Basi biologiche e genetica umana - manipolazione del DNA

Manipolazione del DNA in genetica umana e medica

Corso di genetica medica

Corsi di laurea in fisioterapia, logopedia, ortottica e assistenza oftalmologica, T.N.P.E.

Facoltà di medicina e chirurgia

Alberto Piazza

Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare

Analisi a bassa risoluzione

• Analisi cromosomica (del cariotipo)
• RFLP (restriction fragment length polymorphisms)
• Southern blotting - DNA
• Northern blotting - RNA
• Western blotting - proteine
• PCR (polymerase chain reaction) – amplificazione del DNA

Analisi ad alta risoluzione

• RFLP
• DNA sequencing - determinazione dei nucleotidi
• PCR – amplificazione del DNA

Sonde (probes) molecolari

Reagenti usati per identificare una sequenza specifica di DNA o RNA in un miscuglio complesso in cui è avvenuta una ibridazione (accoppiamento di basi complementari tra il filamento singolo della sonda ed il filamento singolo bersaglio di DNA o RNA). Le sonde sono comunemente marcate da materiale radioattivo o fluorescente.

• Sonde cDNA - sequenze di DNA complementare a RNA (originariamente prodotte mediante trascrizione inversa di RNA), in grado di identificare sequenze di esoni (espressi)
• Sonde oligonucleotidiche - sequenze di DNA prodotte sinteticamente lunghe 14-25 nucleotidi
• Sonde RNA - RNA marcato in grado di identificare sequenze di DNA o RNA complementari

Analisi cariotipica spettrale

Ibridazione in situ fluorescente (FISH)

24 sonde DNA cromosoma-specifiche, ciascuna marcata con una combinazione differente di 5 fluorocromi.

Ibridazione in situ con:

• Sonde che visualizzano singoli cromosomi
• Sonde che visualizzano tutti i cromosomi
• Sonde che visualizzano specifiche bande

Chromosome bar code

Fishing for genes

Endonucleasi di restrizione

Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici.

• Blunt Ends = estremità prive di estensione
• Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza

Southern blotting (DNA)

Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza per mezzo dell'analisi del Southern blot.

Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa e ibridizzato alla sonda cDNA di un recettore androgenetico. Si osservano 3 frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio.

Conclusione: Il gene per il recettore androgenetico (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l'intensità delle b