Basi Molecolari del Traffico Intracellulare - Corso completo

8 marzo 2016

Basi molecolari del traffico intracellulare

Trafficking: come si muovono le molecole all’interno della cellula. Ne esistono di due tipi:

• Vescicolare
• Attraverso le membrane

La cellula è molto organizzata in modo da avere percorsi non futili, ma funzionali e strumentali.

Sequenza segnale: come si è capito cosa serve alla proteina per indirizzarsi?

Si necessita della sequenza amminoacidica stessa, scoperto negli anni ‘70 (riprenderemo questi concetti la prossima volta, oggi non ha le slide).

Reticolo endoplasmatico: necessario per il ripiegamento e glicosilazione, formazione ponti disulfuro.

Al suo interno c’è un controllo di qualità. Nel RE vi finiscono tutte le proteine della via secretoria. Se non si ripiegano bene, vi sono dei sensori dello stato di ripiegamento. Molte patologie derivano da mutazione, ereditate o meno, che possono danneggiare il ripiegamento di una proteina.

La cellula ha dei meccanismi che bloccano la produzione di proteine dannose, per quanto può.

Esistono risposte cellulari che partono dal RE e che informano la cellula sullo stato delle molecole.

Parleremo dello smistamento nei mitocondri, un po’ diverso dal canonico; vedremo poi i meccanismi di comunicazione con l’esterno (endo esocitosi).

Altro concetto da ricordare è il sorting: smistamento delle proteine sintetizzate. Il sorter è un separatore cellulare che proprio separa popolazioni cellulari diverse. A seconda del proprio destino una molecola andrà incontro ad un certo sorting e trafficking all’interno della cellula.

La funzione di una proteina è sempre correlata alla sua struttura, stessa cosa per la sua localizzazione.

I segnali del sorting sono contenuti nella catena polipeptidica ma in luoghi diversi, a seconda di dove la molecola debba andare. Es. la sequenza segnale si trova all’N-term per essere subito sintetizzata e per poi essere tagliata.

La sequenza segnale per il nucleo può anche essere interna perché la proteina può andare dentro e fuori a piacimento senza essere tagliata.

Patologie di cui parleremo

• Alzheimer
• La malattia prionica
• FENIB, una malattia neurodegenerativa con formazioni di polimeri (forma di demenza senile)
• Misfolding/ritenzione nel RE e fibrosi cistica (viene mutato il recettore delle cellule epiteliali responsabile del passaggio del cloro. È ripiegata male e si hanno problemi a livello respiratorio)
• Autismo e proteine sinaptiche
• La genetica della SLA

10 marzo 2016

(Rivediamo le info dell’altra volta dato che ora abbiamo le slide)

Quali sono gli organelli e corpuscoli della cellula

• Nucleo
• Reticolo endoplasmatico
• Apparato del Golgi e vescicole che si generano dalla zona cis e trans (queste ultime vanno verso la membrana)
  • La vescicola trans può essere ricoperta di clatrina (esistono anche altri rivestimenti nella cellula) e può andare verso la membrana rilasciando molecole verso l’esterno oppure in membrana, o andare verso i lisosomi
• Mitocondri
• Endosomi vari
• Lisosomi
• Perossisomi
• Varie vescicole secretorie e di trasporto

Questi organelli sono tutti integrati, ognuno con una propria localizzazione. Sono immersi nel citoplasma.

La localizzazione di una proteina è fondamentale per l’organizzazione di una cellula. Le cellule nel nostro corpo sono diverse, funzionalmente e difatti hanno un corredo proteico diverso, quindi con localizzazioni anche diverse.

Una proteina ha una certa localizzazione sempre per assumere una determinata funzione. Se non raggiunge il luogo adatto, la cellula avrà una perdita di funzione, equivale ad avere una proteina non funzionante. La regolazione di dove una particolare proteina è localizzata all’interno della cellula può essere altrettanto importante della sua funzione. La localizzazione è quindi tanto importante quanto la funzione.

Sorting: suddivisione, smistamento delle proteine nei vari compartimenti o anche all’interno semplicemente del citoplasma.

Cell sorter (FACS)

Si usa quando ho una popolazione mista di cellule a partire ad esempio da un tessuto.

Es. prendo un cervello dal topo ma voglio solo i neuroni e non gli astrociti. Queste cellule esprimeranno delle proteine specifiche, che posso sfruttare per separarle ed identificarle. Posso usare Ab primari che riconoscono la proteina di interesse, li accoppio ad una sostanza fluo e li passo nel FACS. Separerà le cellule fluo dalle non fluo.

