Biochimica cellulare

MHC

Immunoproteasoma: Oltre al normale proteasoma, che degrada di routine le proteine cellulari mediante

meccanismi di norma specifici e controllati dalla ubiquitinazione (il cosidetto proteasoma housekeeping), esiste

una variante denominata immunoproteasoma. L’immunoproteasoma è una forma specializzata di proteasoma,

coinvolta nella risposta immunitaria a livello dei tessuti. In particolare, esso produce i peptidi immunogenici che

tutti i tipi cellulari possono esporre sulla superficie ad opera dei maggiori complessi di istocompatibilità di classe I

(MHC class I).

Gli MHC I e gli MHC II

Oltre agli MHC I esistono anche gli MHC II. Mentre gli MHC I sono presenti a livello della plasmamembrana di

tutti i tipi cellulari, gli MHC II si trovano solo sulla plasmamembrana di cellule specializzate nella fagocitosi:

cellule dendritiche, macrofagi, linfociti B.

 Gli MHC I espongono peptidi generati intracellularmente e riconosciuti come estranei: si tratta

soprattutto di prodotti di degradazione di proteine virali, ma anche di proteine derivanti da altre

condizioni patologiche, in particolare la trasformazione tumorale o determinate mutazioni.

 Gli MHC II espongono invece peptidi derivanti da molecole o organismi riconosciuti come estranei,

e quindi antigenici, che si presentano nell’organismo a livello extracellulare, quali batteri, parassiti e

tossine. Questi sono fagocitati dalle cellule specializzate (menzionate sopra) e degradati di norma nei loro

lisosomi.

La struttura di MHC I e MHC II

Gli MHC I consistono di due proteine: la

catena maggiore formata da 3 dominii α

omologhi, e che presenta un tratto

transmembrana che la ancora alla membrana

medesima; la β 2-microglobulina, consistente

di un unico dominio, legato non

covalentemente alla catena maggiore. Gli

MHC II consistono di due catene di

dimensione praticamente uguale, ciascuna

formata da due dominii omologhi ( α1 e α 2 in

una delle due; β 1 e β 2 nell’altra catena).

Entrambe presentano un tratto transmembrana. 65

Come MHC I e MHC II innescano la risposta immunitaria

Le strutture di MHC I e MHC II sono costruite in

modo da formare un solco in cui si accomodano i

peptidi antigenici. Data la ampia diversità di antigeni e

dei peptidi che ne derivano, il legame a livello del

solco è largamente aspecifico, tanto in MHC I quanto

in MHC II. Tuttavia i peptidi che si legano a MHC II

sono dimensionalmente molto più eterogenei

(lunghezza da 8 a 30 residui) rispetto a quelli che si

legano a MHC I (lunghezza da 8 a 11 residui). La

variabilità in lunghezza molto minore di questi ultimi

è una diretta conseguenza del fatto che tali peptidi

sono generati da un proteasoma.

A seguito della esposizione dei peptidi antigenici a

livello di MHC I e MHC II, viene attivata la risposta immunitaria. Essa è mediata dai linfociti T, che mediante

specifici recettori legano gli MHC, come schematicamente illustrato nella figura che segue.

Come gli MHC I prendono in carico i peptidi antigenici

Gli MHC I sono proteine di membrana e

come tali sono proteine della via

secretoria. Ciò implica che sono

traslocati e inseriti in membrana co-

traduzionalmente, vale a dire a livello

membrana del reticolo endoplasmico

(ER) già durante la loro sintesi. I peptidi

prodotti dall’immunoproteasoma e

destinati agli MHC I sono accorciati da

peptidasi citosoliche, ed anche nell’ER

da altre peptidasi (in particolare TPPII:

Tripeptidyl protease II). I peptidi

antigenici così rimaneggiati vengono

legati da MHC I nell’ER. Esiste quindi

un sistema per la loro traslocazione,

come illustrato nello schema che segue.

In particolare, il loro trasporto nell’ER

avviene mediante il TAP (Transporter Associated with Antigen Processing) che è specializzato per questo scopo.

Nel lume dell’ER, TAP è associato con la tapasina, una proteina che stabilisce la sua interazione con gli MHC I

vuoti, permettendo il legame con i peptidi (vedere schema che segue).

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L’immunoproteasoma

Gli MHC di classe I espressi alla superficie cellulare presentano all’ambiente esterno peptidi antigenici in modo

che possano essere specificamente riconosciuti dai linfociti T citotossici (CTL). Queste cellule T specializzate

sono in grado di individuare altre cellule che esprimono al loro interno molecole proteiche estranee o aberranti

(cioè mutate) e successivamente rimuovere queste cellule indesiderate dal corpo. Questo sofisticato sistema di

riconoscimento dipende totalmente dalla presentazione di peptidi antigenici nel solco degli MHC I. La

generazione di questi peptidi richiede la degradazione delle proteine in frammenti peptidici di ben definite

dimensioni. Gli MHC I sono espressi su tutte le cellule nucleate dell’organismo, incluse le cellule specializzate

nella presentazione degli antigeni, come le cellule dendritiche. Essenzialmente, tutte le cellule producono peptidi

antigenici facendo uso delle proteasi normalmente coinvolte nel turnover delle proteine. Si tratta innanzitutto del

sistema ubiquitina-proteasoma, anche se oggi sono note diverse altre proteasi e peptidasi. Il sistema immunitario

ha sfruttato il proteasoma per selezionare, dai peptidi derivanti dai prodotti di degradazione delle proteine, quelli

adatti alla presentazione alla superficie cellulare. Pertanto, la generazione di peptidi antigenici può essere

considerato in buona parte come un sottoprodotto del turnover proteico basale.

