Basi Molecolari del Traffico Intracellulare - Corso completo

SCREENING DI MOLECOLE CHE ALTERANO LA LOCALIZZAZIONE SUBCELLULARE DI SPECIFICHE PROTEINE

Uno di questi approcci è quello di studiare come si può inibire l'interazione tra p5 e MDM2 per prolungare l'azione di p53 in cellule tumorali.

La mislocalizzazione di proteine in alcuni tumori può essere usata come metodo per testare sostanze per rilocalizzare la proteina.

Es NF-kB

Abbiamo visto tutte modifiche a carico del cargo2. Regolazione a livello dei Recettori L'espressione delle importine alfa e beta a livello dell'NPC è specifica nella sviluppo e nei vari tessuti.

CAS: trasportatore che fa da shuttle all'importina alfa, tracitosol e nucleo. È OE in cellule tumorali: quindi ce ne è molto a livello del citoplasma. Può così interferire nel trasporto dei cargo, troppo rispetto al cargo ce deve entrare nel nucleo.

3. Regolazione a livello dell'NPC Nup: possono essere fosforilate e l'NPC può variare in diametro.

struttura e numero. Ci sono circa 2000 NPC a cellula. Il numero può cambiare a seconda del tipo cellulare e dellosviluppo. Questo è il più alto livello di regolazione che possiamo avere tra citosol e nucleo.

Per studiare in vitro il trasporto nucleare posso usare un detergente: la digitonina. È in grado di permeabilizzare la membrana cellulare ma non la nucleare. Questo permette di studiare la funzione di particolare proteine agendo sul citoplasma della cellula su cui posso agire essendo degradata la membrana.

In assenza di citoplasma, senza importine quindi, e arricchendo il mio terreno con proteine fluo da studiare, attraverso la membrana nucleare ci si aspetta che non passi quasi niente in maniera attiva. Si è invece visto che alcune proteine riuscivano a passare: SMAD2, 3, 4 e ERK. Queste proteine sono una eccezione alla regola, sono indipendenti dalle importine, interagendo direttamente con le nup grazie a degli HEAT-like repeats che sono necessari.

sufficiente nel l'importonucleare. Le molecole che bypassano le importine sono molto importanti nello sviluppo embrionale, e sono senza NLS. Come faccio a capire se una proteina può attraversare o no l'NPC? Tratto cellule con digitonina, impoverisco del citosol, inserisco la mia proteina fusa a GTP e vedo che succede in assenza delle importine. Beta catenine: sfruttano l'ancora citoplasmatica. Complessano normalmente delle altre proteine nel citosol, una volta che arriva un segnale, il complesso sarà fosfo, cambiamento conformazionale, e la beta catenina può entrare nel nucleo. Vediamo dei fattori che riescono a traslocare attraverso l'NPC senza importine e senza Ran GTP, energia. Sono TF, e sono: - proteine della famiglia SMAD, - famiglia ERK - beta catenina Questi TF sono coinvolti in path diversi e rispondono a segnali esterni che arrivano sulla cellula e a cascate di segnale diverse. Una mislocaliz della beta catenina ècoinvolta nel tumore del colon, circa il 90% dei tumori del colon è dovuto ad un accumulo della beta catenina nel nucleo. La mislocalizzazione per molti TF, citoplasma nucleo, è alla base di molti tumori. E' molto interessante per disegnare delle vie terapeutiche. CHI GENERA PERò IL GRADIENTE NUCLEARE? Un ruolo importante lo hanno delle proteine, le proteine ancora, che determinano la formazione di complessi trattenendo le beta cat sia nel citosol che nel nucleo. Il meccanismo attraverso cui queste proteine possono passare è dovuto a dei fattori di ritenzione. Il ran GTP da direzionalità del trasporto, in questo caso la direzionalità è data da fattori che trattengono o rilasciano il cargo. La beta catenina interviene nella segnalazione della via WNT. Questo è un segnale importante nello sviluppo dei tessuti embrionale, ma anche nel difff cellulare. Questa segnalazione alterata è presente in alcuni tumori. Quindi capire come la β

La catenina possa passare dal citoplasma al nucleo e dal nucleo al citoplasma e poter intervenire su questo fenomeno è importante, perché si possono andare a trovare delle molecole che indirizzano la β-catenina da una parte e dall'altra e che possono essere importanti come sostanze per intervenire sulla patologia. E vedremo che ci sono dei trial clinici già in atto, che utilizzano delle molecole che agiscono proprio sulla traslocazione della β-catenina.

Questo gene codifica per una proteina che fa da ancora nel nucleo alla beta cat, quindi si crea un feedback positivo di mantenimento nel nucleo. L'avevamo già visto per p53, con l'attivazione di MDM2, inibitore del p53. Sono comuni questi processi di feedback in meccanismi di regolazione del segnale e nella localizzazione.