Le cellule passano a goccia a goccia in un capillare, attraversato da un laser, il quale conferisce una carica negativa alle cellule fluo, positiva alle cellule non fluo (gli aggregati proteici non avranno carica). Dopo di ciò, le gocce passano attraverso un campo elettrico generato da due elettrodi e si separeranno a causa delle cariche diverse.

Avrò un collettore di cellule dove le due popolazioni saranno separate e potrò poi piastrare su substrati specifici per la loro crescita.

Il sorter è costoso, si possono in alternativa piastrare delle cellule su substrati selettivi e selezionare positivamente le cellule → es. neuroni crescono meglio su laminina e collagene (elementi della matrice extracellulare) mentre gli astrociti no, e quindi cresceranno solo i neuroni.

I protagonisti di questo corso saranno mRNA e proteine (principalmente).

(Guardiamo la proteina sulla slide) è ripiegata (è avvenuto nel RE), globulare, modificata con un oligosaccaride → M6P conteining oligosaccarid signal, la glicosilazione → è un segno che è passata dal RE, e in particolare questo residuo, avendo il mannosio 6 fosfato, vuol dire che è arrivata nel cis Golgi, dove ha acquisito questo segnale per andare nei lisosomi. Qui ci vanno le proteasi acide che attraversano il RE, il Golgi e qui sono smistate dal trans Golgi network. Questo è un segnale ben regolato nel sorting del Golgi. Nel cis Golgi è già riconosciuta come proteina da portare verso i lisosomi. Sarà una modifica infatti riconosciuta dal trans Golgi network con dei recettori.

L’N-term è la prima cosa sintetizzata, che subito emerge dal ribosoma. Se deve andare nel RE, avrò lì il segnale, che sarà rimosso una volta entrata nel RE.

Essendo molto compatta come proteina potrebbe avere ponti disolfuro, fatti da proteine localizzate nel RE.

La glicosilazione è fondamentale per il ripiegamento delle proteine, per il controllo qualità e non solo.

È usata in lab per ottenere info sulla localizzazione della proteina → zuccheri complessi li ho nel Golgi, zuccheri immaturi li ho nel RE. La N-glicosilazione, quindi legata all’asparagina, comincia nel RE e termina nel Golgi: questo ci permette di dire se una proteina ha passato il RE, o è entrata nel Golgi o ha passato il Golgi, a partire dal tipo di zuccheri che essa lega.

La glicosilazione è la prima cosa che indirizza verso l’ERAD.

Folding delle proteine

Le forme 3D sono varie, e il folding è importante per lo smistamento. In alcuni casi le proteine devono essere foldate per passare tra i compartimenti, in altri casi invece devono invece essere unfolded.

Trafficking

Processo di movimento delle proteine da un compartimento cellulare all’altro (tra cui intendiamo anche il compartimento extracellulare) attraverso vari meccanismi di smistamento, come:

• Meccanismi con “cancelli” (gate), definiti selettivi
• Traslocazione delle proteine
• Trasporto vescicolare

→ Smistamento
→ Ripiegamento
→ Traffico

Spatial differentiation → Proteine diverse residenti in sottodomini, ci permettono di evidenziare le sottozone della cellula tramite immunofluorescenza.

La cellula è organizzata in sottodomini (ne sono stati identificati anche all’interno del nucleo) con diverse strutture, che riflettono la funzione, e la struttura sarà data dal corredo proteico.

Tramite marcatori (proteine espresse differenzialmente nella cellula) che posso rendere fluo, posso identificare vari settori e sottodomini. Es. se faccio fluo per proteine del RE, avrò una fluo perinucleare. Se marco l’actina, avrò una fluo perimembranaria, si trova infatti nella periferia della cellula.

Smistamento

Nella cellula eucariote sono sintetizzate 10000 proteine diverse ogni circa 5 min. Se non acquisissero subito una localizzazione creerebbero malattie. Se avessi anomalie di smistamento, questo può essere alla base di patologie con gain o loss of function.

