Biochimica applicata

La proteomica

La proteomica è la scienza che studia il proteoma (rappresentazione quali e quantitativa dell'espressione proteica di una cellula o di un fluido corporeo in condizioni definite).

Codice genetico

È un'informazione contenuta nel DNA. La maggior parte delle proteine, per esempio, perché regolano quasi tutta la vita della cellula, vengono prodotte (sintetizzate) a partire dai geni, che sono "pezzi" di DNA e che contengono quell'informazione. Il codice genetico, ricorda, è universale, perché tutte le cellule di qualsiasi essere vivente contengono l'informazione sotto forma di DNA, ed è anche degenerato. L'informazione infatti è contenuta nel DNA sotto forma di triplette (cioè tre basi azotate) e degenerato si riferisce al fatto che più triplette (con basi leggermente diverse) possono sintetizzare per lo stesso amminoacido. Questo protegge il codice da eventuali errori.

Proteoma

L'insieme di tutte le proteine espresse in un organismo nello stesso momento allo stesso tempo, incluse tutte le isoforme e le modificazioni post-traduzionali.

Genoma

Insieme dei geni di un organismo, parte dei quali codificanti per le sue proteine (esoni), parte dei quali regolativi della trascrizione (introni). Alla trascrizione segue la traduzione, processo con il quale vengono espresse le proteine. Mentre il genoma è costante per una data cellula, identico per tutte le cellule di un organismo e non cambia molto all'interno di ogni specie, il proteoma è molto dinamico nel tempo e in risposta a fattori esterni e differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari. A differenza della genomica che studia il corredo genico di un organismo, la proteomica si occupa dell'intero corredo proteico contenuto in una cellula in un dato momento.

Perché il numero delle proteine supera quello dei geni?

Perché bisogna includere le modificazioni post-traduzionali (acetilazione, metilazione, fosforilazione, splicing) e tutte le isoforme. La quantità effettiva di proteine in una cellula è determinata dai parametri più variati ed è estremamente sensibile ai cambiamenti di questi parametri (uso di farmaci, temperatura, stress, situazione metabolica).

Caratteristiche principali della proteomica

• Identifica tutte le proteine prodotte in una determinata cellula, tessuto o organismo.
• Definisce come le proteine si organizzino in reti simili a circuiti elettrici (come si associano le proteine).
• Descrive l'esatta struttura tridimensionale delle proteine per individuare possibili siti di interazione con i farmaci.

Proteomica strutturale e funzionale

Definizione quali e quantitativa studia la funzione biologica, i meccanismi cellulari e l'interazione in determinate condizioni proteina/proteina in vitro.

Studio della proteina

Per poter essere studiate in dettaglio, le molecole biologiche e i vari complessi sub-cellulari devono essere isolati dal materiale di partenza.

Perché purificare una proteina?

Per studi strutturali, preparare anticorpi, studi funzionali, analisi di frequenza.

1. Scelta del tessuto

Screening dei vari tessuti per trovare quello dove la proteina è più presente (es: fegato-mitocondri, epatociti-lisosomi, timo-nuclei).

2. Omogenato

Distruzione delle cellule con formazione di estratti grezzi. La distruzione della cellula può avvenire per:

• Shock osmotico (la cellula si gonfia e scoppia)
• Lisi per congelamento e scongelamento
• Solubilizzazione chimica (rottura della cellula con detergenti o acetone)
• French press (cellule spinte da una pompa all'interno di un tubicino in acciaio, la pressione è tale che scoppiano)
• Sonizzatore (genera onde che vanno a impattare con la membrana causandone la rottura)
• Mortaio
• Frullatori, metodi più energici
• Agitatore di Mickle

Si forma dunque l'omogenato, ovvero una soluzione salina tamponata con fonti di carbonio (per mantenere inalterati gli organelli), Mg²⁺ (per preservare l'integrità del nucleo e dei mitocondri), agenti chelanti (EDTA per rimuovere ioni metallici che possono reagire con gruppi tiolici), sodio azide (agente batteriostatico) e inibitori specifici di membrana.

3. Estrazione proteica

La strategia di purificazione è diversa a seconda del tipo di proteina, della sua localizzazione cellulare, del tipo di studi che si vuole condurre e quindi anche della quantità di proteina necessaria.

