’acqua in qualsiasi proporzione, si calcola la KR

88

in base alla massima solubilità dell’amminoacido in ciascuna delle due fasi (il rapporto tra le

solubilità nei due mezzi equivale alla KR). Si hanno così diverse scale di idrofobicità, che peraltro

non differiscono in modo sostanziale l’una dall’altra.

Un’altra complicazione risiede nel fatto che gli amminoacidi come tali sono molto poco solubili

nelle soluzioni apolari, per cui queste misure si fanno su derivati in cui mancano le cariche positive

e negative dei gruppi alfa-amminico e carbossilico (ad esempio: Na-acetil-amminoacil-Ca-etil

estere). Una scala simile a quella dell’idrofobicità è quella dell’idropatia, sviluppata da Kyte e

Doolittle nel 1982 (mostrata qui sotto; vedere anche il sito http://www.expasy.org/cgibin/

protscale.pl dove sono presentate molteplici scale di questi tipo). Essa combina l’idrofobicità in

senso stretto con altre caratteristiche ottenute dall’osservazione di strutture note, e che sono

rappresentative della frequenza con cui l’amminoacido considerato è sepolto all’interno delle

proteine. Nonostante questa gradualità nella transizione da

idrofobico a polare, in molti casi è utile fare una

distinzione “binaria” tra amminoacidi idrofobici e

idrofilici, vale a dire individuare quelli che siano

indiscutibilmente o idrofobici o idrofilici. Adottando

questo approccio semplificato, possiamo raggruppare

gli amminoacidi come segue:

Modificazione delle proteine post-traduzionali

Le modificazioni post-traduzionali sono covalenti. Le membrane e proteine secretorie solubili

sintetizzate su ER subisce quattro principali modifiche prima che esse raggiungano le loro

destinazioni finali: (1) aggiunta covalente e la trasformazione dei carboidrati (glicosilazione)

nell'ER e nel complesso Golgi, (2) formazione di legami disolfuro nella ER, (3) folding adeguato

delle catene polipeptidiche e assemblaggio delle proteine multisubunitiche nel ER, e (4) scissioni

proteolitiche specifiche nel ER, complesso Golgi, e vescicole secretorie. In generale, queste

modifiche promuovono il folding delle proteine secretorie nelle loro strutture naturali e aggiungono

stabilità strutturale a proteine esposte all'ambiente extracellulare.

Modifiche come la glicosilazione consentono anche alla cellula per produrre una vasta gamma di

molecole chimicamente distinte con la superficie cellulare che costituisce la base di interazioni

molecolari specifiche, utilizzate nell'adesione e nella comunicazione da cellule a cellule. La

maggior parte delle proteine che sono sintetizzate sul raro ER e entrare nel lumen del ER sono

modificati dall' aggiunta di una o più catene di carboidrati. Proteine con i carboidrati collegati sono

conosciuti come glicoproteine. Le catene di carboidrato in glicoproteine attaccate al gruppo

idrossile (-OH) nei residui di sierina e treonina sono riferiti come O-linked oligosaccharidi, e catene

di carboidrati attaccati per amido di azoto di asparagina sono indicati come oligosaccharidi collegati

89

a N. I vari tipi di O-linked in cui gli oligosaccaridi includono le catene O-collegate di tipo mucino

(Chiamato dopo le glicoproteine abbondanti trovate nel muco) e le modificazioni dei carboidrati sui

proteoglicani descritti nel capitolo 20. Le catene O-linked sono tipicamente costituite da solo uno -

quattro residui di zucchero in una catena lineare, che sono aggiunte alle proteine da enzimi

conosciuti come glicoslettransferasi, situati nel lume del complesso di Golgi. I più comuni

oligosaccharidi N-linked sono più grandi e più complessi, contenenti diverse filiali. In questa

sezione, ci concentriamo su oligosaccharidi collegati a N, la cui sintesi iniziale si verifica

Nella ER. Dopo la glicosilazione iniziale di una proteina nel ER, la catena dell'oligosaccharide è

modificata nel ER e comunemente nel complesso di Golgi.

Formazione di legame di disolfuro, folding di proteine e montaggio di proteine multimeriche, che si

svolgono esclusivamente nel raro ER, sono anche discussi in questa sezione. Solo le proteine

piegate correttamente e assemblate vengono trasportate dalla ER rude al complesso Golgi e, infine,

alla superficie della cellula o altra destinazione finale attraverso il percorso di secrezione.

Le proteine vengono mantenute selettivamente nel grezzo ER e contrassegnate per la degradazione.

Consideriamo alcune caratteristiche di tale "Controllo di qualità" nell'ultima parte di questa sezione.

Come discusso in precedenza, sequenze N-terminali di segnale ER sono cedute da proteine

secretive solubili e da proteine di membrana di tipo I nel ER. Alcune proteine proteolitiche

specifiche agiscono nel complesso Golgi o nella secrezione vescicole. Copriamo questi frammenti,

così come le modifiche dei carboidrati che si verificano principalmente o esclusivamente nel

complesso Golgi, nel prossimo capitolo.

Modificazioni post-traduzionali nella via secretoria

La maggior parte delle proteine secrete vanno incontro a taglio proteolitico prima di uscire e le

modificazioni in senso stretto sono:

 Formazione di ponti disolfuro (solo nell'ER)

 Ripiegamento (solo nell'ER)

 Assemblaggio delle subunità di proteine oligomeriche (solo nell'ER)

 Addizione e rimaneggiamento di carboidrati (= glicosilazione)

 Maturazione proteolitica mediante proteolisi limitata

Formazione di ponti disolfuro (solo nell'ER): i ponti disolfuro sono caratteristici delle

proteine extracellulari, ossia che vengono secrete. Inoltre i ponti di solfuro si formano nel RE.

La formazione di un ponte disolfuro comporta la perdita di elettroni, e inoltre sono stabili

extracellularmente perché l’ambiente è ossidante a differenza che l’ambiente intracellulare è

riducente. Inoltre, i ponti disolfuro si formano a livello del RE, perché nel ripiegamento si

formano degli intermedi transienti che hanno una conformazione non corrispondente a quelle

della forma nativa, tra cui ponti disolfuro non previsti dalla conformazione attiva e affinché

questo possa avvenire, l’ambiente non deve essere né troppo riducente né troppo ossidante.