Cenni storici

La biologia cellulare nasce nel 1945 grazie a due tecniche in particolare:

1. Microscopia elettronica → ci permette di vedere la composizione interna della cellula. Ci descrive la morfologia, ma mi servono tecniche di biochimica per capire le funzioni! Nel 1945 è stata pubblicata la prima fotografia all’elettronico di una cellula.
2. Centrifugazione differenziale → divide per taglia, grandezza e densità. Se ho un omogenato cellulare, avuto dopo una rottura delle cellule, devo riuscire ad avere un estratto. Se lo centrifugo a bassa velocità avrò una prima separazione: avrò un pellet con cellule intere, nuclei e citoscheletro. Nel sopranatante avrò il resto. Lo ricentrifugo a velocità media, e nel secondo pellet avrò mitocondri, lisosomi e perossisoni. Il super lo ricentrifugo e avrò nel pellet i microsomi, vescicole ottenute dall’omogenizzazione del RE: sono stati importanti per capire lo smistamento delle proteine.

Prendo poi il super e ricentrifugo molto velocemente e nel quarto pellet avrò virus se ci sono, ribosomi e grandi macromolecole. Potrò osservare i pellet al microscopio.

All’inizio degli anni ‘40 c’erano altre tecniche utilizzate, soprattutto per la sintesi proteica: dopo la seconda guerra mondiale vi era una grande disponibilità di aa radioattivi, usati per studiare la sintesi proteica in vitro → i primi cell-free systems.

Porter e Palade: ricercatori pionieri della biologia cellulare, nel Rockefeller Institute, che lavoravano con centrifugazione differenziale e microscopia.

Zamenick a Boston lavoravano in cell-free systems con aa radioattivi, riuscirono ad incorporarli in una proteina in vitro.

Altre scoperte importanti furono fatte grazie ai microsomi. Se faccio produrre proteine in sistemi cell-free, ho una proteina di una certa dimensione. Faccio correre un gel di acrilammide, e vedo il suo peso molecolare. Se la stessa proteine è sintetizzata in presenza di microsomi, ho una proteina più corta. Se vado a vedere la proteina in vivo, avrà lo stesso peso di quella coi microsomi!

In presenza di microsomi, di membrane quindi, veniva rimosso qualcosa dalla proteina.

1966: microsomi isolati dal pancreas di un piccione e si è visto che potevano incorporare aa nella proteina. La maggior parte delle proteine sintetizzate rimanevano associate alle membrane, a meno che non si ostacolasse il legame con un detergente, il quale può staccare le proteine dalle membrane.

I microsomi, se io omogenizzassi il RE, li potrei ottenere separandoli su un gradiente di saccarosio (in centrifuga). Posso averne di derivanti da RE liscio o rugoso. Quelli da rugoso saranno più densi e li troverei sul fondo del gradiente.

Quindi fu così scoperto che i mRNA che codificano per proteine secrete sono tradotti a livello di queste membrane.

I microsomi associano proteine che hanno una glicosilazione immatura, diversa dalle proteine non associate al RE, dato che nel RE la glicosilazione è alle fasi iniziali. A seconda della glicosilazione quindi posso dire se associano il microsoma o meno.

Questi ricercatori capiscono che all’N-term ho un fattore X che è responsabile della localizzazione della proteina complessata al ribosoma sulle membrane.

Ci volle altro tempo per capire che questa info era contenuta nella proteina stessa, ed era una sequenza amminoacidica.

Fu studiato sulle catene leggere delle globuline, e fu dimostrato in maniera univoca che questo fattore X, che si trova nelle proteine più lunghe (precursori, dato che poi è rimosso) era un pezzo della proteina stessa (parliamo sempre di proteine secretorie).

The readout experiment: la proteina viene fatta sintetizzare in un sistema cellulare in presenza di microsomi. La proteina nascente avrà il fattore X, che sarà poi rimosso in presenza di microsomi e si formerà la proteina matura. Se decidessi di estrarre il ribosoma (con detergenti) durante la sintesi, e di farlo continuare in assenza di microsomi, avrei un prodotto proteico con un PM più alto, dato che avrà ancora la sequenza segnale: sarà il precursore.

Avrò una popolazione mista di base, proteine precursore e proteine mature. È così che dimostrano che è proprio la presenza del microsoma a fare la differenza.

“The signal hypothesis”. Proteins which are to be exported out of the cell are synthesized by ribosomes, associated with the endoplasmic reticulum. The genetic information from DNA is transferred via messenger RNA (mRNA). This information determines how the amino acids build up the proteins. First, a signal peptide is formed as a part of the protein. With the help of binding proteins, the signal peptide directs the ribosome to a channel in the endoplasmic reticulum. The growing protein chain penetrates the channel, the signal peptide is cleaved, and the completed protein is released into the lumen of the endoplasmic reticulum. The protein is subsequently transported out of the cell.

