Biochimica applicata - cromatografia

Gli adsorbenti polari e non polari

Gli adsorbenti generalmente impiegati si possono suddividere in polari e non polari. Tra questi ultimi il più usato è il carbone mentre tra quelli polari (più usati) vi sono: albumina, acido salicilico, gel di silice, silicati complessi, talco, vetro, ossido di Magnesio ecc...

Cromatografia liquida in fase inversa

La fase stazionaria è apolare mentre quella mobile è relativamente polare. Si utilizza prevalentemente il tipo a fase legata, in cui dei gruppi alchilsilanici sono chimicamente legati alla silice. Si impiegano quasi sempre gruppi silanici butile (C4), ottile (C8) ed ottodecile (C18).

Come fase mobile si utilizzano di solito acqua o tamponi acquosi, metanolo, acetonitrile, tetraidrofurano o miscele di questi solventi. Il solvente organico viene definito modificatore organico. La fase fissa è inerte ed instaura solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti. La separazione avviene in base alle caratteristiche della fase mobile.

Mano che il solvente acquoso di eluizione viene reso meno polare con acetonitrile o metanolo, i peptici (o altre sostanze) vengono eluiti in ordine di idrofobicità. Gli analiti polari fluiscono per primi e quelli non polari per ultimi. L'eluizione dei composti apolari può richiedere la presenza di un gradiente con proporzioni crescenti di un solvente a bassa polarità quale l'esano.

Per spiegare questo tipo di cromatografia è stata formulata la teoria solvofobica per la quale quando una molecola non polare viene aggiunta ad un solvente polare, la molecola non polare viene circondata da molecole polari del solvente parzialmente ordinate, provocando diminuzione dell'entropia, che è energeticamente sfavorevole. Per minimizzare questa diminuzione di entropia, le molecole non polari tendono ad aggregare diminuendo la superficie esposta su cui le molecole polari possono diventare ordinate. L'aggregazione delle molecole non polari è il

Fenomeno noto come interazione idrofobia. La caratteristica forse più interessante della tecnica in questione è che piccole variazioni nella composizione della fase mobile (aggiunte di Sali, variazioni di pH o della quantità di solvente organico) influenzano grandemente la separazione. Inoltre, questa tecnica è sensibile alle variazioni di temperatura.

Gel-filtrazione

In questo metodo cromatografico la separazione dei vari composti è effettuata sulla base della loro dimensione molecolare o, più esattamente, in base al loro raggio di Stokes. Il raggio di Stokes è il raggio effettivo che una molecola ha se gira rapidamente su se stessa in soluzione. La fase fissa nella filtrazione su gel consiste di piccoli granuli che contengono pori di dimensioni controllate. Lo spazio fra i granuli viene definito spazio vuoto o "vuoti esterni", V0. Lo spazio all'interno dei granuli viene definito Vi. Il volume inerte della fase stazionaria.

vienedefinito Vg. La fase mobile riempie tutto lo spazio fra i granuli (V0) e all'interno dei granuli(Vi). Il campione viene applicato in una banda sottile sopra la colonna e quindi lavato attraversola colonna dalla fase mobile. Le molecole più grandi presenti nel campione che non possonopassare attraverso i pori dei granuli sono escluse e sono ristrette ai vuoti esterni e quindi sonoeluite dalla colonna dopo che attraverso la colonna è passata una quantità di fase mobile ugualea V0. Le molecole che sono molto più piccole dei pori si equilibrano con l'intero volumeliquido ed fluiscono ad un volume uguale a Vt, che è la somma di V0 e Vi. Le molecole chesono abbastanza piccole da passare attraverso una parte dei pori dei granuli fluiranno poi a varivolumi (Ve) a seconda di quanto sono piccole e di quale frazione dei pori è loro accessibile.Queste molecole sono dette parzialmente incluse. Le molecole del campione possono

essere separate in base alle loro dimensioni raccogliendo frazioni man mano che la fase mobile è eluita dalla colonna. Le molecole più grandi fluiranno per prime e le più piccole per ultime. Esiste un coefficiente di partizione noto come kaw:

I polimeri generalmente usati per la gel-filtrazione sono essenzialmente di 3 tipi. Per sostanze con PM < 400.000 si può usare o un gel di destano polimerizzato con epicloridrina (Sephadex) o un gel di poliacrilamide (Biogel P). Per sostanza con PM > 400.000 (e fino a 150.000.000) sono disponibili gel di agarosio (Sepharose, Sagavae, Biogel A). Si possono anche utilizzare resine polistiroliche a pori assai grandi o anche vetro poroso con pori di diametro controllato. Esistono anche polimeri assai piccoli capaci di separare sostanze a basso peso molecolare e anche polimeri che possono formare gel con pori di dimensioni prefissate.