90 Perché l’ambiente del RE è

l’ideale? Perché è

intracellulare fisicamente, ma

topologicamente è

extracellulare. Il ripiegamento

avviene ad opera di proteine

di solfuro isomerasi PDI, che

hanno due modi distinti di

agire:

la PDI ha un ponte di

o

solfuro nel sito catalitico e lo

scambia con la proteina

ridotta. Lei si riduce e ossida

la proteina, formando un ponte disolfuro a spese della PDI.

Riarrangiamento dei ponti disolfuro: la proteina disolfuro isomerasi ha un effetto che

o non è ossidante in senso netto e parte viene ridotta e in parte ossida, fino a portare

alla forma finale.

Ripiegamento (solo nell'ER)

o Assemblaggio delle subunità di proteine oligomeriche (solo nell'ER)

o

Addizione e rimaneggiamento di carboidrati

(= glicosilazione): esistono proteine che

portano legate delle componenti

oligosaccaridicihe, che sono quelle secrete della

via secretoria. Le prime sequenze aa vennero

ottenute a fine anni 50’ con un processo

automatizzato di sequenziamento. La proteina

presenta il secondo aa come aa terminale. Nel

caso degli oligosaccaridi legato alle proteine la

questione si complica. I legami tra un zucchero

e l’altro hanno stereoisomerie che sono diverse.

Ci sono oligosaccardi legati alle proteine di 2

tipi:

 N-linked: si legano ad asparagina, dove vie

è un gruppo ammidico.

 O-linked: che si legano a serina CH2OH. Le varie cisterne del golgi non sono

funzionalmente equivalenti 91

Nell’ambito di entrambi vi è un enorme eterogeneità. Come ruoli biologici non così chiari e sono

largamente sovrapponibili.

Proprietà di oligosaccaridi legati a proteine Glicani (= oligosaccaridi) associati alla superficie

cellulare, a proteine intracellulari e a lipidi contribuiscono a numerose funzioni biologiche nei

sistemi animali. Strutture oligosaccaridiche alla superficie cellulare influenzano le interazioni con

l'ambiente extracellulare, fornendo ligandi per l'adesione cellulare (glicani sia legati ad N- sia legati

ad O- sono presenti su CAMs, Cell-Adhesion Molecules, e partecipano in questa condizione al

riconoscimento e legame tra cellule dello stesso o di diverso tipo). Glicani mediano interazioni

con macromolecole e l’invasione di patogeni. Inoltre, glicani associati a recettori e a proteine

alla superficie delle cellule modulano direttamente la segnalazione, oltre ad alterare la dinamica

dell’endocitosi delle glicoproteine e l’emivita della superficie cellulare attraverso il legame a lectine

polivalenti. Strutture oligosaccaridiche su glicoproteine di nuova sintesi sono cruciali per la

secrezione di proteine, in quanto influenzano il loro ripiegamento, forniscono ligandi per

chaperoni lectinici (= che legano oligosaccaridi legati a proteine), contribuiscono al controllo di

qualità nell’ER e mediano il transito e il targeting selettivo di proteine lungo tutta la via secretoria.

Ruoli più generali dei glicani comprendono la partecipazione alla regolazione delle funzioni

citosoliche e nucleari, la sorveglianza immunitaria, le reazioni infiammatorie, l’autoimmunità,

l'azione ormonale e le metastasi tumorali. È chiaro che queste modificazioni post-traduzionali

conferiscono un contenuto informativo addizionale a livello molecolare e cellulare che va al di

là del semplice flusso informativo dai trascritti genomici alle funzioni codificate nella

sequenza delle proteine. E 'stato stimato che circa 700 proteine sono necessarie per generare la

piena diversità dei glicani dei mammiferi (in tutto si stima siano ≥7,000 strutture), che vengono

assemblati da dieci soli monosaccaridi: fucosio (Fuc), galattosio (Gal), glucosio (Glc), N-

acetylgalattosamina (GalNAc), Nacetilglucosamina (GlcNAc), acido glucuronico (GlcA), acido

iduronico (IdoA), mannosio (Man), acido sialico (SA) e xilosio (Xyl). Tra queste proteine, circa 200

sono glicosiltransferasi, enzimi che allungano strutture di glicani preesistenti utilizzando zuccheri

associati a nucleotidi o a lipidi come donatori. I glicani possono essere legati alle strutture

polipeptidiche attraverso legami ammidici alle catene laterali di Asn (N-glicosilazione), attraverso

legami glicosidi (O-glicosilazione) a catene laterali di Ser/Thr, idrossilisina (nel collagene) o Tyr

(nel caso della glicogenina). In alternativa, essi possono essere attaccati come una struttura linker

che fa da ponte tra ancore di glicosilfosfatidilinositolo e il backbone di proteine.

92

Catene oligosaccaridiche che potrebbero foldare le

glicoproteine

Il dolicolo è una catena alifatica di natura isoprenoide

che è ancorata alla membrana. È uno zucchero con un

residuo difosfato, che forma un legame estere con il

gruppo alcolico. Altri importanti fattori sono di UD e

GDP. Questi NDP zuccheri sono legami ad alta energia e

il legame con il fosfato viene sfruttato per la biosintesi

della catena in crescita.L'altro attore è il GDP-mannosio,

UDP-glucosio, UDP-galattosio. Questi NDP zuccheri

sono le forme attivate dello zucchero e questo legame è

usato per la biosintesi.

Doicol fosfato lega un N-acetilglucosammina-P a livello del citosol, che è il modo più semplice per

raggiungere i vari NDP zuccheri. Nella prima reazione si forma un legame anidride tra i due fosfati.

Entra un altro UDP zucchero, entrano 5 GDP legati al mannosio (epimero rispetto al glucosio in

posizione 2) e si forma uno zucchero iniziale. Si ha successivamente un processo di flip-flop e dal

citosol si passa al lume del RE. L’accrescimento dell’unità oligosaccaridica continua nel lume del

RE dove andrà a legarsi alla proteina che deve essere glicosilata. Si aggiungono dodicol-

fosfomannosi, che sono stati sintetizzati nel citosol e sono stati flippati nel lume del RE.