Le binding protein che fanno legare il ribosoma al traslocatore sul RE sono le SRP (Signal Recognition Particle).

Una volta capita la presenza del segnale intrinseco verso il RE, si è capito che i segnali per altri luoghi dovevano essere sempre sulla sequenza: furono trovati i segnali per il nucleo (NLS), e vari organelli.

1999: Nobel a Blobel per questa scoperta del segnale intrinseco alla proteina per la localizzazione.

Address tag

Gli organelli cellulari sono delimitati da membrane ed hanno funzioni cellulari specializzate. Proteine appena sintetizzate hanno “cartellino con l’indirizzo” per giungere alla loro destinazione finale.

Queste indicazioni si trovano all’interno della sequenza aminoacidica della proteina.

Le sequenza segnale dirige nel giusto compartimento, e non è un prerequisito del RE.

Sono etichette proteiche e si possono trovare sia all’estremità della catena polipeptidica, che all’interno.

Dove avviene la prima selezione per lo smistamento?

La sequenza segnale è all’N-term? Sì o no?

• Se sì, via secretoria. Va nel RE grazie all’associazione dei ribosomi con esso, poi Golgi e poi possono avere varie destinazioni:
  • Secrete
  • Intrinseche delle membrane
  • Lisosomi
  • RE
  • Apparato di Golgi
  • Solubili residenti nel RE o nel Golgi

Il segnale per la via secretoria determina l’associazione dei ribosomi al RE.

• Se no, allora intraprende la via citoplasmatica: non vuol dire rimanere nel citosol (cosa che succede se la proteina non ha segnale) ma rimanere negli organelli. Le destinazioni sono:
  • Nucleo
  • Mitocondri
  • Cloroplasti
  • Perossisomi
  • Citosol

E non passano per il RE!! Lo smistamento c’è per tutti tranne che per le proteine citoplasmatiche che non hanno un segnale ad esempio:

1. Il macchinario traduzionale
2. Enzimi del metabolismo
3. Proteine del citoscheletro
4. Proteine di trasduzione del segnale

La sequenza segnale è necessaria e sufficiente per indirizzare una proteina in uno specifico compartimento. Quindi se prendo una proteina citoplasmatica e ci metto la seq segnale per un compartimento (fondo il cDNA e li inserisco in un plasmide) avrò la localizzazione dettata dal segnale grazie al riconoscimento delle SRP.

Come si è capito come le sequenze segnale funzionano?

Posso fonderle alla GFP e vedere dove va la fluo in presenza di quella sequenza segnale.

GFP: beta barrel con al centro il fluoroforo.

Senza seq segnale avrò GFP in tutto il citosol, con GFP avrò una localizzazione specifica. (Per il Golgi si avrà la stessa sequenza di localizzazione del RE) Le sequenze segnali sono diverse, per aa e localizzazione.

Per l’import nel RE ho uno stretch di aa verdi, idrofobici, seguiti da alcuni aa blu cioè negativi.

Il segnale di ritenzione, KDEL (lys asp glu leu) al C-term (oltre alla sequenza di importazione verso il RE, avranno questa sequenza le proteine necessarie all’interno del RE, affollatissimo di proteine.) Si trova in un’altra zona della proteina. Ab anti KDEL riconosce tutte le proteine proprie del RE.

Import nei mitocondri: ho dei residui fucsia arg arg lys ecc. disperse nella sequenza, e sono positivi. La seq dell’import nei mitocondri assume una struttura 3D necessaria al riconoscimento, dettata da questi aa. Anche nell’import nel nucleo, ho bisogno di aa positivi.

Osserviamo la localizzazione delle sequenze

Nucleo: è all’interno in modo tale da non essere rimossa, dato che la proteina può entrare e uscire a seconda delle necessità.

Mitocondri: viene rimossa, soprattutto per le proteine della matrice interna dei mitocondri. Altra info, se il segnale viene rimosso o meno e che natura ha. “Core”: blocco di...

La seq segnale, una volta che la proteina è nella membrana interna dei mitocondri (dove entra srotolata, non ripiegata) grazie ad un canale di traslocazione, troverà degli chaperon che la aiutano ad entrare, ATP dipendenti, e mentre entra ho enzimi che riconoscono la seq segnale e la tagliano.

PSORT: programma che predice la sequenza segnale, la sua localizzazione in una sequenza amminoacidica. È utile se isolo e purifico una proteina nuova, mai vista. Andrò a cercare i ponti