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RIP: Immunoprecipitazione di RNA mediante uso di anticorpi
Siamo in condizioni native, quindi abbiamo sia legami diretti sia indiretti e posso misurare la quantità e il tipo di RNA che viene legato dalla proteina tramite realtime-PCR oppure RIP-seq quando non ho idea di che tipo di RNA possa essere legato.
I passaggi sono simili a quelli dell'immunoprecipitazione: lisi cellulare, utilizzo di un anticorpo che lega la proteina di interesse nell'estratto, uso di beads coniugate alle proteine A e G che fanno binding con l'anticorpo e poi vari lavaggi ed eluizione del complesso RNA-proteina da cui poi estraggo l'RNA per poterlo misurare.
PAR-CLIP
La RIP-seq è ancora utilizzata come screening iniziale ma superata a livello di precisione da PAR-CLIP, una metodica che sfrutta un crosslinking tramite radiazione UV a 365nm. Si trattano le cellule (che sono state transfettate con la proteina RBP generica con dei tag) con 4sU, un nucleotide di uridina modificato che quando viene incorporato nel DNA...
nascente che presenterà una conversione delle T in C. Questo ci permetterà poi di andarle a identificare maggiormente nel dettaglio nelle fasi successive ->> tutto prima dell'immunoprecipitazione -> quindi: aggiungo 4sU che viene incorporato nell'rna nascente e vado a crosslinkare, dopodiché si tratta con rnasi.
Le pareti rosse sono le regioni di interazione tra la proteina gialla e l'rna. L'rnasi digerisce l'eccesso di rna ma non dove questo interagisce con la proteina perché è la porzione stabile perché crosslinkata. Quindi l'rna troverà un blocco stericoper cui non riesce a degradare l'rna di interazione.
Il frammento di interazione è molto piccolo quindi la library che andremo a preparare sarà fatta di smallrna cioè quelli più piccoli di 200pb. La differenza con la RIP è che in questo caso non possiamo fare RTqPCR proprio perché i frammenti sono molto piccoli e l'unica
Possibilità per identificare i frammenti di RNA è il sequenziamento. Sono molto piccoli e l'unica possibilità per identificare i frammenti di RNA è il sequenziamento. Dopo il trattamento con RNAsi e prima della produzione della library faccio immunoprecipitazione, controllo su gel e taglio la banda in corrispondenza della mia proteina. Facendo un'immunoprecipitazione teoricamente ho la mia proteina e al massimo le proteine che formano il complesso. Ma se io taglio la banda su gel che si tratta di gel in condizioni denaturanti o riducenti, la banda che io taglio è solo la banda della proteina che sto studiando e di conseguenza l'RNA che isoliamo è solamente quello specificamente legato alla proteina. Quindi permette di riconoscere solo i legami diretti perché mi permette di rendere più stabili i legami tramite crosslinking.
Esempio: Studio di Erna, cioè RNA non codificanti che sono trascritti dalle regioni regolatorie degli...
enhancer che vengono legati dalla proteina CBP, unaproteina che acetila l'istone H3 sulla lisina27
Per caratterizzare gli rna viene fatta metodica GROseq che selezionasolo rna nascente (simile all'rnaseq) poi con PAR-CLIP avro' un piccoarancione che indica la regione specifica che va ad interagire con laproteina CBP. Gli rna vengono prodotti e agiscono a livello enhancer ->quindi a livello della regione degli enhancer caratterizzata da un'elevataconcentrazione di K27 acetilato ho anche il picco della proteina CBP,quindi posso proprio dire che l'rna prodotto a questo livello va a legarequesto tipo di enhancer.
Tecniche basate sull'analisi rna per scoprire le proteine:
Si basano sulla tecnica pull-down: abbiamo bisogno di probe antisenso distanziate ma che coprono tuttalunghezza mrna -> ricordiamo che l'rna e' single strand quindi disegno queste sonde sullo strand liberoantisenso (non avro' primer farward e reverse)
Disegno probe modificati
Che hanno biotina che appaiano tutta la regione mRNA, altrimenti se ho fortuna di avere un trascritto non lunghissimo posso trascriverlo in vitro biotinilandolo a un'estremità. Sfrutto biotina per poter usare una resina con streptavidina e formare ponte per eluire le RNA binding protein. La tecnica che utilizza questo è la ChiRP, l'altra è la RAP. La differenza è che cambia la lunghezza delle probe (20 e 120).
ChiRP: Si devono crosslinkare le cellule, il crosslinking può essere anche fatto con formaldeide non solo UV, poi si prepara lisato cellulare, ciclo sonicazione per frammentare genomico che ci disturba, aggiunta probe biotinilate che vanno ad anilare al nostro RNA di interesse. Le probe legheranno le beads con streptavidina grazie al legame forte e eluiranno le RNA binding protein ed eventualmente, se vogliamo, il DNA genomico perché un RNA può legare sia proteine ma anche DNA.
Esempio: TERC è un long-non coding RNA e vediamo un profilo di GW del genoma.
(genome white) che viene detto ChiRPseq quando vado apreparare la library per capire le regioni possibili di interazione trarna e dna, in cui ogni picco e' una regione sul genoma in cui questolink (terc) interagisce. Quindi si comporta un po' come un fattoretrascrizionale e possiamo ricercare la consensus dell'rna sul genoma
Si puo' fare RT-qpcr per analisi di quanto rna lega la proteina
Quando partiamo da rna c'e' uno step aggiuntivo di conversione dell'rna a cdna, e possiamo poiamplificare con taq-polimerasi.
