Appunti Virologia

Virologia (prof. Milena Grossi)

Lezione 1: Introduzione corso

Lezione 2: Fondamenti di virologia

I virus infettano tutti i tipi di organismi viventi, sono dei parassiti intracellulari obbligati. Associamo i virus alla malattia, perché la loro identificazione è stata fatta osservando i sintomi, e cioè i segni di un’infezione virale. Ma ci sono molti virus che convivono con l’ospite senza causare danni, tra questi ci saranno anche molti virus che ancora non conosciamo, proprio perché non danno sintomi non riusciamo a identificarli.

Proprietà dei virus comuni

Sono organismi viventi o non viventi? Possono essere consideranti non viventi perché necessitano di altri organismi per replicarsi, però sono formati da proteine e contengono tutti un genoma che codifica proteine virus-specifiche che possono essere strutturali e funzionali. Il genoma è formato da un acido nucleico, può essere DNA o RNA.

Genericamente si usa il termine virus, e con questo descriviamo sia la particella fisica che tutte le funzioni associate al virus compreso il suo ciclo vitale. Però quando vogliamo riferirci alla particella virale che si trova all’esterno della cellula, cioè nell’ambiente extracellulare ci riferiamo al virione (entità fisica che fa infezione). Nel momento in cui il virione prende contatto e riconosce in modo specifico la cellula che va a infettare il termine virione non è più adatto.

Le dimensioni dei genomi dei virus sono piccole, e sono variabili fino a cento volte. Esistono virus con un genoma di circa 3 mila nucleotidi fino a genomi di 1 Mb come nei virus giganti. La maggior parte dei virus animali va dai 3 mila ai 250kb. Più il genoma è grande più il virus è complesso; perché un genoma grande significa che deve codificare molte proteine strutturali che gli permettono poi di formare delle particelle virali (virioni) più complesse.

Ci sono virioni formati solo da acido nucleico e proteine. Le proteine formano un involucro che contiene l’acido nucleico o che lo avvolgono. O virioni formati da acido nucleico, proteine e rivestimento pericapsidico di natura lipidica. Le proteine più esterne del virione sono quelle interessate con l’interazione con la cellula ospite. La specificità dell’interazione tra recettore sulla cellula ospite e anti-recettore sul virione determina il tropismo del virione, e cioè le cellule che andrà ad infettare.

I virus possono replicarsi solo se infettano cellule vive, perché devono sfruttare al minimo il macchinario di sintesi delle proteine (macchinario traduzionale) e l’energia metabolica prodotta dalla cellula. Lo scopo dell’infezione virale non è quello di portare alla morte della cellula, è solo una causa secondaria dell’infezione. Il virus per poter produrre nuova progenie virale riprogramma a vari livelli la fisiologia cellulare, ma lo fa come effetto collaterale, perché in realtà la morte dell’ospite dà danno anche al virus. Perché se il virus dà danni troppo velocemente, la cellula muore e quindi anche il ciclo virale verrebbe bloccato.

Si vede un virione con envelope e uno senza. I virioni senza envelope vengono detti anche virus nudi. L’envelope lo derivano dalla membrana cellulare. All’interno dell’envelope sono presenti proteine spesso di un solo tipo, o proteine diverse con funzioni diverse durante la fase di attacco ed entrata del virione; sono proteine codificate dal virus stesso. Nel virus nudo gli anti-recettori sono proteine che formano il capside; mentre in quelli con envelope sono le proteine inserite nel doppio strato fosfolipidico dell’envelope.

Classificazione dei virus

Negli ultimi anni si è ampliata la classificazione dei virus. A farlo si ha la ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses). I criteri di classificazione sono:

• Natura dell’acido nucleico
• Simmetria del rivestimento proteico (capside); ci sono la simmetria elicoidale o icosahedrica; ci sono poi anche capsidi complessi
• Presenza o assenza di envelope
• Configurazione del genoma

Fino al 2018 vi erano 5 gradi di classificazione dei virus, il grado più alto che comprende molti virus era l’ordine, poi famiglie, sottofamiglie, genere, specie. Con le nuove conoscenze si è dovuta rivedere la tassonomia. L’approccio per studiare i virus è l’identificazione e sequenziamento del genoma. Per lo studio si spera di avere sempre sistema cellulare in vitro che permettono lo sviluppo e replicazione di un virus, che ci permettono di vedere il ciclo vitale del virus.