ORGANIZZAZIONE DELLA BETA CATENINA

Ha una regione c-term e n-term molto flessibili. La c-term è il dominio di transattivazione, l'nterm può essere fosforilata.

su vari residui da● GSK3beta fosforila su serina e treonina● CK1la parte interna della proteina è organizzata in armadillo repeats. La beta cat tramite la zone centrale, può interagire con vari partner, anche sovrapponendosi dei domini. La β catenina può interagire con la E-caderina e poi con queste proteine AXIN, APC e TCF/LEF1. TCF/ LEF1 è un gene che viene indotto dalla β catenina stessa, il cui prodotto proteico funge da ancora della β catenina nel nucleo. La zona che interagisce con questo fattore di ritenzione nucleare, si sovrappongono con domini che legano la beta cat nel citoplasma. Dal dominio 10 al 12, questa zona è organizzata similmente agli heat repeats (caratteristici della beta importina). In questo modo può interagire, coma la importina, con le nup, senza la presenza dell'importina. Le nup esterne, le proteine fibrillari, a cui lega sono ad esempio la nup358, importante per il passaggio delle molecole.

atraverso il poro. Seve in una fase iniziale per un ancoraggio.Successivamente può legare la nup 62, in prossimità del canale centrale del porp. Poi può legare dellenup del basket nucleare: nup 98 e 153.Si vede così l’avanzamento della beta cat grazie ad interazioni con le nups.In assenza o presenza di WNT (segnale di localizz nucleare), che succede?Se non c’è, quindi il recettore Fzd non è attivito, la beta cat che interagiscecon axin e APC (ancore citoplasmatiche), sarà fosforilato sui residui diserina all’n-term da GSK3beta e CK1. Sarà poi ubiquitinata e degradata.Senza wnt, la beta cat non serve, quindi la cellula si assicura di avere bassilivelli della beta cat. La fosfo espone delle sequenze di morte, riconosciuteda proteine che ubiquitinano.Con wnt la beta cat è libera, perchè le proteine ancora citoplasmatica nonla legano, non è fosfo ed entrerà nel nucleo grazie alle heat

repeats dellaregione centrale, può così attivare la trascrizione insieme a dei cofattor:CBP e BCL9. Proteine su cui si può agire per limitare la resenza della betacat nel nucleo. Lega inoltre TCF/LEF-1.Esprimendo di più partner citoplasmatici o nucleari, si influenza la sua localizzazione.membri della famiglia TCF, lEF1 e BCl9 sono riconosciuti come ancore nucleare della beta cat.L’attivazione aberrante del path di WNT è legata e iperattivazione di geni dipendenti da TCF e sihanno elevati livelli di beta cat.Questo può avvenire per mutazioni sulle ancore citoplasmatiche (destruction complex)LEF-1 è un’ancpra nucleare e la sua espressione alta in colon tumor slidePuò competere direttamente con APC sulla beta cat, datp che sono due ancore diverse: nucleare ecitoplsmatica.La trascrizione del gene LEF-1 è disregolata nell’80% di tumori al colon, dove ho accumulo di betacat e LEF-1.LA via di segnalazione wnt

media la upreg di LEF-1 tab 3Le interazioni àncora-TF sono spessousate come vie per intervenire etrovare degli approcci molecolariterapeutici per ridurre l’aggressivitàdel tumore.- nf kb- foxo- p53- beta cat

Approcci per la beta cat: possiamoagire in diversi modi

1. stabilizzare il complesso che ladegrada, citoplasmatico
2. bloccare l’interazione della beta cat con i residui FG delle nup, dato che sappiamo quale sonole nups coinvolte
3. distruggere i complessi nucleari che si formano, con le ancora nucleari, per la trascrizione digeni a valle

Varie sostanze che sono in trial clinico con vari targets. Agiscono in vari modi nella via wnt,interagendo con legami con BCL9, TCF ecc.

Wnt però è una molecola molto importante, bloccarla nel tumore può avere effetti collaterali nonessendo una via specifica.

FGF: fibrolast growth factor. Agisce sulla cellula con il recettore tirosin chinasico, che attiva cascatedi fosfo a valle, inducendo la cellula

proliferare. Si suggerisce che l'FGF può anche entrare nel citosol direttamente attraverso l'NPC, e avere una seconda via di azione indipendente dai recettori tirosin chinasici. Ha anche una modalità di import particolare: si fa aiutare, oltre che dalle importine e Ran GTP, da LRRC59 > proteina integrale di membrana del reticolo endoplasmatico. Serve come importatore, visto in sua assenza. Per poter entrare dovrà avere, l'FGF, un NLS: ha sia una NLS monopartita che bipartita. Sono entrambe richieste per l'import e sembra strano che serve per l'import una proteina del RE. Fanno vedere che la LRR ha un dominio transmembrana e una piccola coda nel lume del RE (è principalmente citoplasmatica). Questa interazione con FGF1 nel citoplasma forse serve per proteggere FGF1 dalla degradazione una volta che è internalizzato nella cellula. Vedremo che questa proteina serve ad accompagnare l'FGF1 nel trasporto attraverso il complesso

del poro.Le membrane del Re e nucleo sono in comunicazione, e sembra proprio che tramite questa caratteriscita, la LRR può viaggiare dal RE al nucleo.

In questo esperimento vanno a vedere cosa succede a cellule incubate con FGF1 marcato con zolforadioattivo. Prima si fa starvation, poi si incuba, per seguire il percorso della molecola radioattiva.

Hanno poi fatto un frazionamento cellulare con la centrifugazione differenziale.

Nel controllo del silenziamento, ritrovo l'fgf nel citosol e nel nucleo. Se silenzio LRR, l'FGF è solo citoplasmatica.

Trasfettando le cellule con un plasmide: trasfettando con forma dominante negativa di Ran, mutata > il mutante non può idrolizzare il GTP. In presenza di Ran mutato > FGF solo nel citosol.

Inibitori dell'export nucleare e Ran normale > la proteina è anche nel nucleo.