Successivamente si aggiungono 3 UDP e alla fine si arriva al precursore, che è una struttura fissa.

Infine, tale struttura viene rimaneggiata in modi diversi:

 alcuni zuccheri vengono tolti

 altri zuccheri vengono aggiunti 93

Le catene laterali oligosaccaridiche possono promuovere il ripiegamento e la stabilità delle

glicoproteine. Il precursore è (Glc) (Man) (GlcNAC) . Al precursore, una volta sintetizzato perde i

3 2 2

glucosi. Si accorcia finché presenta una sola unità di glucosio. Questa struttura viene legata da due

proteine: calnexina (proteina di memebrana) e calreticulina (proteina solubile). Queste proteine

sono in grado di legare la componente polisaccaridica e vengono definite come lectine. La

calnexina è integrata nella membrana per interagire prontamente con la proteina in via di biosintesi.

Si ritiene che queste proteine siano chaperoni delle glicoproteine, che sono in grado di legare la

componente glicosaccaridica. Se la proteina permane a lungo nel lume del RE viene riconosciuta da

una proteina che la indirizza alla degradazione. Vi sono due tipi di controllo:

 calnexina e calreticulina che allungano il processo di folding, concedendo più tempo alla

proteina di ripiegarsi

 nel caso in cui la proteina rimanga più a lungo nel RE, intervengono delle mannosidasi che

accorciano progressivamente la struttura, viene riconosciuto da OX-9 e destinato alla

degradazione

Calnexina e calreticulina

(CNX/CRT) legano l’oligosaccaride

a cui è rimasto legato un solo

glucosio (figura subito qui sotto). Il

legame è reversibile, e al distacco la

proteina correttamente ripiegata può

proseguire lungo la via secretoria

passando al Golgi. Tuttavia, se in

questa fase la proteina non è ancora

correttamente ripiegata viene

riconosciuta da una

glucosiltransferasi che vi aggiunge

un’unità di glucosio. In tali

condizioni la proteina viene

nuovamente legata da calnexina e 94

calreticulina. Questo meccanismo rallenta il progresso nella via secretoria e dà più tempo alla

proteina di ripiegarsi correttamente grazie all’ausilio dei chaperoni che cooperano con CNX/CRT.

Se tuttavia nonostante i tentativi la proteina non raggiunge la conformazione nativa, permanendo a

lungo nel’ER perde molti mannosi ad opera di α-mannosidasi (figura in basso) e viene quindi presa

in carico da OS-9 che la indirizza al citosol attraverso il sistema ERAD dove viene degradata (si

confronti il grado di mannosidazione nel primo scenario, presentato in alto, rispetto al secondo,

presentato in basso).

Maturazione proteolitica mediante proteolisi limitata

la maggior parte delle proteine che sono secrete, prima di uscire vanno incontro ad un taglio

proteolitico.

Come vengono degradate le proteine del RE?

Quali sistemi proteolitici ci sono nel RE?

Non esistono sistemi proteolitici nel RE.

Queste proteine sono traslocate al citosol e lì

vengono degradate come le altre proteine.

Nel RE vi sono delle proteasi, ma non sono

programmate per lavorare in questo scenario.

Il sistema che si fa carico di traslocar le

proteine dal citosol viene denominato come

ERAD.

Esiste una retrotraslocazione, dislocazione,

dal reticolo al citosol. Non si sa come avvenga questa retrotraslocazione, ma probabilmente non

avviene a carico del traslocone. Il processo ERAD può essere suddiviso in tre fasi:

1.Riconoscimento di proteine misfolded o mutate nell'endoplasmico

reticolo

Il riconoscimento di proteine misfolded o mutate dipende dalla rilevazione di sottostrutture

all'interno di proteine come tali come regioni idrofobiche esposte, residui di cisteina e glicati

immaturi. Ad esempio, nelle cellule di mammiferi esiste un meccanismo chiamato processo di

glicemia. In questo meccanismo, la lectintype chaperoni calnexina / calreticulin (CNX / CRT)

forniscono alle glicoproteine immature l'opportunità di raggiungere la conformazione nativa. Essi

possono farlo attraverso la riglicosilazione di queste glicoproteine da un enzima chiamato

DUDPglucose- glicoproteina glucosiltransferasi. Tuttavia, è necessario estrarre le proteine

misfoldate da CNX / CRT. Questo è fatto da EDEM e ER mannosidasi I. Questa mannosidasi

rimuove un residuo di mannosio dalla glicoproteina e quest'ultima è riconosciuta da EDEM.

Finalmente l'EDEM taggerà la glicoproteina misfoldata per degradazione.

2.Retro-traslocazione nel citosol

Poiché il sistema ubiquitina-proteasome (UPS) è situato nel citosol, le proteine misfolded devono

essere trasportate dal reticolo endoplasmatico nel citoplasma. Il complesso proteico Sec61 è un

canale per il trasporto di queste proteine misfolded, tuttavia è il candidato improbabile come

trasportatore retrò attraverso il complesso, è difficile. Non si sa quale altra proteina della membrana

sia responsabile di questo trasporto. Inoltre, questa traslocazione richiede una forza motrice che

95

determina la direzione del trasporto. Poiché la poliubiquitina è essenziale per l'esportazione di

substrati, è probabile che questa forza motrice sia fornita da fattori vincolanti di ubiquitina. Uno di

questi i fattori di binding ubiquitina sono il complesso Cdc48p-Npl4p-Ufd1p nel lievito. Gli esseri

umani hanno l'omologo di Cdc48p nota come proteina contenente valosina (VCP / p97) con la

stessa funzione di Cdc48p. VCP / p97 trasporta i substrati del reticolo endoplasmatico al citoplasma

con l'attività ATPasi.

In particolare: fornisce un quadro aggiornato delle conoscenze in merito a ERAD. Naturalmente,

come prevedibile il quadro è decisamente complesso. Un problema centrale riguarda la fonte di

energia che rende possbile la retrotraslocazione. La risposta si può sintetizzare come segue:

- Esiste uno specifico complesso di proteine associate alla membrana ER che è dedicato a

questo compito.

