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viene fatta depositare e viene equilibrata con il solvente desiderato. Essa può essere costituita da

gel di silice, resine o polisaccaridi. Un polisaccaride comunemente usato è l’agarosio, polimero

del galattosio, in commercio con la sigla A (presenta legami crociati). Altro polisaccaride è il

destano in cui i legami crociati sono ottenuti con Sephadex o Sepharose. Viene anche usata la

cellulosa, ma le più usate sono le resine di poliacrilammide (P) legate da polietilendietilammide

o le resine di polistirene legate da polivinilbenzene. Per la cromatografia di esclusione la

colonna è stretta e lunga. Il volume della colonna è solitamente da 20 a 50 volte superiore a

quello del campione da separare. Si deve far attenzione a che la colonna sia perfettamente dritta

e dopo aver chiuso il rubinetto vi verserò dell’acqua distillata e degassata perché altrimenti se la

temperatura salisse si creerebbero delle bolle. Il gas si allontana sotto vuoto oppure con degli

ultrasuoni. Dunque metto la resina nel solvente, agito anche per 1h e lascio sedimentare in modo

da eliminare le particelle più piccole che possono essersi formate per collisione tra le varie

molecole della resina. Quindi verso d’un colpo la resina nella colonna dove sedimenterà in

modo omogeneo poiché ho le particelle di medesime dimensioni. Quindi collego alla colonna un

recipiente contenente la fase mobile; la pressione che agisce sulla colonna è funzione del

dislivello tra questa ed il recipiente contenente il solvente. Pertanto per evitare un impiccamento

“feroce” inizierò ponendo il recipiente in basso e poi, piano piano, lo sposterò in alto in modo

da avere una pressione crescente. A questo punto l’impaccamento sarà equilibrato e potrò

aggiungere una pompa peristaltica con un flusso minore rispetto a quello che si osserva dal

rubinetto.

La pompa peristaltica serve a mantenere una pressione costante ed è costituita da una serie di

rulli che ruotano su loro stessi in relazione a un perno centrale. Questi sono a contatto con il

tubo contenente il fluido che è contemporaneamente passato contro i rulli stessi. Essendo i rulli

contigui il fluido scorrerà in modo pressoché costante lungo il tubo. Per controllare l’analisi si

prendono 2 soluzioni rispettivamente di Blu destano e di Cromato di potassio (giallo) e si

mescolano per ottenere una soluzione verde che verrà pipettata in piccola quantità sulla

superficie della colonna (che deve essere perfettamente piana). Quindi la soluzione verde verrà

assorbita (accendendo la pompa) e allora farò un lavaggio e riempirò d’acqua. Accendo la

pompa e raccolgo. La soluzione verde si separerà: infatti il blu essendo di dimensioni maggiori

scenderà con il solvente, quindi vedrò formarsi una banda blu inferiormente e superiormente

una banda gialla, mentre il verde diminuirà progressivamente. Dall’osservazione di come

scende la banda blu saprò se l’impaccamento è omogeneo, infatti se questa scende in modo

molto irregolare la colonna non va bene per l’analisi. Il volume che corrisponde alla fuoriuscita

del blu è detto volume morto perché non conterrà il campione ma eventualmente sostanze già

presenti nella colonna prima dell’introduzione del campione (corrisponde al fronte del solvente

nella cromatografia su strato sottile). Questo è un valore di riferimento al quale posso rapportare

il volume al quale esce la mia sostanza, rapporto che sarà costante in qualsiasi colonna (anche se

i volumi varieranno). Ciò dipende dalle caratteristiche della sostanza e non dalla concentrazione.

Così posso calibrare la mia colonna.

Il volume utile è pari al rapporto tra Vgiallo/Vblu e rappresenta la potenzialità della colonna di

separare le sostanza. Il rapporto tra il volume di eluizione (volume al quale separo il campione)

e il volume morto è sempre compreso tra 1 e 2. E’ 2 quando la sostanza è completamente

trattenuta, mentre è 1 quando è completamente esclusa.

