Biochimica applicata

Il dosaggio enzimatico

Quindi si basa sulla misura della velocità di consumo del S o della velocità di formazione del P.

1. Vengono eseguiti a 30°C o 37°C
2. In presenza di un tampone
3. Considerando che ogni enzima ha un suo pH ottimale
4. A [S] saturanti che conoscendo la Km di traducono in ca>10 volte alla Km normale. Perché? Quando arrivo nella zona della curva dell'ordine 0 la velocità è dipendente solo dalla [E]

Il calcolo del dosaggio enzimatico viene effettuato o in MANIERA CONTINUA o in MANIERA DISCONTINUA (segnando la quantità di prodotto formato e la quantità di substrato consumato ad intervalli di tempo).

Metodi:

1. Spettrofotometro
2. Spettrofluorimetro
3. Luminometro
4. Radioisotopi
5. Immunochimica

Spettrofotometria: Quando substrato e prodotto assorbono alla stessa lunghezza d'onda non si riesce a discriminare la formazione del substrato o del prodotto. Reazione accoppiata -> utilizzano il prodotto

dell'enzima di interesse e lo convertono in un altro prodotto per apprezzare l'assorbimento.

dosaggio MALTASI: la maltasi scinde il maltosio in 2 molecole di glucosio, ma sia maltosio che glucosio assorbono alla stessa lunghezza d'onda. allora si fa lavorare un analogo sintetico che agisce con la maltasi, si produce PARANITROFENOLO che colora la soluzione di giallo.

dosaggio ISOCITRATO LIASI: ciclo del glicosilato —> forma succinato e gliossilato che assorbono alla stessa lunghezza d'onda. aggiungo dinitrofenilidrazina che reagisce con il gliossilato, forma idrazone che da colorazione arancio.

Dosaggio ESOCINASI: G + ATP —> G6P + ADP. non riuscendo a distinguere l'assorbimento di G/G6P e ATP/ADP che assorbono alla stessa lunghezza d'onda, aggiungo G6PDH che ha bisogno di NADP+ che diventa NADPH e aumenta l'assorbimento.

dosaggio PFK: F6P —> FRUTTOSIO 1-6 BIFOSFATO. il lavoro della PFK lo vedo se aggiungo aldolasi che scinde in

GAP3P e DAHP. poiché non vedo assorbimento aggiungo la GAP3P DEIDROGENASI nad dipendente. la GAP diventa 1.3bifosfoglicerolo, si forma NADH che assorbe a 340nm.

SPETTROFLUORIMETRIA

Il suo principio è la FLUORESCENZA mediante lampade che producono raggi luminosi che colpiscono la mia soluzione, dove alcune molecole si eccitano ed emettono fluorescenza. Fluorescenza e fosforescenza sono emissioni di energia radiante da parte di una molecola, ione o atomo, che ha raggiunto lo stato eccitato, in seguito a fotoeccitazione per assorbimento. L'emissione fluorescente è più veloce ed ha luogo subito dopo il raggiungimento dello stato eccitato. L'emissione fosforescente è più lenta e dura più a lungo. NADH e NADPH sono fluorescenti. con questo metodo posso dosare:

• vitamine B
• NADH
• colesterolo
• NADPH
• pesticidi

SVANTAGGI: influenza la temperatura, influenza la polarità del solvente, smorzamento (se ci sono molte)

molecole queste possono produrre un rumore di fondo che altera il raggio fluorescente; si agisce quindi con poche molecole per avere poche collisioni).

DOVE LA USIAMO?

A. dosaggi enzimatici e studi di cinetica

B. struttura delle proteine

C. struttura delle membrane

D. studio di modificazioni conformazionali, denaturazioni ecc

APPARECCHIATURA:

sorgente di eccitazione (lampada di xenon), reticolo o filtro, cella porta campione, reticolo o filtro, rivelatore (fotomoltiplicatore).