- Nel complesso vi sono delle ubiquitina ligasi (E3), forse un canale di retrotraslocazione (ma

potrebbe essere che le proteine sono sospinte addirittura attraverso la membrana lipidica) e

soprattutto una proteina, Cdc48p, che è un fattore chiave nel processo. Cdc48p è una AAA-

ATPasi.

- Il passaggio sembrerebbe aver luogo mediante un meccanismo ratchet. La proteina appena

retrotraslocata viene ubiquitinata e con ciò può essere riconosciuta da Cdc48p che fornisce

la propulsione per il proseguimento e il completamento della retrotraslocazione grazie

all’idrolisi di ATP.

3. Degradazione dipendente da ubiquitina dal proteasome

L'ubiquitinazione di proteine misfolded è causata da una cascata di reazioni enzimatiche. Il primo di

queste reazioni avvengono quando l'enzima che attiva l'ubiquitina E1 idrolizza l'ATP e forma un'alta

efficienza tioestere tra un residuo di cisteina nel suo sito attivo e il C-terminale di ubiquitina. Il

risultato dell'ubiquitina attivata viene quindi passata a E2, che è un enzima che coniuga l'ubiquitina.

Un altro gruppo di enzimi, più specificamente proteine ligasi ubiquitiniche chiamate E3, si legano

alla proteina misfolded. Successivamente allineano la proteina e E2, agevolando così l'attaccamento

di ubiquitina ai residui di lisina della proteina misfolded. L'aggiunta di molecole di ubiquitina a

residui di lisina, permette la formazione di una catena di poliubiquitina. Viene prodotta una proteina

polyubiquitinata e questa è riconosciuta da subunità specifiche nel cappellamento del complesso

19S del proteasome 26S. In seguito, la catena del polipeptide viene alimentata nella camera centrale

del nucleo 20S Regione che contiene i siti proteoliticamente attivi. L'ubiquitina è ceduta prima della

digestione da enzimi deubiquitinati. Questo terzo passaggio è strettamente associato al secondo, in

quanto durante l'ubiquitazione avviene l'evento di traslocazione. Tuttavia, il degrado proteasomico

avviene nel citoplasma.

Macchina ERAD:

Il dito RING ancorato alla membrana ER contenente ubiquitina ligasi Hrd1 e Doa10 sono i

principali mediatori del substrato ubiquitina durante ERAD. La coda ha ancorato la proteina della

membrana Ubc6 così come Ubc1 e il Cue1 dipendente della membrana Ubc7 sono gli enzimi di

coniugazione ubiquitina coinvolti nell'ERAD.

Malattie associate a malfunzionamento ERAD

96

Poiché ERAD è un elemento centrale della via della secrezione, i disturbi della sua attività possono

causare una serie di malattie. Questi disturbi possono essere classificati in due gruppi.

Il primo gruppo è il risultato di mutazioni nei componenti ERAD, che successivamente perdono la

loro funzione. Perdendo la loro funzione, questi componenti non sono più in grado di stabilizzare

proteine aberranti, in modo che questi ultimi si accumulino e dannegginno la cellula. Un esempio di

una malattia causata da questo primo gruppo di disturbi è la malattia di Parkinson. È causata da una

mutazione nel gene del parkin. Parkin è una proteina che funziona in complesso con CHIP come

ubiquitina ligase e supera l'accumulazione e l'aggregazione di proteine misfolded.

A differenza di questo primo gruppo di disturbi, il secondo gruppo è causato da un degrado precoce

nella secrezione dell proteine della membrana. In questo modo, queste proteine non sono in grado di

essere schierate in compartimenti distali, come è il caso della fibrosi cistica.

ERAD e HIV

Come descritto in precedenza, l'aggiunta di catene poliubiquitina ai substrati ERAD è fondamentale

per la loro esportazione. L'HIV usa un meccanismo efficace per dislocare una proteina ospite ad una

membrana, CD4, dalla ER e la sottopone ERAD. CD4 è normalmente una proteina stabile e non è

probabile che sia un bersaglio per ERAD. Tuttavia, l'HIV produce la proteina di membrana Vpu che

si lega al CD4. Poiché Vpu è fosforilato, imita i substrati per il complesso E3 SCFβTrCP. Nelle

cellule infette da HIV, SCFβTrCP interagisce con Vpu e ubiquitinati CD4, che è successivamente

degradato dal proteasome. Vpu stesso sfugge al degrado.

Acido sialico

L'acido sialico è un termine generico per

i derivati N- o O-sostituiti di acido

neuraminico, un monosaccharide con un

backbone di nove carboni. È anche il nome per il membro più comune di questo gruppo, l'acido N-

acetilneuraminico (Neu5Ac o NANA). Gli acidi sialici si trovano ampiamente distribuiti nei tessuti

animali e, in misura minore, in altre specie che vanno dalle piante e dai funghi ai lieviti e ai batteri,

soprattutto nelle glicoproteine e nei gangliosidi. L'amino gruppo generalmente porta un gruppo

acetilico o glicolico, ma altre modificazioni sono state descritte. I sostituenti idrossilici possono

variare notevolmente: sono stati trovati gruppi acetilici, lattilici, metilici, solfati e fosfati. Il termine

"acido sialico" (dal greco per la saliva, σίαλον / sialon) fu introdotto per la prima volta dal

biochimico svedese Gunnar Blix nel 1952.

La numerazione della struttura dell'acido sialico

inizia dal carbonio carbossilato e continua attorno

alla catena. La configurazione che pone il

carbossilato nella posizione assiale è l'anoma alfa.

Nei sistemi batterici, gli acidi sialici

vengono biosintetizzati da un enzima di

aldolasi. L'enzima usa un derivato di

mannosio come substrato, inserendo tre

carboni dal piruvato nella struttura

risultante dell'acido sialico. Questi enzimi possono essere usati per la sintesi chemoenzimatica di

derivati dell'acido sialico 97

Le glicoproteine ricche di acido sialico (sialoglycoproteins) legano la selenina negli esseri umani e

negli altri organismi. Le cellule tumorali metastatiche spesso esprimono un'elevata densità di

glicoproteine ricche di acido sialico. Questo aiuta queste cellule tumorali in fase tardiva a entrare

nel flusso sanguigno.