Si ha avuto l’esigenza di aumentare la complessità tassonomica del virus, dopo l’avvento del sequenziamento in larga scala. Dal 2019 si ha una nuova classificazione in più gruppi. Si riconoscono delle classi, del phylum e un regno. Il genoma è formato da virus con un genoma a RNA che sono molto più numerosi di quelli a DNA.

Ebola virus, ad esempio, è una famiglia che comprende 5-6 specie, la famiglia è filoviride. Mono-nega-virales: ha all’interno ci sono virus con RNA, polarità negativa, singolo filamento; è un genoma detto mono-partito. Nidovirales: virus a RNA con singolo filamento positivo, il genoma è mono partito. Tra questi abbiamo i SARS-CoV. Sono più complessi come ciclo vitale. Si chiamano così perché una buona parte dei prodotti genici virali sono tradotti da messaggeri sub-genomici che sono l’uno dentro l’altro (bisogna vedere la sequenza).

La classificazione non termina con la specie, ma parliamo per i virus con genoma a RNA di quasi-specie. Quasi-specie significa che il genoma dei virioni non è tanto diverso da quello del genoma del virione virale, ma non è nemmeno identico. Tutti i virus con genoma a RNA usano per la replicazione del proprio genoma degli enzimi che sono RNA polimerasi DNA dipendente, o una trascrittasi inversa che sono polimerasi poco fedeli e che quindi inseriscono molti errori, inoltre non hanno attività di correzione delle bozze. Questo comporta che durante un ciclo vitale di moltiplicazione vengono prodotti tanti nuovi genomi virali, tante mutazioni. Per virus in cui la moltiplicazione è molto efficiente, durante un singolo ciclo vitale possono essere introdotte tante mutazioni, tanto che tutti i nucleotidi nei vari genomi prodotti sono mutati. Le mutazioni possono essere deleteree per il virus, ma in molti casi sono funzionali e infettive. Ecco perché si ha così alta variabilità genetica nei virus a RNA.

Spesso le mutazioni possano essere selezionate dalla pressione selettiva, e agenti selettivi come farmacii e la risposta dell’ospite; ecco come poi emergono i vari ceppi resistenti. Le varianti che spesso sentiamo riferite ai virus in realtà sono sbagliate, perché sono ceppi diversi in cui si conosce bene la sequenza e quindi sappiamo quante mutazioni ha accumulate e dove esse sono mappate. Le varianti invece non sono altro che rappresentazioni di varianti nella quasi-specie. Ad esempio, il virus dalla Cina è arrivato all’uomo. Si è parlato di variante alfa, delta, omicron, ma che in realtà sono veri ceppi differenti. Questi ceppi sono stati selezionati per caratteristiche diverse, ad esempio la omicron si diffonde più facilmente, ed è un vantaggio perché permette al virus di rimanere in vita.

All’interno della progenie virale ci saranno altri genomi diversi e diversi anche dal genoma parentale ma che però non hanno nessun vantaggio particolare. La quasi-specie è un insieme di particelle virali in cui ci sono genomi che sono diversi dalla specie di partenza ma non così diverse da essere definite altre specie; questo vale solo per i virus a RNA. Questo vale per il virus dell’epatite C, virus dell’immunodeficienza acquisita, coronavirus. Tutta la progenie quindi è la quasi-specie.

Genoma e struttura dei virus

Un virione senza genoma, non fa nulla. Il genoma può essere:

• DNA
  • Doppio elica
  • Doppia elica incompleta (epatite C)
  • Singolo filamento
• RNA
  • Doppio filamento (reovirus, tra cui i rotavirus che infettano in età pediatrica dando episodi intestinali importanti; si ha un vaccino molto diffuso e ben funzionante)
  • RNA positivo: corrisponde come sequenza a un mRNA
  • RNA negativo: antisenso all’mRNA
  • Singolo filamento a polarità positiva: sono più semplici, quando liberano il genoma viene letto come un mRNA. Abbiamo epatite C, zika virus, polio virus, coronavirus. Sono trasmessi attraverso zanzare. In questi virus si può prendere la sequenza del genoma, transfettarla in una cellula e produrre un virus. Basta il genoma per far partire un ciclo virale, il genoma deve essere solo riconosciuto dal ribosoma.
  • Singolo filamento a polarità negativa: non è riconosciuto come un mRNA, per cui questi virus devono avere una serie di prodotti virali insieme al genoma per far sì che sia reso riconoscibile al macchinario traduzionale delle cellule.