Nei vertebrati si sono anche evolute delle subunità specializzate del proteasoma, il cui ruolo è essenzialmente la

produzione di antigeni da destinare alle MHC I per la “presentazione” extracellulare. Subunità specializzate sono

presenti nella componente catalitica 20 S degli immunoproteasomi (figura a lato), ma anche nei loro complessi

regolatori, come nell’attivatore PA28 del proteasoma (figura sotto). Sebbene il proteasoma sia il principale sistema

proteolitico responsabile della produzione dei peptidi antigenici, recenti evidenze suggeriscono che altre peptidasi

contribuiscono significativamente alla produzione del pool dei peptidi. Ad esempio, il proteasoma è

principalmente responsabile della generazione del C-terminale corretto del peptide che verrà presentato a livello

dell’MHC I, mentre l’Nterminale è spesso prodotto da successivi tagli proteolitici. In secondo luogo, una parte dei

peptidi può essere generata indipendentemente dal proteasoma. Ciò indica che altre eso- ed endo-peptidasi sono

coinvolte. Il prpoteasoma 20S è costituito da 28 subunità da 21 a 31 kDa,

che sono arrangiate in 4 anelli sfalsati ad eptameri. L’anello

esterno contiene le subunità alfa, l’anello interno le subunità beta.

3 delle sette subunità beta in ogni anello beta ospita un sito

attivo. In totale ci sono 6 siti attivi dentro al complesso 20S. Il

regolatore 19S, il quale si attacca ad entrambe le parti del core

del 20S, è composto da 6 subunità ATPasi e da 2 subunità non

ATPasiche, e il coperchio, che contiene 8-10 subunità no-

ATPasiche. Mediante induzione con IFN-gamma, la sintesi delle

3 subunità beta, tutte con i siti attivi, è inclusa. Queste vengono

chiamate immunosubunità, LMP2 MECL1 e LMP7, sono

incorporate nel complesso di nuova sintesi del core del 20S e formano, assieme ad altre subunità, il nuovo

immunoproteasoma.

Si ritiene che le proteine cellulari degradate come parte del normale turnover proteico dipendente dal proteasoma

siano la principale fonte di peptidi antigenici. Poiché la maggior parte delle proteine cellulari sono presenti in

piccole quantità, sono metabolicamente stabili e/o compartimentate, questo solleva la questione di come il

proteasoma possa prendere in carico tali proteine. A questo riguardo è stato osservato che una grande percentuale

di proteine di nuova sintesi sono prodotti difettosi della traduzione e sono rapidamente ubiquitinate e degradate

dai proteasomi. Queste possono quindi essere una fonte importante per la generazione dei peptidi antigenici.

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Una questione dibattuta circa la generazione dei peptidi e la loro presentazione a livello delle MHC I riguarda

l'efficienza del macchinario che produce antigeni: in altre parole, quante molecole proteiche devono essere

elaborate dal proteasoma per produrre un complesso stabile MHC I-peptide? Esperimenti in vitro sembrano

indicare che non più di una molecola degradata su 10 produce peptidi antigenici , suggerendo che il proteasoma

sia meno efficiente di quanto ipotizzato. È stato inoltre valutato che devono essere degradate tra 994 e 3122

molecole proteiche per la formazione di un unico complesso stabile con l’MHC I alla superficie cellulare, quindi

con una efficienza media di 1 su 2000.

INF-gamma induce dei cambiamenti al complesso del proteasoma, basato sulla struttura del proteasoma di lievito.

a) il proteasoma 20S house-keeping è rappresentato come una struttura cilindrica di 4 anelli delle 7 subunità alfa

del proteasoma e da 7 subunità beta del proteasoma; può

formare un complesso con 2 ATPasi. b) negli umani, INF-

gamma induce l’espressione dell’immunoproteasoma. Il

proteasoma 20S house-keeping contiene 3 subunità beta

catalitiche X, Y e Z, mentre l’immunoproteasoma contiene

la subunità IFN-gamma inducibile LMP2. IFN-gamma

induce anche l’espressione dei protesomi regolatori PA28,

il quale forma un eteromultimero composto da PA28alfa e

PA28beta. c) Il proteasoma 20S house-keeping e

l’immunoproteasoma sono asssociati entrambi con il

complesso dell’ATPasi o PA28 o con entrambi.

La citochina immunomodulatoria IFN-g, che è prodotta dai

linfociti T helper 1 attivati, da CD8+, da CTL e da cellule

natural killer (NK), stimola la presentazione dell'antigene

upregolando l’MHC I e le subunità specifiche per l’immunoproteasoma. L’IFN-g altera infatti qualitativamente

l'attività del proteasoma causando l’incorporazione di tre immunosubunità: LMP2 (ib1), LMP7 (ib5) e MECL-1

(ib2) sostituendo le rispettivesubunità costitutive b1, b5 e b2 nel proteasoma 20 S. Esistono quindi due tipi di

proteasomi, quelli costitutivi e gli immunoproteasomi, che si esprimono sotto l'influenza di citochine come l’IFN-

g. Studi in vitro hanno dimostrato che gli immunoproteasomi sono più efficienti nella generazione di diversi

peptidi antigenici virali che non i proteasomi costitutivi. In particolare, è stato dimostrato che topi knock-out per

le subunità LMP2 e LMP7 possiedono un repertorio di CTL alterati, e ciò influenza la specificità della risposta

immunitaria. Questo mette in evidenza l'importanza di LMP2 e LMP7 per la risposta immunitaria cellulare.

Degradazione proteasomale

indipendente da