L'acido sialico svolge anche un ruolo importante nelle infezioni da influenza umana. I virus

influenzali (orthomyxoviridae) presentano le loro glicoproteine (HA) di attività di hemagglutinin

che si legano agli acidi sialici presenti sulla superficie degli eritrociti umani e sulle membrane

cellulari del tratto respiratorio superiore. Questa è la base dell'em-agglutinazione quando i virus

vengono mescolati con le cellule del sangue e l'ingresso del virus nelle cellule del tratto respiratorio

superiore.

Gli oligosaccharidi ricchi di acido sialico sui glicoconjugati (glicolipidi, glicoproteine,

proteoglicani) presenti sulle membrane superficiali aiutano a mantenere l'acqua alla superficie delle

cellule. Le regioni ricche di acido sialico contribuiscono a creare una carica negativa sulla

superficie delle cellule. Poiché l'acqua è una molecola polare con cariche parziali positive su

entrambi gli atomi di idrogeno, è attratto dalle superfici cellulari e dalle membrane. Ciò contribuisce

anche all'assorbimento del liquido cellulare.

L'acido sialico può "nascondere" antigeni mannose sulla superficie di cellule ospite o batteri da

lectina legante di mannosio. Questo impedisce l'attivazione del complemento.

L'acido sialico sotto forma di acido polisilico è una modifica post-translazionale insolita che si

verifica sulle molecole di adesione delle cellule neurali, NCAM. Nella sinapsi, la forte carica

negativa dell'acido polisilico impedisce la creazione di un collegamento incrociato di cellule

NCAM.

Nello specifico: l’acido sialico viene aggiunto a glicoproteine, in particolare di vertebrati, nelle fasi

terminali del rimaneggiamento degli oligosaccaridi: si faccia riferimento a pag. 648).

Oligosaccaride legata alla proteina che è ripiegata e va nel cis-golgi. I RE riceve il precursore,

TRIM (tagliare nel cis e trans golgi) ci sono ulteriori rimaneggiamenti e aggiunta di altri zuccheri

come N-acetilglucosammine. Nel trans vengono aggiuti acido sialico. Nei mammiferi molti

oligosaccaridi.

Sial (saliva) acido di saliva connota diverse differenze strutturali:

- è uno zucchero

- c'è un gruppo carbossilico che non è il tratto distintivo di uno zucchero che non ha cariche, e

quindi conferisce una carica negativa allo zucchero.

Le selectine sono coinvolte nelle interazione tra molecole/cellule.

-L'acido sialico è il recettore del virus dell'influenza nella superficie delle cellule che ha infettato.

-gli oligosaccaridi con acido sialico ne guscio esterno sono molto idratati, questo contribuisce

all'interazione con il fluido cellulare.

I diversi comparti del golgi non sono uguali dipende dalla funzione:

-cis rimuove mannosio

è questo permette un rimaneggiamento progressivo.

98

non c’è nessuna evidenza che vi sia un canale specifico diverso dal traslocone. Vi potrebbe essere

una spinta diretta del citosol che le fa passare attraverso il doppio strato lipidico. Nel citosol, le

proteine vengono prese in carico da un sistema complesso P57 (AAA ATPasi) che accoppia

l’idrolisi dell’ATP, in modo da consentire la traslocazione. Alla fine le proteine vengono

deubiquinate e indirizzate al proteasoma.

Il traffico vescicolare

Oligosaccaride legato a proteina che procede nel cis Golgi.

Il RE riceve il precursore, si ha il taglio di residui di

mannosio e si ha un’ulteriore aggiunta di zuccheri durante

il passaggio nelle cisterne del Golgi. Nel cis Golgi

vengono rimossi tutti i mannosi e nel med-Golgi vengono

aggiunti N-acetilglucosammine, nel trans, infine, vengono

aggiunti acidi sialici (nei mammiferi, molti oligosaccari

presentano acido sialico). Con acido sialico si indica un

termine generico. È un sinonimo di N-acetilneuramminoco

(NANA). Sono strutture che sono coinvolte nelle

interazioni tra molecole tra cellule. L’acido sialico è il

recettore del virus dell’influenza. Le regioni ricche di

acido sialico contribuisco a creare delle regioni a carica

negativa. I

diversi

comparti del Golgi non sono equivalenti l’uno

all’altro, hanno funzioni diverse, rendendo

possibile il rimaneggiamento progressivo delle

proteine.

Nelle fasi precoci sono implicati fenomeni di

traslocazione e di modificazione delle proteine.

Nelle fasi più avanzate della via secretoria i

protagonisti sono le vescicole.

 Sintesi proteica

 →

cis Golgi network Il golgi si forma

con gemmazione di vescicole dal RE, dando

origine a nuove cisterne che sono quelle del cis-

Golgi network, che sono cisterne appiattite e in

via di formazione. L’evoluzione delle cisterne

ha due possibilità:

1. le cisterne più prossimali si formano per

apposizione di vescicole e così via.

2. Oppure mediante il modello di

maturazione delle cisterne

99

3. Trasn Golgi network

4. esiste anche un trasporto retrogrado, ossia un trasporto dai comparti più distali ai comparti

più prossimali. Serve a trasportare proteine che sono trasportate per sbaglio nei comparti più

avanzati

5. Lisosoma: si forma con vescicolazione da parte del trans Golgi network oppure vescicole di

natura endocitica. Nel lisosoma vi sono enzimi litici come proteasi, esterasi.

Dal transgolgi gemmano anche vescicole che si fondo con la plasmamembrana che rilasciano

all’esterno proteine da secernere. Vi sono due modalità:

 secrezione costitutiva Tutte le cellule sono secernenti, in quanto possono secernere proteine

della matrice extracellulare.

 secrezione regolata: vi sono delle linee cellulare, che sono tenute a secernere in base alla

loro funzione. Vengono secreti ormoni peptidici (insulina glucagone9, endorfine, encefaline,

ACTH, enzimi digestivi (pancreas esocrino), albuina, trasferrina, lipoproteine.

