Biochimica - catena respiratoria

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA (COMPLESSO V)

È il processo che accoppia l'energia liberata nell'ossidazione del NAD e FAD ridotti con la sintesi di ATP a livello della membrana mitocondriale. Questa sintesi è catalizzata da un complesso proteico presente sulla membrana mitocondriale definito complesso V o ATP sintasi mitocondriale o erroneamente ATP asi mitocondriale, che si accentra in prossimità delle tre pompe protoniche (i complessi I, III, IV) della catena respiratoria.

Quando i mitocondri vengono sottoposti a colorazione negativa con acido fosfotungstico, il microscopio elettronico mette in evidenza sulle creste mitocondriali (ripiegamenti della membrana mitocondriale all'interno della matrice) la presenza sul lato matrice di un elevato numero di protuberanze a forma di bottone o corolla di un fiore attaccate alla membrana interna del mitocondrio a mezzo di corti peduncoli o steli, che a loro volta si affondano nello spessore della membrana. A seguito di

Frammentazione dei mitocondri mediante sonicazione, iframmenti della membrana interna si richiudono su stessi a formare delle vescicole nelle quali la membrana risulta rovesciata per cui il lato della membrana, che se intatta era rivolto verso la matrice mitocondriale, ora si trova all'esterno della membrana delle vescicole (inside out), e viceversa; ne consegue che i bottoni sono ora sul lato esterno della vescicola. Le vescicole conservano la capacità di consumare ossigeno in presenza di substrati ossidabili e di sintetizzare ATP. Sotto l'azione di agenti caotropici (urea) o di proteasi (tripsina) i bottoni vengono dissociati dalle vescicole e le due componenti si possono separare mediante centrifugazione frazionata. Le vescicole, private dei bottoni, in presenza di substrati ossidabili continuano a ossidare questi ed a ridurre l'ossigeno ad H2O, ma hanno perso la capacità di sintetizzare ATP, mentre i bottoni in presenza di ATP scindono questo in ADP e Pi.

mettendo in evidenza unaapparente attività ATPasica, da cui il nome dato erroneo dato al complesso. Tuttavia levescicole riacquistano la capacità di sintetizzare ATP per aggiunta dei bottoni che tornano adinserirsi in modo corretto sulle vescicole. Ne consegue che la capacità di sintetizzare ATP èpropria dei bottoni che tuttavia necessitano delle vescicole perché questa loro capacità divengaeffettiva.Le protuberanze vennero chiamate fattore di accoppiamento perché se aggiunte alle vescicolerendevano possibile la sintesi di ATP accoppiata alla capacità delle vescicole di ossidare icofattori ridotti con formazione di H O. La loro purificazione rivelò come esse fossero in realtà2un complesso multiproteico di massa molecolare elevata costituito da oltre dodici cateneproteiche e formato in realtà da due componenti con diversa funzione, l’una formata dal bottoneo corolla definita fattore F e l’altra

fattore F; la prima costituisce della protuberanza la parte1 0che protrude verso la matrice mitocondriale al di fuori della membrana., la seconda la parte chesta immersa nello spessore della membrana interna del mitocondrio strettamente associata allacomponente lipidica della membrana stessa. Le due componenti sono fra di loro connesse amezzo di un giunto detto stelo che emerge dalla membrana. L'insieme di queste diverse particostituisce il complesso F F che pertanto è composto da due fattori F ed F .0 1 1 0  Il fattore F consta di 5 differenti catene peptidiche identificate come δ ε presenti nel1 α β γδε. α βfattore con la seguente stechiometria Le catene e sono unite a formare un dimero in3 3βcui la subunità è responsabile dell'attività ATP sintasica; il fattore contiene tre di questidimeri che si dispongono come gli spicchi di una arancia per un totale di 6 spicchi cheappoggiano sulle

subuntà ed ε, mentre la subunità δ sarebbe in contatto direttamente con ilfattore F del quale riconosce le due subunità b. Il fattore F è definito anche fattore statore in0 0quanto fa da base al fattore F e ne regola la capacità di sintetizzare ATP. Il fattore F è1 0anch’esso formato da almeno tre tipi di catene indicate come a, b, c, delle quali la catena a hamassa molecolare più elevata, ed è presente nel fattore come unità singola, mentre la catena b èpresente in ragione di due subunità e la catena c di almeno 10 subunità. Nell’architettura delcomplesso F F , la subunità a costituisce la base su cui si imperniano le due subunità b e le dieci0 1subunità c; a loro volta le due subunità b si legano con la subunità δ di F , mentre le diverse1εsubunità c sono alternativamente in contatto con il dimero di F tramite lo

stelo ed1impartiscono ad F un movimento rotatorio, capacità che il fattore F acquisisce in funzione del1 0sua affinità per i protoni. Lo stelo è formato da almeno due proteine, la proteina che conferisceall’intero complesso sensibilità alla oligomicina (OSCP) ed il fattore di accoppiamento 6 o F .6L’oligomicina, antibiotico prodotto da un ceppo di streptomiceti, è in grado di legarsi ad unadelle subunità di F ed in questo modo inibisce la capacità di quest’ultimo di trasportare protoni,0essenziale per il manifestarsi dell’attività ATP sintasica di F . Per questo motivo F è definito1 0anche fattore Fo ossia sensibile all’oligomicina. La dicicloesilcarbodiimmide (DCCD), unreagente liposolubile in grado di derivatizzare i gruppi carbossilici, inibisce del pari il passaggiodei protoni attraverso il fattore F andando a bloccare il gruppo carbossilico di un residuo di0acido glutammico presente su