Il processo presenta tuttavia alcuni inconvenienti. Per prima cosa, anche se il campione

viene applicato come una stretta banda sulla colonna, la turbolenza associata al passaggio della fase mobile attraverso la colonna porta ad un allargamento delle bande delle molecole applicate mentre viaggiano attraverso la colonna. Diffusione termica delle molecole ed effetti di attrito dovuti alle pareti di vetro contribuiscono anche essi all'allargamento delle bande delle molecole eluite così che si ha una diluizione delle specie desiderate di circa 3 volte. L'allargamento delle bande si oppone alla purificazione dei singoli componenti del campione, poiché i picchi allargati possono sovrapporsi parzialmente. È quindi consigliabile applicare il campione come una stretta banda sopra la colonna. Linee guida della gel-filtrazione:

1. La colonna deve essere verticale
2. Evitare che si formino bolle d'aria e far depositare la matrice in modo uniforme
3. Il volume della colonna deve essere da 20 a 50 volte quello del campione che viene applicato
4. Mantenere la

1. temperatura costante
2. Impaccare la colonna
3. Applicare il campione come una stretta banda sopra la colonna
4. Raccogliere le frazioni eluite

Cromatografia a scambio ionico

La cromatografia a scambio ionico separa le molecole in base ai loro gruppi carichi, che fanno interagire elettrostaticamente le molecole con cariche opposte sulla matrice della fase stazionare. La fase fissa è rappresentata da resine scambiatrici di ioni che sono polimeri che presentano, in superficie, dei gruppi carichi positivamente o negativamente. Questi polimeri possono essere o esistenti già preformati in natura o essere ottenuti per trattamento chimico di polimeri non ionici (cellulosa e destrano) oppure, infine, essere del tutto sintetici. Lo scheletro, o matrice, delle resine sintetiche può essere fenolico, acrilico, epossi-poliaminico o polistirolico.

Il procedimento è quindi limitato alla purificazione di molecole ionizzabili. La fase stazionaria porta gruppi funzionali ionizzabili.

forti: contengono gruppi amminici, ionizzati, capaci di legare anioni anche a pH relativamente basico; - anioniche deboli: contengono gruppi amminici che ionizzano verso pH 9-10 e hanno perciò spesso solo alcuni gruppi dissociati. Le resine ioniche sono ampiamente utilizzate nella purificazione di molecole cariche come proteine, acidi nucleici e altre biomolecole. Possono essere utilizzate in diverse tecniche di separazione, come la cromatografia a scambio ionico e la cromatografia di affinità. La cromatografia a scambio ionico è una tecnica di separazione basata sulla diversa affinità delle molecole cariche per la fase stazionaria. Le resine ioniche sono impacchettate in colonne e vengono utilizzate per separare le molecole cariche in base alle loro interazioni con i gruppi carichi sulla resina. Durante la cromatografia a scambio ionico, le molecole cariche vengono ritardate o trattenute sulla fase stazionaria a causa delle interazioni elettrostatiche con i controioni immobilizzati sulla resina. Le molecole cariche da purificare competono con questi controioni per il legame ai gruppi carichi sulla fase stazionaria e vengono quindi ritardate in base alla loro carica. Per separare le molecole legate alla resina, è possibile modificare le condizioni di eluizione. Questo può essere fatto aumentando la concentrazione di un controione semplice o modificando il pH. In questo modo, le molecole di interesse vengono rilasciate dalla fase stazionaria e possono essere raccolte per ulteriori analisi o utilizzi. La scelta della resina ionica dipende dalla natura delle molecole da separare e dalle condizioni di separazione desiderate. Le resine cationiche forti sono adatte per la separazione di cationi a pH acido, mentre le resine cationiche deboli sono più adatte per la separazione di cationi a pH neutro o leggermente acido. Allo stesso modo, le resine anioniche forti sono adatte per la separazione di anioni a pH basico, mentre le resine anioniche deboli sono più adatte per la separazione di anioni a pH neutro o leggermente basico. In conclusione, le resine ioniche sono un importante strumento nella purificazione di molecole cariche e nella separazione di composti in base alla loro carica. La scelta della resina appropriata e delle condizioni di separazione è fondamentale per ottenere una separazione efficace e di alta qualità.presenza di controioni alternativi. Ad un dato pH e ad una data concentrazione di controioni le molecole saranno ritardate in modo caratteristico e saranno eluite dalla fase stazionaria più o meno in ordine inverso alla carica. L'eluizione ad una concentrazione fissa di controione si chiama eluizione isocratica. Sebbene tutti i composti carichi vengano alla fine eluiti mediante eluizione isocratica, l'eluizione di molecole che sono altamente ionizzate può richiedere un volume molto grande di tampone di eluizione, specialmente se il controione alternativo nel tampone di eluizione compete poco con la molecola che interessa per il legame ai gruppi carichi immobilizzati. Alterando la fase mobile, la distribuzione all'equilibrio delle molecole legate alla colonna rispetto a quelle nella fase mobile può essere spostata, permettendo l'eluizione selettiva di molecole legate in volumi abbastanza piccoli di tampone di eluizione. L'aumento della

La concentrazione del controione influenzerà le proteine perché i controioni competono con le proteine per gli ioni di carica opposta della fase stazionaria. Per esempio, Na+ e H+ sono controioni usati spesso per la cromatografia a scambio cationico e Cl- e OH- in quella a scambio anionico. In pratica, le proteine sono frazionate permettendo l'assorbimento alla fase stazionaria a una bassa concentrazione di KCl e NaCl e sono quindi eluite dalla fase fissa aumentando la concentrazione di KCl e NaCl nel tampone di eluizione. Se la variazione della concentrazione di controioni varia continuamente durante l'eluizione, si avrà una eluizione a gradiente, mentre se la concentrazione di controioni è alterata a gradini, si tratta di eluizione a gradini.

Per separare gli aminoacidi si usa una resina cationica alla quale essi aderiranno. In seguito si fa scorrere sulla resina un solvente il cui pH varia, ed in funzione del raggiungimento del pI di ciascun aminoacido avremo...

la loro separazione. Usciranno prima gli aminoacidi acidi, poi i neutri ed infinei basici. All’interno di queste 3 categorie gli aminoacidi potranno essere separati in funzione di 2