Cromatografia di ripartizione in fase liquida su supporto solido in colonna

La fase stazionaria è un liquido trattenuto sul supporto solido finemente suddiviso di cui è

riempita la colonna. La separazione avviene per la ripartizione delle varie sostanze tra 2 liquidi

di diversa polarità, uno dei quali aderisce al supporto solido, mentre l’altro fluisce attraverso la

colonna. Di solito la fase fissa è più polare di quella mobile, ma è possibile avere una fase

stazionaria non polare e ciò è sfruttato nella cromatografia in fase inversa.

Cromatografia di adsorbimento in fase liquida su supporto solido in colonna

In questo tipo di cromatografia i supporti sono ritardati da interazioni con la superficie del

supporto solido finemente suddiviso. Si applica la miscela da analizzare sulla colonna e si

fluisce con opportuno solvente, quindi le sostanze dapprima adsorbite sulla colonna vengono

spostate ed eluite dal solvente. Impiegando più solventi con potere eluente crescente si possono

ottenere separatamente i vari composti.

Gli adsorbenti generalmente impiegati si possono suddividere in polari e non polari. Tra questi

ultimi il più usato è il carbone mentre tra quelli polari (più usati) vi sono: albumina, acido

salicilico, gel di silice, silicati complessi, talco, vetro, ossido di Magnesio ecc…

Cromatografia liquida in fase inversa

La fase stazionaria è apolare mentre quella mobile è relativamente polare. Si utilizza

prevalentemente il tipo a fase legata, in cui dei gruppi alchilsilanici sono chimicamente legati

alla silice. Si impiegano quasi sempre gruppi silanici butile (C4), ottile (C8) ed ottodecile (C18).

Come fase mobile si utilizzano di solito acqua o tamponi acquosi, metanolo, acetonitrile,

tetraidrofurano o miscele di questi solventi. Il solvente organico viene definito modificatore

organico. La fase fissa è inerte ed instaura solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti.

La separazione avviene in base alle caratteristiche della fase mobile. Man mano che il solvente

acquoso di eluizione viene reso meno polare con acetonitrile o metanolo, i peptici (o altre

sostanze) vengono eluiti in ordine di idrofobicità. Gli analiti polari fluiscono per primi e quelli

non polari per ultimi. L’eluizione dei composti apolari può richiedere la presenza di un

gradiente con proporzioni crescenti di un solvente a bassa polarità quale l’esano.

Per spiegare questo tipo di cromatografia è stata formulata la teoria solvofobica per la quale

quando una molecola non polare viene aggiunta ad un solvente polare, la molecola non polare

viene circondata da molecole polari del solvente parzialmente ordinate, provocando

diminuizione dell’entropia, che è energeticamente sfavorevole. Per minimizzare questa

diminuizione di entropia, le molecole non polari tendono ad aggregare diminuendo la superficie

esposta su cui le molecole polari possono diventare ordinate. L’aggregazione delle molecole

non polari è il fenomeno noto come interazione idrofobia. La caratteristica forse più interessante

della tecnica in questione è che piccole variazioni nella composizione della fase mobilt

(aggiunte di Sali, variazioni di pH o della quantità di solvente organico) influenzano

grandemente la separazione. Inoltre, questa tecnica è sensibile alle variazioni di temperatura.

Gel-filtrazione

In questo metodo cromatografico la separazione dei vari composti è effettuata sulla base della

loro dimensione molecolare o, più esattamente in base al loro raggio di Stokes. Il raggio di

Stokes è il raggio effettivo che una molecola ha se gira rapidamente su se stessa in soluzione. La

fase fissa nella filtrazione su gel consiste di piccoli granuli che contengono pori di dimensioni

controllate. Lo spazio fra i granuli viene definito spazio vuoto o <<vuoti esterni >, V0. Lo

spazio all’interno dei granuli viene definito Vi. Il volume inerte della fase stazionaria viene

definito Vg. La fase mobile riempie tutto lo spazio fra i granuli (V0) e all’interno dei granuli