• Proteine extracellulari: presenti nel siero o liberate nel brodo di coltura, possono essere rimosse dal materiale insolubile semplicemente per centrifugazione o filtrazione.
• Proteine intracellulari: shock osmotico, lisi, congelamento e scongelamento.
• Proteine di membrana intrinseche: uso di un detergente non ionico (SDS) o un solvente organico (butanolo). Se l'obiettivo è studiare la funzionalità della proteina, questo detergente non va impiegato perché una proteina denaturata non ha struttura e non ha funzione; se invece vogliamo avere cognizione della sequenza amminoacidica della proteina, possiamo tranquillamente utilizzare l'SDS.
• Proteine di membrana estrinseche: uso di una forza ionica per indebolire il legame (NaCl).
• Proteine presenti in organelli: mediante centrifugazione analitica o preparativa. La prima si occupa dello studio macromolecolare delle particelle pure (determinazione della purezza, massa molecolare, forma del campione), quella preparativa permette la separazione, la purificazione e isola le cellule intere, le membrane plasmatiche, i ribosomi, gli acidi nucleici, virus e lipoproteine. In questo ultimo caso la separazione è più semplice perché uso poche proteine. La tecnica prevede che l'omogenato sia sottoposto a centrifugazione a 1000 g per 10 minuti, ottenendo un precipitato (contiene i nuclei) e un sovranatante dove vi sono gli organelli più le altre componenti. Se non ho bisogno dei nuclei, sottopongo il sovranatante a 1300 g ottenendo così un precipitato contenente i mitocondri e un sovranatante. Se non ho bisogno dei mitocondri, sottopongo il sovranatante ad una nuova centrifugazione ottenendo così un precipitato contenente la frazione lisosomiale.

Omogenato 1000 g x 10 min: Precipitato (nuclei) + Sovranatante

1300 g: Precipitato + Sovranatante

Centrifugazione frazione lisosomiale (punto di partenza per l'estrazione).

4. Purificazione o separazione della proteina

Ottenuto l'estratto grezzo, bisogna mettere in atto una serie di operazioni che allontanano le proteine che non interessano e arricchiscono man mano la proteina che volete ottenere allo stato puro. I criteri per la scelta del metodo di purificazione sono:

• Risoluzione e/o capacità
• Proprietà fisiche del composto
• Stabilità del composto
• Visione della letteratura scientifica in merito
• Attrezzatura ed esperienza
• Costi procedura

Le tecniche sono:

• Precipitazione frazionata (con la precipitazione allontano acidi nucleici e ribosomi)
• Elettroforesi
• Cromatografia

Precipitazione per denaturazione: porto il campione ad una temperatura simile al punto critico, le proteine diventano meno stabili e formano un precipitato.

Precipitazione con solventi: aggiungo acetone o butanolo o etanolo che va a mascherare i gruppi idrofobici, diventano dominanti quelli ionici, compare la carica e le interazioni elettrostatiche, diminuisce la solubilità e formo il precipitato.

Precipitazione al punto isoelettrico:

• Scegli un pH diverso da quello della proteina di interesse, precipitano tutte le altre proteine.
• Scegli un pH uguale a quello della proteina di interesse, precipita solo la mia proteina.

Solubilità: I sali svolgono un importante ruolo di miglioramento della solubilità fino ad una certa concentrazione e danno origine ad un fenomeno definito salting in; le molecole di sale formano ponti idrogeno con residui polari delle proteine, stabilizzano la proteina e si oppongono alla formazione dell'aggregato. A concentrazioni più elevate i sali danno il cosiddetto salting out, un fenomeno che comporta una diminuzione della solubilità. In generale si usa solfato di ammonio. Fa precipitare le proteine senza denaturarle. L'aggiunta di sale rimuove le molecole d'acqua sulla superficie della proteina, permettendone l'aggregazione e quindi la precipitazione. Le proteine molto idrofobiche precipitano a bassa concentrazione, quelle meno idrofobiche precipitano ad alta concentrazione di sale. Tutti i passaggi sono generalmente condotti a 4°C.

Cromatografia

Il successo della cromatografia sta nell'interazione delle sostanze tra fase stazionaria e fase mobile. Esistono diversi tipi di cromatografia:

• Cromatografia su colonna: FS attaccata alla matrice, FM passa o per gravità o con pompe.
• Cromatografia su strato sottile: FS attaccata alla matrice, FM passa per capillarità.
• Cromatografia a scambio ionico: sfrutta la carica di una proteina. Ho una matrice a cui è legata una FS carica +. Se aggiungo un sale (NaCl) alla FS, la FS legherà Cl- (controione). Quando passa una proteina -, il controione si stacca e le proteine - si legano alla FS. Le proteine + passano. In questo caso la FS è di solito un campione con N quaternario. Nello scambio cationico invece la FS è negativa. Ottima per grandi volumi e grandi quantità di proteine, tuttavia le proteine hanno lo stesso pH e le stesse concentrazioni dei sali presenti in colonna e ciò può essere scomodo perché occorre passare in dialisi per togliere i sali.
• Cromatografia a esclusione molecolare: la FS è rappresentata dalle dimensioni di un poro. Quando carico una miscela di proteine, se la proteina è più grande del poro passa lungo la colonna, se è più piccola attraversa la superficie della colonna. Questo consente di eluire le proteine in base al peso molecolare (eluiscono prima le proteine ad alto PM). Con questa cromatografia si può: purificare, determinare la massa molecolare relativa, analisi proteina-ligando, allontanare le proteine dal sale.
• Cromatografia di affinità: tecnica di elezione per purificare anticorpi, sfrutta il legame specifico tra le molecole affini biologicamente; utilizzata per grandi volumi. Si basa sull'interazione tra la sostanza e il ligando che deve avere affinità di legame specifica e reversibile e gruppi modificabili per legarsi alla matrice (cellulosa, agarosio, destrano).