Tecniche per studiare per la via secretoria

In questo esperimento hanno fatto una proteina di membrana VSV del virus della stomatite

vescicolare. Hanno trasfettato con un costrutto della proteina di inclusione e il gene che codifica

questa proteina è sensibile alla temperatura e si esprime in modo condizionale: a 40° il prodotto del

gene è trattenuto nel RE, è un mutante condizionale. Successivamente si abbassa la temperatura a

32° e si può notare la migrazione della proteina, prima nel Golgi e successivamente nella

Golgi → plasma

plasmamembrana. Il progresso delle proteine segue la sequenza dal RE→

membrana.

Mutanti secretori di lievito, non condizionale con delezione permanente della via secretoria, questa

delezione è letale. Mutanti condizionali sono mutanti che ad una certa temperatura manifestano il

100

tipo mutato ad un’altra no. Le proteine possono essere mutate in modo che siano molto meno

termostabili del wild type. Nella cellula di lievito di partenza vi è una condizione normale: vi è

secrezione normale a livello del RE, Golgi e nella membrana. La proteina di interessa viene usata

come marker e può fermarsi in diversi comparti.

 Cellula di lievito i cui c'è la secrezione normale (primo), la secrezione di una proteina si

vede nel golgi, membrana secretoria, RE. Marcando posso rilevarne la presenza nei

comparti in cui si trovano

 Mutanti di classe A: la proteina può fermarsi nel citosol

 mutanti di classe B. la proteina si accumula nel RE

 mutanti di classe C: accumulo di vescicole di trasporto tra RE e golgi

 mutanti di classe D: accumulo nel Golgi

 mutanti di classe E: accumulo nelle vescicole secretorie.

I mutanti di classe A si possono già identificare. Tutto il sistema di traslocazione sono componenti

che se mutate comportano questi effetti. Come hanno potuto ricostruire la sequenza di eventi che

dal citosol porta alla secrezione? Basta fare doppi mutanti. Esempio: In una sequenza di eventi

cellulari, come una via metabolica o la traslocazione di proteine lungo la via secretoria, un blocco

(dovuto ad esempio a una mutazione o a un trattamento con un farmaco), determina l’accumulo

immediatamente a monte del punto di blocco

Ad esempio in questo caso si accumula B. Nel

caso di doppie mutazioni l’accumulo è a livello

del punto più a monte nella sequenza di eventi.

Anche in questo caso si accumula B. Nel caso

della via secretoria accadrà che le proteine si

accumulano in tutti i compartimenti a monte

del punto di blocco più precoce. Ciò consente di ricostruire la

→ C è

sequenza di eventi che compongono la via (la transizione B

più precoce di quella C → D) Nella tabella viene indicato il fenotipo

dei doppi mutanti. 101

Uno degli eventi chiave del traffico vescicolare è

costituito dalla formazione delle vescicole e dalla loro

fusione. Vi sono diversi tipi di vescicole con diverse

componenti vescicolari.

Come fa a gemmare una vescicola da una

memebrana? Ci sono sempre proteine coat proteins

che si legano al sito di riconoscimento della

membrana donatrice. Vi sono 3 tipi di proteine di

rivestimento: clatrina, COPII e COPI.

Vi sono proteine di membrana che devono essere

trasportate e le vescicole mediano il trasporto di

queste proteine. Le proteine di membrana hanno un

tratto citosolico e interagiscono con le proteine di

rivestimento. Vi sono anche le proteine cargo-

receptor che interagiscono con le proteine di

rivestimento. Molte proteine nelle vescicole sono

proteine solubili. Ci sono anche delle proteine che si

chiamano SNARE. Dopo che la vescicola si è

formata, circondata dalla coat-proteine, essa poco

dopo si disassembla. Come fa la vescicola a fondersi

in modo selettivo alla memebrana a cui deve

arrivare? Le SNARE riconoscono degli omologhi nelle membrane di arrivo.

Quando si forma una vescicola, un certo tratto di una membrana si introflette. Da un tipo di

vescicola all’altro la componente molecolare varia, soprattutto le coat-proteins, ossia le proteine di

rivestimento. Ogni tipo di trasporto, caratterizzato dal tipo di membrana, ha il suo specifico tipo di

proteina, in modo da determinare il riconoscimento. Queste proteine includono 3 tipi di molecole:

 molecole che realizzano il trasporto di membrana, grazie al loro dominio citosolico.

 Molecola cargo di membrana per le proteine solubilità

Per riconoscere la membrana target, è indispensabile che le proteine di rivestimento si allontanino

successivamente e non ricopino più la proteina stessa. Sia sulle membrane target che sulle

membrane di arrivo vi sono le SNARE, che hanno sistemi specifici e selettivi di riconoscimento.

Tutte le membrane hanno gli SNARE , ma non tutti gli SNARE riconosco le stesse membrane. Se si

avvicina due doppi strati lipidici questi si fondo perché la fusione comporta una condizione più

stabile e al mantenimento dell’individualità della vescicola stessa.

Vi è anche un sistema di strozzamento della vescicola: la formazione della vescicola è un processo

relativamente semplice. Le coat proteins portano ad una curvatura. Vi sono diversi tipi di coat

proteins:

 COP II trasportano vescicole dal RE al Golgi, trasporto anterogrado

 COP I responsabili del trasporto retrogrado

102

 clatrina: proteina di membrana più studiata, va dal trans golgi all’endosoma, dalla

plasmamemebrana all’endosoma, dal golgi al lisosoma ecc.

Dalla tabella di vede che COP II si muove con andamento antiretrogrado, COP I andamento

retrogrado, clatrina è la più importante: si muove dalla plasmamembrana all'endosoma, dal trans

golgi a endosoma.

Idealmente le proteine di rivestimento possiedono anche adaptor-proteins AP che connettono le

proteine di rivestimento alle molecole che sono reclutate all’interno della vescicola. Nel caso del

sistema della clatrina, le adaprtor protins sono ben distinte dalle molecole che compongono la

clatrina in senso stretto. Ci sono diversi tipi di adaptor proteins API, GGA AP2. Le COP proteina

possiedono anche loro adaptor proteins ma non sono ancora state specificate in modo chiaro. Sar1

GTPasi più importante.

