Basi biologiche e genetica umana - manipolazione del DNA

IBRIDAZIONE INSITU CON:

A) SONDE CHE VISUALIZZANO SINGOLI CROMOSOMI A

B) SONDE CHE VISUALIZZANO TUTTI I CROMOSOMI B

C) SONDE CHE VISUALIZZANO SPECIFICHE BANDE "CHROMOSOME BARR CODE" B "Fishing for genes"

Endonucleasi di restrizione

Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici

Blunt Ends = estremità prive di estensione

Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza

Southern Blotting (DNA)

Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza per mezzo dell'analisi del Southern blot

Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa e ibridizzato alla sonda cDNA di un recettore androgenetico. Si osservano 3 frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio.

Conclusione: Il gene per il recettore androgenetico (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l'intensità delle bande è simile a quella del padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il cromosoma X che ha una

delezione nel gene AR.

Mutazioni puntiformi

Due mutazioni puntiformi che cambiano la sequenza nucleotidica

EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate

Polimorfismi del DNA

polimorfismi del DNA = differenze nella sequenza di DNA – per definizione due o più alleli ad un locus la cui frequenza nella popolazione è >1%

Il termine polimorfismo viene esteso ai casi di cambiamento nella sequenza del DNA: negli RFLP per indicare differenze nelle lunghezze dei frammenti di restrizione causate da perdita o guadagno di siti di restrizione nel DNA, nelle delezioni o inserzioni di DNA, nelle ripetizioni di gruppi nucleotidici nei microsatelliti e minisatelliti, nelle ripetizioni di trinucleotidi, nelle mutazioni puntiformi (SNP), etc.

Polimorfismi RFLP e Southern Blot

Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con la sonda molecolare (probe)

Diagnosi molecolare dell’anemia falciforme

la sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2

cellulare è espresso un gene, ed anche lalunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spessocorrelati ai livelli di proteina presente nel tessuto.

AMPLIFICAZIONE INVITRO DEL DNA " REAZIONE A CATENADELLA POLIMERASI(PCR)"

PCR: Reazione a catena della polimerasi

Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasitermostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, uneccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: amplificazionen.ro cicli n.ro sequenze bersaglio

1 0

3 2 La sequenza bersaglio è lasequenza di DNA sintetizzata

10 256 tra i due primers

15 8192

20 262.144

25 8.388.608

30 268.435.456

Occorre ~1g di DNA per l'analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da potergessere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 g) allora ~1 of DNA-12potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma

avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.

PCR/RFLP per l'analisi dell'anemia falciforme

PCR/VNTR/STR in genetica forense

Quale delle persone sospette può aver commesso il crimine?

La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.

LA DOPPIA ELICA VISUALIZZATA CON IL MICROSCOPIO A SCANSIONE A FORZA ATOMICA

IMMAGINE AL MICROSCOPIO A FORZA ATOMICA DEL GENE CHE CODIFICA PER LA CONNESSINA UMANA

SEQUENZA DEL GENE DELLA BETA GLOBINA UMANA

Sequenziamento del DNA (1): strutture dei nucleotidi