La RTqpcr puo' darci una quantificazione assoluta o relativa
La differenza tra approccio tra quantitativo relativo e assoluto: facciamo ipotesi di voler calcolare laquantificazione relativa tra due condizioni. Relativa cioe' non misuro in modo preciso ma comparo laquantita' di rna tra due condizioni. La condizione A campione sano e B tumorale, calcoliamo il deltaCt:
Se deltaCt<1 B maggiormente espresso, A down-regolato
Per semplicita' si trasforma tutto in log10: se log0 non ho cambiamenti ecc
Non sappiamo quanto rna abbiamo nella cell -> quantificazione assoluta: il nostro campione deve cadere all'interno di una curva standard, di cui noi siamo sicuri sia certa la concentrazione di ciascun punto, cioe' usiamo un trascritto di riferimento.
Una curva e' costituita da piu' punti e si fanno in media 5-6 punti di curva standard.
Noi abbiamo estratto rna da 1.000.000 di cell e risospeso in acqua.
L'rna totale deriva da immunoprecipitazione che e' stata fatta su un milione di cell e vogliamo quantificare quanto rna del gene che e' di nostro interesse (es cmyc) e' presente in questo rna tot che deriva dal nostro saggio.
Quindi per prima cosa dobbiamo
ottenere il cdna e poi usare primer specifici che mi targetteranno una porzione di c-myc, amplificazione con RT. Il riferimento ha concentrazione nota di 1ng su microlitro. Questo mi permette di preparare la curva standard che è costituita da più tubi preparati con concentrazione seriale (pescando sempre 1 microlitro dal precedente). Ottengo una serie di diluizioni a concentrazioni note. Quando svolgo RTqpcr avrò sia l'esperimento (tubo con RNA che deriva dall'esperimento di cui voglio conoscere quanto c-myc) che sarà interpolato nella curva che deriva dalla curva standard. A livello pratico metto 1 microlitro dell'RNA che deriva dal mio esperimento e 1 microlitro curva standard nella reazione di RTqpcr. ->> qpcr su campione + campioni di curva standard, per cui ottengo valori di ct. Metto su grafico tutti i punti della curva standard e i ct corrispondenti. Su x concentrazione nota dei nostri campioni curva, y il valore di ct. In questo caso il campione in cui ho 1ng amicrolitro è associato a ct 5, numero ct aumenta col diminuire ammontare dna che ho all'interno. Ottengo una retta (se interpolo i punti) di regressione lineare che non passa per lo 0, ha una pendenza e y = mx + q.
Abbiamo parametro coefficiente di determinazione R che dobbiamo considerare. Se nostra diluizione è stata fatta correttamente: se R si avvicina a 1 la retta di regressione che fitta con i punti è fatta a livello ottimale. Solo se perfetta allora inseriamo valore ct.
Supponiamo che ct 23, andiamo a sfruttare i valori della retta -> usiamo i valori per trovare x (sostituiamo valore y di ct nella equazione retta).
PERÒ
Vogliamo calcolare la concentrazione assoluta di c-myc in condizione normale e tumorale.
Se noi partiamo da 5mila cell sane e 10mila tumorali con CT rispettivamente 25 e 24 -> le cell di partenza sono numericamente diverse! Ovvio che trovo meno cmyc nelle normali ma dobbiamo considerare le cell di partenza! Quindi abbiamo bisogno di un controllo.
interno cioe' un gene espresso inugual modo in tutte le condizioni e su cui io mi basero' per altri calcoli - housekeeping genes (espressiugual modo in tutte le condizioni e su cui io mi basero' per altri calcoli - housekeeping genes (espressitantissimo nelle cell, strutturali come actina) quindi misuriamo anche il suo ct.Housekeeping nelle normali e' 16, mentre 15 nelle tumorali -> passaggio in piu' di normalizzazione del nostro gene su housekeeping, poi compariamo i delta ct condizioni normale e tumorale. In questo modo abbiamo usato normalizzatore interno che permette di ottenere un numero di espressione rna trascritto che stiamo studiando che tenga conto anche del numero di cell-> alla fine la quantita' di myc e' la stessa.
Quindi usiamo DDCtmethod.
Utilizzo tag fluorescenti.
Complicati da visualizzare ma utile per colocalizzazione tra proteine, per interazione tra proteine -> sovrapposizione rosso e verde abbiamo giallo cioe' aree in cui.
colocalizzano.(Sapere come funzionano queste tecniche non tutti i dettagli)
Geni reporter
Utilizzo geni reporter per determinare pattern e tempi di espressione. I geni reporter sono geni che sono assenti nelle cellule che studiamo, esprimono proteine facili da identificare (proteina fluorescente come GFP o RFP) ma che non impattano sulla fisiologia della cell -> monitoriamo il gene di interesse e l'attività di regioni regolatorie in tempi diversi.
Possiamo sfruttare anche la reazione della bioluminescenza che utilizza luciferasi, enzima che agisce sul substrato luciferina per ed emettere segnale di bioluminescenza (tipico di organismi marini) ma che può essere misurata come la fluorescenza.
Cloramfenicolo-acetil-transferasi è in grado di trasferire gruppo acetile sul cloramfenicolo, così il gene fuso al cloramfenicolo ha una migrazione maggiore rispetto al gene normale senza aggiunta acetile.
Beta-galattosidasi: tramite aggiunta substrato artificiale Xgal incolore,
La BGAL lo converte in un prodotto insolubile, formando quindi:
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