Capside e envelope

- Elicoidale: le proteine che formano il capside e più in particolare la singola subunità proteica (protomero) contatta l’acido nucleico. Formano dell’elice, quindi strutture aperte. L’acido nucleico è del tutto avvolto dalle proteine del capside. Hanno forma filamentosa. Il primo virus identificato era il virus del mosaico del tabacco (ha forma di bastoncello molto rigido; non ha envelope). Tutti i virus animali con capside elicoidale hanno poi anche l’envelope; un esempio è il virus della rabbia che ha forma a proteine dovuto dalla presenza dell’envelope. Tra questi abbiamo virus dell’influenza, virus dell’ebola, del coronavirus.

- Icosaedrica: è una struttura del tutto saldata e chiusa. È un icosaedro formato da 20 facce di triangolo equilateri, e da 12 vertici. Si ha questa configurazione a causa delle interazioni tra i protomeri del capside. Ogni protomero ha interazioni con altri 4 protomeri a formare un’unità base detta pentone. Il numero minimo quindi di protomeri che si possono avere per questa struttura sono 60. All’interno di ogni triangolo equilatero che formano le 20 facce delle strutture, si scrivono altri triangoli equilateri e numeri di triangolazione. La complessità aumenta con il numero di triangolazione. Disposizione di 60n subunità identiche sulla superficie di un icosaedro.

(a) n = 1 e le 60 subunità sono distribuite in modo tale che vi sia una subunità ai vertici di ciascuna delle 20 facce triangolari. Si noti che ogni subunità ha la stessa disposizione dei vicini e quindi tutte le subunità sono correlate in modo equivalente.

(b) n = 4. Ogni faccia triangolare è divisa in 4 facce triangolari equilateri più piccole, ma identiche e una subunità si trova di nuovo in ogni vertice. In totale, ci sono 240 subunità. Si noti che ogni subunità, rappresentata da un cerchio aperto o chiuso, ha la disposizione identica dei vicini: si veda la faccia in cui sono stati disegnati i triangoli 1-4. Tuttavia, poiché alcune subunità sono disposte in pentameri e altre in esameri, i membri di ciascun insieme sono correlati in modo quasiequivalente.

Oltre ai pentoni, si ha un'altra unità morfologica che è l’esone e che è data dall’interazione di 6 protomeri. Lo fanno per aumentare la complessità. Figura di adenovirus al microscopio elettronico. Si vede la struttura icosaedrica. Si possono contare il numero di triangoli scritti in ogni faccia e sono 25. Possono aumentare la complessità senza però aumentare la quantità del genoma; se ne producono tante ma più piccole. A dx si vede l’herpes virus labialis, è un virus rivestito, per cui al microscopio elettronico la figura non dice molto, si è però potuto ricostruire una buona struttura. È stato visto che il numero di triangolazione è 16; cioè all’interno di ogni triangolo equilatero sono scritti altri 16 triangoli minori.

Envelope: Nel caso dei virus rivestiti il capside va sotto il nome di nucleo-capside. Ha natura lipidica, è un doppio stato fosfolipidico; la composizione è identica a quella della membrana cellulare, perché infatti si genera mediante un fenomeno di gemmazione a livello della membrana citoplasmatica o a livello delle membrane interne (Golgi). Nel secondo caso la liberazione del virus avviene tramite di vescicole con esocitosi; nel primo caso invece sono già pronti per andare nell’ambiente esterno. All’interno dello strato fosfolipidico si ha una componente proteica che è codificata dal virus. Ci sono proteine di superficie, come ad esempio la Spike nei coronavirus; queste proteine producono verso l’esterno e sono quelle che fungono da anti-recettori.

La glicoproteina spesso è formata da due glicopeptidi indipendenti che interagiscono tra di loro. Ci sono envelope che hanno un'unica proteina. Ad esempio, in rhabdovirus, si ha la proteina G, che viene usata per costituire vettori virali che hanno un ampio spettro d’ospite (l’uomo e quasi tutte le specie di mammifero, uccelli). La proteina fa da anti-recettore, ha attività fuso genica che serve per l’entrata del virus nella cellula ospite. In altri virus ci sono più proteine diverse nell’envelope e che hanno anche funzioni diverse. Tra questi abbiamo virus complessi come gli herpes virus.

