Biochimica applicata - cromatografia

Cromatografia

La cromatografia è un processo usato per separare molecole in base a una proprietà chimica come la massa molecolare, la carica o la solubilità. Il processo utilizza una fase stazionaria che può essere un solido, oppure un liquido supportato a un solido, e una fase mobile liquida o gassosa. Il campione, che è spesso una miscela di molecole, viene passato sopra o attraverso la fase stazionaria per mezzo del flusso della fase mobile, chiamata solvente di eluizione o eluente. Molecole con proprietà differenti interagiranno con la fase fissa diversamente, ripartendosi in modo diseguale tra essa e la fase mobile.

Il campione che si lega meglio è meno trascinato dal fluido, mentre quello che si lega meno è trascinato più velocemente. La misura del legame più o meno forte dei campioni con la fase fissa è importante per stabilire quanta fase fissa serve per la separazione. Se, per esempio, ho due sostanze nel campione di cui una si lega molto bene e l'altra molto poco, sarà sufficiente una piccola quantità di fase fissa per separarli.

Interazioni tra fase fissa e campioni

• Adsorbimento: avviene tra liquido e solido. Le sostanze, prima adsorbite sulla colonna, vengono eluite con un solvente opportuno.
• Ripartizione: avviene tra due liquidi non miscibili. Nella maggior parte dei casi (in biologia) si fa una ripartizione acqua legata/acqua libera. L'acqua legata non è altro che un liquido supportato a un solido e non è miscibile con l'acqua libera perché impegnata in interazioni con il supporto solido.
• Filtrazione: è dovuta alla sintesi di polimeri che formano delle maglie nelle cui cavità viene intrappolata (più o meno fortemente) l'acqua che diventa così acqua legata. Se le cavità sono grandi, l'acqua è molta e si ha lo stato di gel. La separazione avviene in base alle dimensioni delle maglie della fase fissa ma anche in base alla polarità.
• Scambio ionico: si basa sull'impiego di scambiatori di anioni che sono resine con cariche positive e scambiatori di cationi che sono resine con cariche negative. In pratica, queste resine possiedono tra le maglie cariche positive o negative che formeranno un legame ionico con i campioni. Tale legame, essendo in ambiente acquoso, è reversibile.
• Affinità: è un metodo cromatografico altamente specifico in quanto sulla resina vengono attaccati dei ligandi specifici per il substrato che si vuole separare. È una tecnica molto costosa.

Principio cromatografico

Se il granulo non fosse stato solido ma liquido, la percentuale sarebbe stata di ripartizione (e non di adsorbimento). La cromatografia si ha solo quando la fase mobile è in grado di staccare il campione del solido o liquido al quale è legato. Noi parliamo di vari tipi di cromatografia in base alla natura chimico-fisica della fase fissa.

Cromatografia su carta

In questo tipo di cromatografia il supporto è un foglio di carta simile alla carta assorbente. Il campione da analizzare è posto in vicinanza di un bordo in più gocce, alternate a quelle di standard prescelti, ed il tutto viene inserito in un recipiente chiuso saturo dei vapori della fase mobile che è a contatto col foglio e lo bagna per percolazione (via discendente) o per capillarità (via ascendente). Il principio in base al quale si compie la separazione dipende dal solvente e dal tipo di supporto impiegato.

In genere è soprattutto una cromatografia di ripartizione, essendo la fase mobile il solvente organico saturo di acqua mentre la fase stazionaria è la fase acquosa che permea la cellulosa. Ogni sostanza sarà caratterizzata dalla posizione che essa raggiunge al termine della corsa cromatografica. Questa posizione è definita dall’Rf, che è il rapporto compreso tra 0 e 1 tra il processo compiuto dalla sostanza e quello compiuto dal fronte del solvente (dritto possibilmente). Dopo la corsa cromatografica, la posizione delle singole sostanze viene evidenziata o osservando a luce ultravioletta o visibile (nel caso di sostanze che assorbono luce o fluorescenti) oppure spruzzando con opportuni reattivi o coloranti.

Cromatografia su strato sottile (TLC)

In questo caso il supporto è uno strato sottile (0,1 – 0,5 mm di spessore) di materiale opportuno (gel di silice, cellulosa, resine sintetiche ecc.) sorretto da una lastra di vetro o materiale plastico (alluminio). Il meccanismo di separazione è identico a quello visto per la cromatografia su carta; le lastrine ricoperte di cellulosa o celite danno una separazione per ripartizione mentre con le lastrine ricoperte di allumina, gel di silice o di poliammide, il meccanismo predominante è l’adsorbimento. Le lastrine ricoperte di resine scambiatrici di ioni danno separazione per scambio ionico, mentre quelle ricoperte di gel danno separazione per gel-filtrazione. Anche qui, per ogni sostanza sarà possibile calcolare un Rf. Altri elementi in comune con la cromatografia su carta sono la cassetta cromatografica e la salita della fase mobile per capillarità.

La lastrina viene infatti collocata nella camera saturata dai vapori della fase mobile: quest’ultima si fa arrivare ad un’altezza prestabilita oltre la quale prevarrebbe l’evaporazione. Una volta avvenuta la separazione, la lastra viene spruzzata sotto la cappa con H₂SO₄ concentrato e poi posta in stufa. Il risultato è che, in seguito alla combustione, dove erano presenti le sostanze organiche si formano macchie nere dovute al carbone. Se, per esempio, ho effettuato queste operazioni con dei lipidi, posso mettere in evidenza le macchie ponendo la lastrina di vetro in una camera cromatografica in cui ho precedentemente posto dello iodio che per sublimazione avrà saturato l’ambiente. I lipidi, avendo acidi grassi insaturi, si coloreranno di giallo per addizione dello iodio ai doppi legami.

Cromatografia bidimensionale

È un particolare tipo di cromatografia su strato sottile in cui, dopo la prima corsa in una direzione, se ne compie un’altra in un solvente diverso, dopo aver ruotato di 90° la lastrina. È possibile separare in questo modo fino a 20 componenti di una miscela.

Cromatografia su colonna

In questo tipo di cromatografia la fase stazionaria (o matrice) consiste di una matrice finemente o grossolanamente granulare compressa in un tubo di vetro, la colonna. La matrice della colonna viene fatta depositare e viene equilibrata con il solvente desiderato. Essa può essere costituita da gel di silice, resine o polisaccaridi. Un polisaccaride comunemente usato è l’agarosio, polimero del galattosio, in commercio con la sigla A (presenta legami crociati). Altro polisaccaride è il destano in cui i legami crociati sono ottenuti con Sephadex o Sepharose. Viene anche usata la cellulosa, ma le più usate sono le resine di poliacrilammide (P) legate da polietilendietilammide o le resine di polistirene legate da polivinilbenzene. Per la cromatografia di esclusione la colonna è stretta e lunga. Il volume della colonna è solitamente da 20 a 50 volte superiore a quello del campione da separare. Si deve far attenzione a che la colonna sia perfettamente dritta e, dopo aver chiuso il rubinetto, vi verserò dell’acqua distillata e degassata per evitare bolle d’aria.