Le componenti adattatrici mediano il contatto tra le proteine di rivestimento e quello che devono

essere reclutate dalla vescicola → clatrina

Componenti delle vescicole rivestite da clatrina

 Clatrina L’unità base è il triskelion, composto di 3

heavy chains (180 kDa, filamentose, con un dominio

globulare terminale, e 3 light chains (35-40 kDa). Ogni

braccio consiste di una heavy e una light chain.

Triskelion ha una curvatura piccola, ma se si mettono

insieme più unità avviene l'introflessione della

membrana e la formazione della vescicola.

 Assembly particles hanno una massa molecolare

complessiva di ca. 340 kDa consistono di 4 diverse

subunità dette adapter proteins. Un esempio di adapter

protein è m2, che riconosce YXXΦ e LL. Legano il

dominio globulare della clatrina e ne promuovono la polimerizzazione. Legano il lato

citosolico delle proteine di membrana selezionando così quelle che vengono incluse in una

data vescicola. Sono stati identificati tre tipi di assembly particles, AP1, AP2 e AP3,

composte di adapter proteins differenti anche se correlate

 Dinamina ca. 900 AA. Polimerizza e si contrae in un processo che consuma GTP,

strozzando il collo delle vescicole. 103

Proteine GTPasiche

controllano l'assemblaggio della vescicola di rivestimento. C'è un recettore Ser1 che lega la proteina

GTPasica, questo meccanismo (in COP II) è condiviso da tutte le vescicole. Sono fenomeni

all'origine dell'assemblaggio delle proteine di rivestimento. Il legame Ser1 e SEC12 innesca lo

scambio GDP in GTP, subito dopo la Sar1 si integra nella membrana grazie al suo N-t

(modificazioni conformazionali innescata dal primo legame ser1 e sec12). Questo porta alla

polimerazzione dei coacomeri (componenti delle proteine di rivestimento). Quello che segue è

l'idrolisi dell'GTP è un fattore di controllo della temporalizzazione ed è un elemento che genera

energia (infatti il cambio conformoazionale non avviene spontaneamente). L'idrolisi porta al

disassemblaggio: il sarGDP nello stato basale, incapace di legare le proteine di rivestimento,

L'idrolisi permette il rilascio della COAT proteins e la vescicola rimane scoperta.

I componenti proteici che controllano l'assemblaggio delle

diverse proteine di rivestimento delle vescicole

Tutti e tre i tipi di vescicole contengono una piccola proteina che lega GTP, che si comporta come

una subunità regolatoria nel controllo dell'assemblaggio delle proteine di rivestimento (figura 17-

7a).

Nel caso di COP I e clatrina, questa proteina che lega GTP è nota come ARF; nel caso di COP II si

tratta di una proteina simile ma non identica ad ARF, denominata Sar1. Entrambe sono proteine

della classe delle proteine Ras, coinvolte nella trasduzione del segnale. A loro volta tutte queste

proteine sono incluse nella superfamiglia delle GTPasi che legano e idrolizzano GTP. Il ciclo è

descritto per le proteine Sar in figura 17-9.

1) una proteina di membrana dell’ER nota come

Sec12 catalizza il rilascio del GDP dal complesso

citosolico Sar1/GDP e il successivo legame di GTP.

Probabilmente la Sec12 “percepisce” una serie di

segnali nel suo intorno, in particolare la presenza di

proteine cargo pronte al trasporto.

2) il legame di GTP causa una un cambiamento

conformazionale in Sar1 che porta il suo N-terminale

idrofobico a integrarsi nella membrana dell’ER,

ancorando così la proteina Sar1/GTP alla membrana

stessa. In questo stato essa promuove la

polimerizzazione delle subunità dei complessi

citosolici di COP II.

3) una volta che le vescicole COP II sono rilasciate

dalla membrana di origine, l'attività Sar1/GTPasica idrolizza GTP, un'attività probabilmente attivata

da una delle subunità del rivestimento. Tale idrolisi promuove il disassemblaggio del rivestimento

stesso.

Per le proteine ARF il ciclo è simile a quello descritto. Ci sono solo alcune piccole differenze. Una è

che la proteina è legata debolmente alla membrana attraverso una catena di miristato, a sua volta

legata covalentemente all'N-terminale della proteina stessa. Dopo che il GDP legato è stato

104

scambiato con GTP grazie all'azione di un fattore di scambio associato alla membrana del Golgi,

ARF si associa stabilmente con la membrana stessa attraverso il suo tratto N-terminale. Ciò mette in

moto gli eventi che portano all'assemblaggio del rivestimento. Certe mutazioni di Sar1 o l'aggiunta

di una forma non idrolizzabile di GTP, consentono la formazione delle vescicole ma non il

disassemblaggio delle proteine di rivestimento.

Analogo non idolizzabile dell’ATP. Ci sono dei processi che sono

attivati da queste molecole senza necessità di idrolizzarle. Hanno

sviluppato una serie di analoghi non idrolizzabili per distinguere il

caso in cui siano sempre in legame al caso in cui si verifichi

idrolisi. l’idrolisi di GTP è indispensabile per il dissasemblaggio

in quanto fornendo analoghi del GTP questo non si verifica.

Pitch off: distacco della vescicola dalla memebrana.

Fusione delle vescicole con le membrane di destinazione

Una volta che la vescicola è formato e il rivestimento dissasemblato, la vescicola deve legarsi alla

membrana del residuo. Insorge un problema di riconoscimento degli attori molecolari del processo.

I protagonisti sono le proteine SNARE (recettori di SNAP), NSF e SNAP (proteine solubili di

aggancio all’NSF). Una vescicola priva di fold proteins, presenta nella memebrana altre proteine

che sono a loro volta delle proteine che idrolizzano GTP e si ha la presenza di VAMP che è un tipo

particolare di SNARE. · La fusione si verifica sempre

dopo la depolimerizzazione

delle coat proteins.

