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Southern Blotting (DNA)

Diagnosi della sindrome da

androgeno resistenza per mezzo

dell’analisi del Southern blot

Il DNA dal gel di agarosio è stato

trasferito su nitrocellulosa ed

ibridizzato alla sonda cDNA di un

recettore androgenetico. Si osservano

3 frammenti genomici nel DNA di

entrambi i genitori ma non in quello

del figlio.

Conclusione: Il gene per il recettore

androgenetico (AR) è X-linked. La

madre ha solo un gene AR intatto

(l’intensità delle bande è simile a

quella della padre). Il figlio ha ereditato

dalla madre il cromosoma X che ha

una delezione nel gene AR.

Mutazioni puntiformi

Due mutazioni puntiformi che cambiano la sequenza nucleotidica

EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate

Polimorfismi del DNA

polimorfismi del DNA = differenze nella sequenza di DNA

–per definizione due o più alleli ad un locus la cui

frequenza nella popolazione è >1%

Il termine polimorfismo viene esteso ai casi di cambiamento

nella sequenza del DNA: negli RFLP per indicare differenze

nelle lunghezze dei frammenti di restrizione causate da perdita o

guadagno di siti di restrizione nel DNA, nelle delezioni o

inserzioni di DNA, nelle ripetizioni di gruppi nucleotidici nei

microsatelliti e minisatelliti, nelle ripetizioni di trinucleotidi, nelle

mutazioni puntiformi (SNP), etc.

Polimorfismi RFLP e Southern Blot

Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con

la sonda molecolare ( probe)

probe

Diagnosi molecolare

dell’anemia falciforme

la sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb

Analisi di un albero famigliare

mediante RFLP e Southern Blot

in questa famiglia l’allele 2 è concatenato alla malattia

Polimorfismi VNTR e STR

I minisatelliti (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats) sono lunghi

più di 12 basi

I microsatelliti (STR, Short Tandem Repeats) sono lunghi da 2 a 4 basi

Gli alleli A and B al

locus X differiscono per

il numero di ripetizioni

di minisequenze

(tandem repeats)

La sonda (probe) 1 – una sonda single-locus - identifica un

tratto di DNA esclusivo di un locus

La sonda (probe) 2 –una sonda multiple-locus – identifica

tratti di DNA che si ripetono in più loci

Una famiglia tipizzata per un

polimorfismo VNTR

“DNA Fingerprinting”

per il test di paternità

Chi tra F1 e F2 è il padre biologico di C?

Sonde a molti loci con

molti alleli

Dal 5 al 10% dei figli hanno un padre

biologico diverso dal padre presunto

Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in quale

tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la

lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso

correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.

AMPLIFICAZIONE IN

VITRO DEL DNA

“ REAZIONE A CATENA

DELLA POLIMERASI

(PCR)”

PCR: Reazione a catena della polimerasi

Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi

termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un

eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: amplificazione

n.ro cicli n.ro sequenze bersaglio

1 0

3 2 La sequenza bersaglio è la

sequenza di DNA sintetizzata

10 256 tra i due primers

15 8192

20 262.144

25 8.388.608

30 268.435.456

Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter

g

essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 g) allora ~1 of DNA

-12

potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

 

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in

30 cicli.


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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti di Basi biologiche e genetica umana del professor Piazza. Nello specifico è presente una presentazione vertente sui seguenti argomenti: le biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare, le sonde molecolari, l'analisi cariotipica spettrale, l'ibridazione, il fishing e l'endonucleasi di trascrizione.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in fisioterapia
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cecilialll di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Basi biologiche e genetica umana e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Piazza Alberto.

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