Appunti di Biochimica

A

¿

¿

pH= pK +log ¿

Quindi in ogni tappa di ionizzazione il pK corrisponde al valore di pH nel punto di mezzo del corrispondente

flesso nella curva di titolazione.

N.B.: in soluzione acquosa gli amminoacidi non assumono mai forma neutra, sono sempre

anioni, zwitterioni o cationi.

Il pH a cui una molecola presenta una carica neutra è detto punto isoelettrico, pI, e dall’equazione di

Henderson-Hasselbach si deduce che:

1

pI pK pK

( )

= +

i j

2

Dove K e K sono le due costanti di dissociazione delle due tappe di ionizzazione nella formazione della

i j

specie neutra.

N.B.:

• Per gli amminoacidi monoamminici e monocarbossilici K =K e K =K

i 1 j 2.

• Per l’acido aspartico e l’acido glutammico K =K e K =K

i 1 j R.

• Per arginina, istidina e lisina K =K e K =K .

i R j 2

I pK dei gruppi ionizzabili dipendono anche dai gruppi vicini

I pK dei gruppi ionizzabili possono venir influenzati dai gruppi vicini e ne vengono influenzati di più se essi

3+ -

sono vicini. Ad esempio un gruppo NH può venir reso più acido da un gruppo COO vicino (come nella

- 3+

lisina), ma se si è a pH neutro e il COO diventa COOH anche l’NH diventa meno acido.

In un polipeptide i residui amminoacidici non hanno gruppi ionizzabili liberi e i pK dei singoli gruppi funzionali

sono diversi da quelli dei gruppi ionizzabili liberi, anche perché in struttura 3D gruppi carbossilici e gruppi

amminici potrebbero avvicinarsi influenzandosi a vicenda.

I. Alcune note sulla nomenclatura

I 20 amminoacidi standard possono avere due tipi di abbreviazioni del loro nome:

• A 3 lettere, solitamente le prime 3 lettere del nome dell’amminoacido.

N.B.: Asx può indicare sia Asp sia Asn, Glx può indicare sia Glu sia Gln; questo

perché si trasformano facilmente l’uno nell’altro ed è difficile distinguerli nella

pratica senza particolari precauzioni.

• A una lettera, di solito la prima del nome dell’amminoacido, usata per confrontare le sequenze delle

proteine.

Il nome del residuo amminoacidico nella proteina si ottiene sostituendo il suffisso -ina dell’amminoacido

con -ile. La catena polipeptidica si legge dall’N-terminale al C-terminale e il residuo amminoacidico al C-

terminale prende il nome dell’amminoacido libero.

N.B.: il Cα è quello su cui avviene il legame peptidico e da esso si contano i carboni

numerandoli con le lettere dell’alfabeto greco, così le catene laterali si possono

indicare con la lettera dell’alfabeto greco corrispondente. Per esempio la lisina ha un

gruppo amminico in ε. E’ poco usata come convenzione.

Stereochimica

Polarimetro = strumento in cui viene inviato un fascio di luce polarizzata (che vibra in un solo piano) ad una

soluzione, che può ruotare il piano della luce polarizzata (e si dice che è otticamente attiva) oppure no (non

otticamente attiva). Un analizzatore consente di vedere se e di quanto il piano della luce polarizzata è stato

ruotato.

Le molecole otticamente attive sono asimmetriche (non sovrapponibili alla propria immagine speculare).

Questa è una situazione tipica dei carboni tetraedrici con legati quattro atomi diversi. Questi carboni sono

detti centri asimmetrici o chiralici. Tutti gli amminoacidi sono otticamente attivi perché possiedono un centro

chiralico sul Cα, tranne la glicina che ha due atomi di H sul Cα.

I centri chiralici danno origine agli enantiomeri

Enantiomeri = molecole che sono immagini speculari non sovrapponibili l’una dell’altra.

Gli enantiomeri non si possono distinguere in base alle proprietà chimiche e fisiche, ma solo con metodi che

analizzino l’asimmetria, come con un polarimetro. Enantiomeri di una stessa sostanza ruotano il piano della

luce polarizzata della stessa quantità, ma in direzioni opposte; tuttavia non c’è una relazione tra la struttura

di una molecola e angolo e direzione della rotazione del piano della luce polarizzata, quindi non è possibile

stabilire da questo la configurazione assoluta (-> disposizione spaziale) dei gruppi chimici intorno ad un

centro chiralico.

La convenzione di Fischer descrive la configurazione dei centri asimmetrici

La convenzione di Fischer è usata per descrivere la forma delle molecole e prevede un confronto della

molecola da descrivere con la gliceraldeide. Infatti Fischer indicò come L-gliceraldeide quella che ruotava la

luce polarizzata verso sinistra (e che poi si è scoperto essere davvero levogira) e D-gliceraldeide quella che

la ruotava a destra (e che si è scoperto poi essere destrogira. Confrontando le proiezioni di Fischer della

gliceraldeide con quella del centro chirale della molecola in analisi si può stabilire se questa è L- o D-, a

prescindere che poi sia effettivamente destrogira o levogira.

Proiezioni di Fischer = configurazioni molecolari rappresentate graficamente coi legami verticali sotto il piano

del foglio e quelli orizzontali sopra il piano del foglio.

(inserisci immagini per spiegare)

Si dice che la L-gliceraldeide e gli L-α-amminoacidi hanno la stessa configurazione relativa. Tutti gli

amminoacidi che compongono le proteine sono L-α-amminoacidi, cioè hanno tutti la stessa configurazione

relativa intorno al Cα. Dato che il sistema di Fischer presenta delle imprecisioni su molecole con molti centri

chiralici spesso si usa il sistema RS.