In alcuni virus rivestiti abbiamo poi proteine con altre funzioni. Ad esempio, ci sono proteine che attraversano del tutto l’envelope e che formano dei canali ionici. Queste proteine canale sono caratteristiche del virus dell’influenza. Queste proteine canale permettono al virus di entrare nella cellula in modo particolari, dipendenti dal pH. Con pochissime eccezioni troviamo poi tra l’envelope e il nucleo capside uno spazio che è riempito da una matrice che connette il capside con i lipidi dell’envelope. In genere le glicoproteine che poi vengono sintetizzate nell’envelope vengono prodotte nel RERugoso, vengono pi modificate nel Golgi. Vengono poi trasportate con vescicole a livello della membrana citoplasmatica. A livello della membrana citoplasmatica vengono trasportate a livello elle zattera lipidiche, cioè le zone della membrana povera di proteine cellulari, che quindi verrà riempita con proteine virali. La nuova particella virale interagisce con le glicoproteine virali. Si avrà poi la gemmazione della nuova particella virale rivestita. I virus rivestiti sono più labili nell’ambiente, proprio a causa della natura lipidica del rivestimento, cioè sono più soggetti ad inattivazione. Sono suscettibili ad inattivazione da parte di detersivi, solventi inorganici, alcool. Basta poco per rendere la particella difettiva, per fargli perdere la capacità infettiva. Per un virus nudo serve ad esempio, un pH sotto ai 2.5, quindi molto acidi.

Moltiplicazione virale

Da un virione ad arrivare a 100-10 mila virioni in un ciclo virale, ci si arriva non come una replicazione esponenziale, ma attraverso l’assemblaggio delle componenti virali preformate. Il genoma deve essere liberato nella cellula ospite in forma perfettamente integra e che sia processabile. Da questo tempo in poi il resto del genoma non serve più a nulla; serviva solo per il suo trasporto all’interno di una cellula. Si ha una fase di replicazione ed espressione del genoma virale che porta ad un numero molto elevato di prodotti, che poi si assemblano e formano i nuovi virioni. Ogni individuo che è infettato dal virus dell’influenza può generare tanti nuovi virioni in grado di infettare l’intera popolazione umana. Questo sottolinea l’efficienza della moltiplicazione virale.

Infettare in modo produttivo (ci sono virioni che non sono produttivi a causa delle loro mutazioni) significa poi produrre nuovi virioni che a loro volta sono in grado di infettare in modo produttivo. È importante contare le particelle infettive, questo si fa con il saggio delle placche. L’informazione della conta è importante; è importante definire il numero di queste particelle infettive. Ha un ruolo importante sia nella diffusione di un virus nella popolazione o quando si lavora con vettori virali. Se non si hanno particelle infettive non si dà origine a progenie infettiva e quindi non può infettare altre persone. Ad esempio, in COVID è stato visto che quando i cicli erano superiori a 35 di PCR, sono stati trovati solo nell’8% dei casi delle particelle virali. Non tutte le particelle sono infettive, cioè non sono in grado di fare un intero ciclo e dare origine a nuovi virioni. Questo perché hanno impacchettato del materiale genetico difettivo.

Lezione 3: Conta delle particelle infettive

Come facciamo a contare le particelle infettive? Quelle totali si possono numerare osservandole o con il microscopio elettronico. Quelle infettive si possono numerare, ed è importante farlo quando il virus in questione causa morte o danni gravi (lisi cellulare e morte come nei virus nudi; o come alcuni virus con envelope che non fanno lisi ma causano effetti citotossici a volte letali). Ad esempio, il virus dell’influenza causa effetti citopatici che portano alla morte delle cellule. Anche gli herpes virus destabilizzano molto la cellula infettata tanto che poi alla fine del ciclo litico del virus la cellula ospite muore.

Per contare le particelle infettive si fa il saggio delle placche. Il saggio delle placche si fa su tutti i virus che causano morte; si usa anche con i fagi. Questo saggio è fatto in modo tale che la progenie virale prodotta da una singola cellula infettata non possa andare ad infettare a caso le cellule presenti in una piastra. L’ospite in questi saggi sono batteri o cellule animali. Per evitare un’infezione incontrollata, il monostrato di cellule, una volta aggiunto il virus viene ricoperto da agar (tessu...