La spettrofluorimetria è molto impiegata poiché molte proteine presentano una FLUORESCENZA intrinseca legata alla presenza di residui aromatici come TIROSINA, FENILALANINA, TRIPTOFANO e a quella di molecole non proteiche come COENZIMI.

Si utilizza anche per composti non fluorescenti, si utilizzano in questo caso delle sonde fluorescenti: sostanze che si legano alla sostanza da analizzare e emettono fotoni. ex: BROMURO DI ETIDIO (rivelatore DNA).

LUMINOMETRIA

APPLICAZIONI:

determinazione di substrati

determinazione di

1. VANTAGGI:
• sensibilità elevata
• apparecchiature a basso costo
• reagenti semplici
2. A. LUCIFERASI DA LUCCIOLA:

La miscela di reazione sarà posta in una cuvetta, in uno strumento chiamato LUMINOMETRO; che è fatto da una cuvetta, 12 fotomoltiplicatore, amplificatore, registratore. La reazione avverrà all'interno della cuvetta e si trasformerà la miscela in prodotto. La luce passerà nel fotomoltiplicatore (qui viene trasformata in elettroni che vengono amplificati e raccolti all'anodo, si misura la corrente risultante che passerà all'amplificatore fino ad arrivare al registratore. La quantità di luce sarà pari alla quantità di ATP iniziale.

LUCIFERINA + ATO + O2 -> OSSILUCIFERASI + AMP + PPi + LUCE

3. B. LUCIFERASI BATTERICA:

Si tratta di riboflavina - fosfato ridotta che si ossida in associazione ad aldeidi a lunga catena ed ossigeno. La reazione associata ad una ossidoreduttasi

consente il dosaggio di NADH o reazioni NADH dipendenti.

MALATO + NAD —> OSSALACETATO + NADH + H

NADH + FMN —> FMNH2 + NAD

FMNH2 + RCHO + O2 —> FMN + RCOOH + H2O

LUCERADIOATTIVITA’RADIOISOTOPO —> atomo formato da un nucleo + le orbite

ISOTOPO —> atomo instabile il cui rapporto protoni/neutroni non è rispettato e che quindi decadono emettendo particelle.

La radioattività, o decadimento radioattivo, è un insieme di processi con cui i nuclei atomici instabili o radioattivi decadono in un certo lasso di tempo in nuclei o energia inferiore. Abbiamo diversi tipi di decadimento:

DECADIMENTO CON EMISSIONE DI NEGATRONI: un neutrone diventa protone per emissione di una particella B- (negatrone). Quindi il rapporto N/Z diminuisce.

DECADIMENTO CON EMISSIONE DI POSITRONI: un protone si trasforma in neutrone per emissione di una particella B+ (positrone) che è molto instabile, generando 2 raggi gamma a 180° tra loro.

rapporto N/Z aumenta.

DECADIMENTO PER EMISSIONE DI PARTICELLE ALFA: gli isotopi all'aumentare del numero atomico decadono emettendo particelle alfa.

DECADIMENTO PER EMISSIONE DI RAGGI GAMMA: sono radiazioni elettromagnetiche con lambda inferiore ai raggi x. I raggi gamma derivano da una trasformazione del nucleo ed è accompagnata da emissione di particelle alfa e beta.

DECADIMENTO PER CATTURA ELETTRONICA: un protone cattura un elettrone orbitale trasformandosi in neutrone con sviluppo di energia elettromagnetica (neutrone + raggi x).

IL DECADIMENTO È UN PROCESSO SPONTANEO A VELOCITÀ DEFINITA E CARATTERISTICA DI CIASCUN RADIOISOTOPO. LA VELOCITÀ SI ESPRIME IN TEMPO DI DIMEZZAMENTO, OVVERO IL TEMPO CHE OCCORRE PER RIDURRE DELLA META' LA QUANTITÀ DI UN RADIOISOTOPO.