sei delle subunità c del fattore; tale interazione altera la struttura delle subunità impedendo loro di disporsi a formare un canale al cui interno scorrerebbero iprotoni. E’ probabile quindi che i protoni rimbalzino all’interno del canale formato dalla subunità c andando a protonare radicali acidi dei residui aminoacidici di queste, che alternativamente passerebbero dalla forma deprotonata a quella protonata. In questo modo è possibile capire come la membrana interna, di per sé impermeabile al passaggio di protoni, possa in effetti diventare tale e permettere ai protoni di raggiungere la matrice mitocondriale attraverso la sintesi di ATP.

Sperimentalmente si è dimostrato che i 4 complessi della catena respiratoria isolati mediante sonicazione della membrana mitocondriale e come tali inattivi possono essere riattivati se inglobati in membrane artificiali ricche di fosfolipidi (liposomi) arricchite di substrati ossidabili e di NAD.

acquistare la capacità di formare ATP se addizionati con il complesso F F^-. Questa capacità era evidente solo per i complessi I, III, IV, mentre non era tale per il complesso II. Infatti per i complessi I, III, IV il rapporto O₂ consumato a formare H₂O e Pi utilizzato per formare ATP (P/O) era pari ad 1, ad es. per il complesso III per due elettroni trasferiti dal coenzima Q al citocromo, cioè per coppia di equivalenti riducenti, si formava da ADP e Pi una molecola di ATP, mentre per il complesso II il trasferimento di due equivalenti riducenti al coenzima Q non si associava a consumo di Pi. Era questa la dimostrazione sperimentale che la funzione di pompa protonica dei complessi I, III, IV era connessa a sintesi di ATP e allo stesso tempo che solo questi tre complessi fungevano da pompa protonica. È quindi possibile capire perché in mitocondri perfettamente funzionanti l'ossidazione dei substrati che coinvolgono ossidoriduttasi NAD dipendenti.

comporti la sintesi di tre molecole di ATP mentre dai substrati la cui ossidazione dipende da enzimi flavinici di due ATP. Come è possibile raccordare la funzione di pompa protonica con la capacità di sintetizzare ATP, in altre parole raccordare il flusso protonico sul lato citoplasmatico della membrana mitocondriale con la sintesi di ATP sulla faccia della membrana mitocondriale prospiciente la matrice mitocondriale? Fondamentalmente il meccanismo di sintesi di ATP dalla ATP sintasi che trasloca protoni può essere articolato in tre momenti: 1) traslocazione dei protoni da parte di F; 2) formazione del legame di fosfoanidride fra ADP e Pi ad opera del fattore F; 3) accoppiamento della dissipazione del gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale con la sintesi di ATP processi che richiedono la partecipazione dei due fattori F/F. Si è dimostrato che il fattore F è in grado di legare protoni a mezzo delle subunità c, legame che induce

Una modificazione conformazionale del fattore che si trasforma in un canale per i γε (gamma) protoni; questi, tramite il dimero (in particolare di F), possono così giungere a contatto αβ con i dimeri di F inducendoli a modificare la loro forma. È probabile che questi dimeri esistano in almeno tre stati conformazionali, detti L (loose o rilasciato), T (tight o teso) ed O (open o libero) a seconda della capacità di legare ADP e Pi, ed ATP. Nello stato L il dimero lega debolmente ADP e Pi, nella forma T lega ADP e Pi strettamente così da permetterne l'interazione a formare ATP e liberazione di una molecola di acqua; nello stato O perde affinità per ATP con conseguente rilascio di ATP. I tre stati conformazionali sono acquisiti in αβ successione dai tre dimeri per cui al sopraggiungere del flusso protonico un primo dimero si troverà a passare dallo stato O ad L, e quindi allo stato T per ritornare allo stato O; un secondo dimero in

successione seguirà lo stesso destino e così via fino al cessare del flusso protonico. Ne consegue quindi che mentre ATP viene formato dallo su un dimero allo stato T, si dissocia in un dimero vicino che ha acquisito lo stato O, mentre un terzo dimero in stato L lega debolmente su di sé ADP e Pi. Questa successione di trasformazioni sarebbe innescata da un movimento rotatorio di F indotto dal flusso di protoni che attraversano F in modo che il flusso protonico investirà i dimeri uno alla volta ed in successione. L'accoppiamento del gradiente elettrochimico creato dalla pompa protonica, di fatto dai tre complessi I, III, IV della catena respiratoria con la sintesi di ATP ad opera del complesso V trova i suoi presupposti nell'ipotesi chemioosmotica o di Mitchell, una delle teorie formulate per spiegare questo accoppiamento e ad oggi la più confortata dalle evidenze sperimentali. Le altre due teorie, a) formazione di un legame labile ad alto

contenuto energetico,

b) modificaz