La vita si basa sulle molecole chiraliche

La sintesi normale di una molecola chiralica porta ad avere una miscela racemica, cioè una miscela

contenente quantità uguali dei due enantiomeri. Per avere invece un prodotto con una voluta asimmetria

bisogna usare un processo chiralico, come avviene in natura, dove si ottengono sempre stereoisomeri puri.

Infatti, poiché la maggior parte delle molecole biologiche sono chiraliche, un composto con una certa forma

enantiomerica reagirà solo con molecole di una data forma enantiomerica di un altro composto.

Le miscele racemiche sono molto importanti nella sintesi di farmaci perché un enantiometro potrebbe essere

inattivo o addirittura dannoso, mentre l’altro utile.

Proteine: struttura primaria (Cap.4)

Diversità dei polipeptidi

Struttura primaria = sequenza amminoacidica della sua o delle sue catene polipeptidiche.

Le proteine sono sintetizzate in vivo mediante condensazione l’uno dopo l’altro dei vari amminoacidi in un

ordine specificato dalla sequenza nucleotidica di un gene.

Le possibilità teoriche di un polipeptide sono illimitate

n

Per una proteina con un numero n di residui esistono 20 sequenze possibili. Chiaramente l’evoluzione ha

selezionato solo alcune delle sequenze possibili, ma il numero di peptidi diversi esistenti è comunque di

dimensioni astronomiche.

Le proteine reali hanno limiti alla dimensione e alla composizione

Si considerano proteine i peptidi di almeno 40 amminoacidi, ma la maggior parte delle proteine contiene tra i

100 e i 1000 residui. Le proteine multisubunità contengono più di una catena polipeptidica. Le catene

coinvolte possono essere o non essere identiche e sono dette subunità. Ci sono dei limiti per le proteine:

• Legati alla dimensione:

o I 40 residui sono il limite minimo che dà alla proteina la capacità di ripiegarsi in forma stabile

ed avere una data funzione.

o I polipeptidi molto grandi possono avvicinarsi al limite di efficienza del macchinario per

trascrizione e traduzione: più è lungo il trascritto/tradotto e più è alta la frequenza di

comparsa degli errori.

• Legati alla composizione: non tutti gli amminoacidi hanno le stesse funzioni e le stesse proprietà

chimiche e fisiche, quindi non tutti possono sussistere con la stessa frequenza.

In realtà però le caratteristiche di una proteina dipendono più dalla frequenza amminoacidica che dalla

composizione in sé.

Molte proteine non contengono solo residui amminoacidici, ma possono formare complessi con ioni metallici

2+ 2+

come Zn e Ca , legare covalentemente o non covalentemente piccole molecole organiche o subire

modificazioni postraduzionali mediante l’attacco di gruppi chimici, come i carboidrati.

Determinazione della sequenza delle proteine

Perché determinare la sequenza delle proteine?

• Conoscere la sequenza amminoacidica è indispensabile per determinare la sua struttura in 3D e per

capire il suo meccanismo d’azione.

• Confrontando sequenze di proteine analoghe/omologhe si possono capire i legami evolutivi tra le

specie e il funzionamento di proteine simili.

• Molte malattie ereditarie sono causate da mutazioni nella sequenza di una proteina.

Per essere sequenziata la proteina deve essere rotta frammenti abbastanza piccoli da essere sequenziati

uno per volta, poi si mettono i peptidi nell’ordine corretto attraverso la parziale sovrapposizione delle loro

sequenze.

A. Tappe preliminari

Nelle proteine composte da più di una subunità è importante identificarle e isolarle prima della

determinazione della sequenza.

L’analisi dei gruppi terminali rivela il numero di subunità della proteina

Ogni catena polipeptidica (se non è chimicamente bloccata) ha un residuo C-terminale ed uno N-terminale;

la loro identificazione porta all’identificazione di quante subunità ci siano e se sono uguali o diverse tra loro.

Esopeptidasi = enzimi che degradano i residui C-terminali (carbossipeptidasi) o N-terminali

(amminopeptidasi) di una proteina.

Il residuo N-terminale può essere identificato con diversi metodi:

• Usando il cloruro di dansile, un composto fluorescente che lega le ammine primarie, quindi può

legarsi all’N-terminale formando un peptide dansilato, che viene quindi liberato per idrolisi acida,

separato con una cromatografia e identificato per la sua fluorescenza gialla.

• Il residuo N-terminale può essere degradato col primo ciclo della degradazione di Edman o con

un’amminopeptidasi.

Il C-terminale invece può essere separato tramite una carbossipeptidasi e quindi identificato.

N.B.: le carbossipeptidasi sono molto specifiche per il loro bersaglio e ne esistono due

tipi: • Le carbossipeptidasi di tipo A: liberano tutti i residui C-terminali tranne Arg,

Lys e residui legati alla Pro.

• Le carbossipeptidasi di tipo B: liberano i residui C-terminali Arg, Lys, purché

non preceduti da residui di Pro.

Bisogna rompere i ponti disolfuro intracatena o intercatena

I ponti disolfuro, rendendo la catena non lineare, possono risultare non accessibili ad enzimi e reagenti

chimici usati per il sequenziamento, dunque vanno eliminati. Ci sono due metodi:

• Il metodo ossidativo con acido per formico: ossida tutti i residui di cisteina, anc