· Nelle vescicole ci sono

proteine integrali di membrana

v-SNARE; nelle membrane di

destinazione ci sono proteine

integrali di membrana t-

SNARE che con le proteine

solubili SNAP-25 formano il

complesso ternario che lega le

vescicole alle membrane di destinazione.

· Esistono diverse varianti di v-SNARE e t-SNARE; l'esistenza di tale diversità è alla base della

specificità di riconoscimento tra vescicole e membrane di destinazione (ad es.: nel lievito più di 20

tipi diversi per v-SNARE e per t-SNARE).

· SNAP-25 è legata alla membrana d’arrivo con un’ancora lipidica circa nel mezzo della sequenza

della proteina.

· All’arrivo della vescicola, v-SNARE, t-SNARE e SNAP-25 formano un complesso ternario (che

in certi casi noti consiste in un fascetto di quattro eliche, anche se la modalità di partecipazione

delle tre molecole alla formazione di tale fascetto può variare leggermente in casi diversi); questo

evento innesca la fusione della membrana. 105

· Dopo che la fusione si è verificata, il complesso ternario non si dissocerebbe da solo, o lofarebbe

molto lentamente. Tuttavia in vivo esistono altri fattori proteici che favoriscono il processo di

dissociazione del complesso ternario: NSF (un omoesamero che lega e idrolizza ATP) e α-SNAP.

· Si noti che se la dissociazione del complesso ternario non avviene, v-SNARE e t-SNARE e

SNAP25 non vengono rese nuovamente disponibili per ulteriori eventi di fusione, che quindi non si

verificano più (o si verificano molto più lentamente).

· Mutazioni che compromettono il funzionamento del sistema descritto producono il fenotipo

dei mutanti di classe C.

· Le proteine Rab sembrano essere i ''temporizzatori'' del processo di fusione. Le proteine Rab

(consistenti di circa 200 amminoacidi) sono simili alle Ras, e come queste ultime legano e

idrolizzano GTP. Di conseguenza lo stato "basale" di Rab prevede che essa porti legato GDP.

· Quando Rab porta GDP legato, una proteina citosolica denominata GDI, catalizza lo scambio

GDP/GTP. Con GTP legato, Rab lega immediatamente una vescicola (a livello di una proteina alla

superficie della membrana).

· Rab/GTP riconosce e lega il recettore sulla membrana di arrivo e questo innesca l’idrolisi di GTP,

e di conseguenza Rab viene rilasciata (nella forma Rab/GDP).

· La velocità del processo viene determinata dalla concentrazione di Rab/GTP. · Sembrano

esistere diverse

proteine Rab,

ciascuna

specifica per un

dato tipo di

vescicola.

Sistema di

reclutamento in vescicole: proteine cargo

riconosce in modo specifico delle molecole

o dei complessi molecolari da trasportare.

Quali sonno i segnali di riconoscimento dal

lato citosolico? Quali sono i segnali che

vengono riconosciuti da parte delle cargo

proteins che devono essere legati e poi

trasportati?

Le proteine presentano il c-t dal lato

citosolico, quello che viene riconosciuto

sono brevi sequenze di 2 o 3 seq che si

trovano al c-t oppure possono essere anche

interne alla seq e vicine al c-t. Le COPI

mediano il trasporto retrogrado (dalle cisterne più distali a quelle più prossimali del Golgi) vengono

riconosciute delle proteine con lisine, aspartato e glicina KDEL. Il recettore del Man-6P , il cui

106

ruolo principale è il trasporto dal trans Golgi ai lisosomi, in quanto il mann-6p è una modifica ed è

il prerequistivo neccessario e sufficiente per una proteina che viene portata al lisosoma. In questi

esempi si hanno a che fare con endocitosi mediata da recettore.

Uno schema che presenta un caso specifico di sistema completo di

reclutamento in vescicola di “membrane cargo-receptor protein “. Vi

compaiono la clatrina, una AP, una membrana cargo-receptor protein

con sequenza riconosciuta da AP e la molecola reclutata (una

glicoproteina destinata al lisosoma, e che quindi viene riconosciuta

grazie al mannosio 6-P che espone).

Stadi precoci della via secretoria

il trasporto retrogrado garantisce il ritorno di

proteinemissfolding. Quando si forma una vescicola qualcosa

viene inglobato dentro casualmente. La vescicola include un

certo spazio nel sistema di cisterna da cui gemma. In quello

spazio ci sono molecole che sono destinate a permanere in

quel sistema e di conseguenza alcune molecole devono

essere rilasciate.

Le COP II sono costituite da diverse proteine sec (mutazioni

di queste proteine generano mutanti nella via secretoria). La

sequnza di riconoscimento interagisce con una delle

componenti della Coat protein. Alcune cellule, piccole vescicole fluorescenti contenenti

VSVG-GFP potrebbero essere considerate dalla ER,

muovono meno di 1 μm e quindi si fondono direttamente

con il cis-Golgi. In altre cellule, in cui l'ER era

localizzato diversi micrometri dal complesso Golgi,

parecchie vescicole derivate da ER venivano fuse con

l'altra poco dopo la loro formazione, formando ciò che è

definito il compartimento intermedio ER-to-Golgi o il

cis- Rete Golgi. Queste strutture più grandi sono state poi

trasportate lungo i microtubuli al cis-Golgi, molto nel modo in cui i vescicoli nei neuroni vengono

trasportati dal corpo cellulare, dove si formano, lungo il lungo assone fino al capo dell'assone (vedi

capitolo 18). I microtubuli funzionano come "binari ferroviari", che consentono a questi grandi

aggregati di vescicole di trasporto di muovere le lunghe distanze alla loro destinazione cis-Golgi. Al

momento in cui si forma il compartimento intermedio ER-to-Golgi, alcune vescicole COPI

scoppiano da esso, riciclando alcune proteine al ER.

In altre cellule, in la ER si trovava diversi micrometri dal complesso Golgi, parecchie vescicole

derivate da ER furono accese. Gemmano o direttamente.

107


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129

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12.54 MB

AUTORE

yetapia

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher yetapia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica cellulare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano Bicocca - Unimib o del prof Tortora Paolo.

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