(Vi). Il campione viene applicato in una banda sottile sopra la colonna e quindi lavato attraverso

la colonna dalla fase mobile. Le molecole più grandi presenti nel campione che non possono

passare attraverso i pori dei granuli sono escluse e sono ristrette ai vuoti esterni e quindi sono

eluite dalla colonna dopo che attraverso la colonna è passata una quantità di fase mobile uguale

a V0. Le molecole che sono molto più piccole dei pori si equilibrano con l’intero volume

liquido ed fluiscono ad un volume uguale a Vt, che è la somma di V0 e Vi. Le molecole che

sono abbastanza piccole da passare attraverso una parte dei pori dei granuli fluiranno poi a vari

volumi (Ve) a seconda di quanto sono piccole e di quale frazione dei pori è loro accessibile.

Queste molecole sono dette parzialmente incluse. Le molecole del campione possono essere

separate in base alle loro dimensioni raccogliendo frazioni man mano che la fase mobile è eluita

dalla colonna. Le molecole più grandi fluiranno per prime e le più piccole per ultime. Esiste un

coefficiente di partizione noto come kaw:

I polimeri generalmente usati per la gel-filtrazione sono essenzialmente di 3 tipi. Per sostanze

con PM < 400.000 si può usare o un gel di destano polimerizzato con epicloridrina (Sephadex) o

un gel di poliacrilamide (Biogel P). Per sostanza con PM > 400.000 (e fino a 150.000.000) sono

disponibili gel di agarosio (Sepharose, Sagavae, Biogel A). Si possono anche utilizzare resine

polistiroliche a pori assai grandi o anche vetro poroso con pori di diametro controllato. Esistono

anche polimeri assai piccoli capaci di separare sostanze a basso peso molecolare e anche

polimeri che possono formare gel con pori di dimensioni prefissate.

Il processo presenta tuttavia alcuni inconvenienti. Per prima cosa, anche se il campione viene

applicato come una stretta banda sulla colonna, la turbolenza associata al passaggio della fase

mobile attraverso la colonna porta ad un allargamento delle bande delle molecole applicate

mentre viaggiano attraverso la colonna. Diffusione termica delle molecole ed effetti di attrito

dovuti alle pareti di vetro contribuiscono anche essi all’allargamento delle bande delle molecole

eluite così che si ha una diluizione delle specie desiderate di circa 3 volte. L’allargamento delle

bande si oppone alla purificazione dei singoli componenti del campione, poiché i picchi allargati

possono sovrapporsi parzialmente. E’ quindi consigliabile applicare il campione come una

stretta banda sopra la colonna.

Linee guida della gel-filtrazione:

1) La colonna deve essere verticale

2) Evitare che si formino bolle d’aria e far depositare la matrice in modo uniforme

3) Il volume della colonna deve essere da 20 a 50 volte quello del campione che viene

applicato

4) Mantenere la temperatura costante

5) Impaccare la colonna

6) Applicare il campione come una stretta banda sopra la colonna

7) Raccogliere le frazioni eluite

Cromatografia a scambio ionico

La cromatografia a scambio ionico separa le molecole in base ai loro gruppi carichi, che fanno

interagire elettrostaticamente le molecole con cariche opposte sulla matrice della fase stazionare. La

fase fissa è rappresentata da resine scambiatrici di ioni che sono polimeri che presentano, in

superficie, dei gruppi carichi positivamente o negativamente. Questi polimeri possono essere o

esistenti già preformati in natura o essere ottenuti per trattamento chimico di polimeri non ionici

(cellulosa e destrano) oppure, infine, essere del tutto sintetici. Lo scheletro, o matrice, delle resine

sintetiche può essere fenolico, acrilico, epossi-poliaminico o polistirolico.

Il procedimento è quindi limitato alla purificazione di molecole ionizzabili. La fase stazionaria porta

gruppi funzionali ionizzabili accoppiati ad una matrice inerte. Per i principi di elettroneutralità,

queste cariche immobilizzate sono associate elettrostaticamente con controioni scambiabili dalla

soluzione. Le molecole cariche da purificare competono con questi controioni per il legame ai

gruppi carichi sulla fase stazionaria e sono perciò ritardate in base alla loro carica.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher valeria0186 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica applicata e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Caruso Donatella.

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