I metodi di rivelazione e quantificazione della radioattività si basano su: IONIZZAZIONE SU UN GAS, ECCITAZIONE DI SOLIDI O SOLUZIONE CAPACITÀ DI IMPRESSIONARE UNA EMULSIONE

FOTOGRAFICA.– ECCITAZIONE DI SOLIDI O SOLUZIONI: L’eccitazione di opportuni composti di particelle radioattive, comporta l’emissione di radiazioni luminose quando gli e-dello scintillatore ritornano allo stato fondamentale. La luce viene rivelata da un FOTOMOLTIPLICATORE che converte il segnale luminoso in un segnale elettrico in misura direttamente proporzionale all’energia dell’evento radioattivo originale. STRUMENTI-CONTATORI A SCINTILLAZIONE SOLIDA: il campione è adiacente ad un cristallo di materiale fluorescente. Il cristallo si trova vicino al fotomoltiplicatore che è a sua volta collegato ad un alimentatore e ad un contatore di impulsi. Si usa per conteggio di isotopi. CONTATORI A SCINTILLAZIONE LIQUIDA: B emettitori provocano eccitazione (noionizzazione) di un liquido che contiene un solvente (toluene) che si eccita, il solvente a sua volta interagisce con uno scintillatore primario che si eccita coinvolgendo lo scintillatore secondario che

si eccita. la luce poi viene convertita da un fotomoltiplicatorein correnti di e- e diventa differenza di potenziale.

TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

CLONE: famiglia di cellule aventi identico patrimonio genetico derivate asessualmenteda una singola cellula mediante successive divisioni.

LINFOCITA B: cellula che, per esposizione a uno specifico Ag è stimolata a dividersi edifferenziarsi per formare un clone di plasmacellule sintetizzanti una Ig capace dicombinarsi specificamente con quell’EPITOPO

EPITOPO: piccolo sito sull’Ag a cui una molecola di Ig complementare può legarsicostituito d 1-6 residui monosacccaridici o amminoacidici presenti sulla superficiedell’Ag.

ANTISIERO POLICLONALE: un antisiero, possibilmente contro un singolo antigene,contenente anticorpi diversi per quell’antigene derivanti da diversi cloni di plasmacellule.

ANTISIERO MONOCLONALE: è un immunoglobulina derivata da un singolo clone eperciò omogenea.

Le tecniche immunochimiche

utilizzando gli anticorpi coinvolti nell'immunità umorale. Quando gli anticorpi impattano con la molecola formando l'antigene (organismo esterno o composto chimico), questo provoca l'attivazione di LINFOCITI che si dividono e si differenziano producendo PLASMACELLULE capaci di produrre ANTICORPI, più precisamente immunoglobuline -> IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. L'antigene diviene suscettibile all'anticorpo andando a formare il complesso ANTIGENE - ANTICORPO dando come risposta: PRECIPITAZIONE NEUTRALIZZAZIONE MORTE PER FAGOCITOSI. Le tecniche immunochimiche utilizzano soprattutto IgG, hanno un'estrema specificità e alla ricerca di questa estrema specificità si trova l'utilizzo di ANTICORPI MONOCLONALI. Abbinando antigeni e Ig radioattive ottengo oltre alla specificità anche la sensibilità. Si forma il complesso Ag - Ig che è poco solubile e facilmente precipitabile. L'immunologia studia.

l'impiego della reazione Ag - Ig:

- SCOPO ANALITICO: in un liquido introduco l'anticorpo andando a vedere se precipita l'antigene o la proteine legati all'IG.

- SCOPO PREPARATIVO: recupero del complesso Ag - Ig e dopo di che provo a dissociare il complesso per ottenere la proteina di interesse.

PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI

1. si purifica la proteina di interesse
2. si inietta l'Ag nel coniglio
3. prelevando sangue dopo 10 gg si nota che il siero contiene i primi Ig specifici. La risposta massimale contro l'Ag iniettato si ottiene dopo 16 - 20 gg -> SIEROPOLICLONALE
4. dopo 20 gg l'effetto stimolante dell'Ag diminuisce. Se al coniglio faccio una seconda iniezione dello stesso Ag, nel giro di 3 gg (non più 10) si produce