Appunti tecnologie farmaceutiche industriali

LIPOSOMI-sistemi

nanoparticellari

Cosa sono i liposomi?

I liposomi sono costituiti da una FASE LAMELLARE, struttura presente anche nelle membrane

cellulari con la differenza però che nelle cellule è rettilinea mentre qui è ripiegata su se stessa a

formare delle palline, i cosiddetti liposomi.

Come possono essere preparati?

Possono essere preparati a partire da diversi tipi di FOSFOLIPIDI.

Si ha sempre la catena di acido grasso, glicerina e il gruppo fosfato

Come sono costituiti, struttura

Nel momento in cui la fase lamellare si ripiega ingloba all’interno acqua, è come una nanoparticelle

ma ingloba più acqua ( ad elevato contenuto di acqua). Nel doppio strato c’è una quantità di acqua

inferiore e questa dipende strettamente dalla temperatura.

Liposomi multistrato

Si possono trovare anche LIPOSOMI MULTISTRATO costituiti da una serie di “doppi strati”

l’uno interno all’altro.

Questo si ha per alcuni fosfolipidi che si utilizzano per preparare i liposomi.

Naturalmente se l’intento è quello di creare sistemi nanoparticellari non conviene costruire questo

tipo di liposomi perché avranno dimensioni molto grandi.

Il diametro del liposoma multistrato è il triplo di un liposoma normale

•

Si potrebbero anche formare dei liposomi molto più grandi “bolle” che è possibile dividere con

una gran quantità di energia meccanica.

Dove va il principio attivo quando lo carico all’interno di queste

strutture? idrofilo lipofilo.

Bisogna vedere se il p.a è o

Se è solubile in acqua ( ammesso che riesca a caricarlo) va a finire nella fase acquosa

• all’interno.

Se è lipofilo finirà nel doppio strato fosfolipidico dove ci sono le catene di acidi grassi

•

Dopodiche il p.a viene rilasciato dal liposoma (una volta somministrato) con una certa gradualità in

base alle caratteristiche di solubilità del p.a in acqua.

Se inseriamo un p.a molto solubile in acqua non possiamo pensare che questo resti all’interno a

lungo, mentre se inseriamo un principio attivo mediamente solubile verrà rilasciato gradualmente.

LIPOSOMI:CLASSIFICAZIONE

I liposomi possono essere molto piccoli, in questi casi vengono detti UNILAMELLARI ovvero

hanno un solo strato (50 nm) o anche leggermente più grandi (1micrometro).

Le dimensioni maggiori però le hanno i MULTILAMELLARI (oltre i micrometri).

A seconda di come si ripiega il doppio strato si possono avere altre strutture più insolite

• dove due o più liposomi sono contenuti all’interno di un liposoma di dimensioni maggiori,

questo succede quando il liposoma è sufficientemente grande MULTIVESCICOLARI

freeze fracture electron microscopy, nella quale i campioni sono velocemente

congelati, fratturati e replicati utilizzando platino e poi trattati con

sodiododecilsolfato in modo da rimuovere il materiale biologico eccetto un sottile

layer di molecole attaccato alla copia.

CRYO-EM tecnica a trasmissione elettronica che viene detta craio perché i campioni

vengono prima congelati e poi analizzati.

Il microscopio elettronico arriva ad ingrandire 300-400 mila volte le strutture quindi

riusciamo ad osservare in maniera dettagliata.

Fosfolipidi più comunemente utilizzati

Possono essere sia fosfolipidi naturali o modificati in laboratorio.

Modificando la testa polare e lasciando invariate le catene di acidi grassi si possono avere delle

caratteristiche molto diverse.

Come variano i fosfolipidi a seconda della temperatura?

I fosfolipidi a seconda della temperatura si dispongono nel doppio strato lipidico in maniera

differente. Il doppio strato può essere più rigido o più morbido.

Se riscaldiamo una fase acquosa contenente liposomi notiamo una TRANSIZIONE

• REVERSIBILE e viene definita TRANSIZIONE GEL-SOL (da una fase ordinata ad una

più disordinata).

Di fatto ad una certa temperatura nel doppio strato si vanno ad inserire più molecole di acqua e il

doppio strato diventa più flessibile, più morbido e meno rigido.

Il processo è ENDOTERMICO.

Questo modifica anche il rilascio di p.a, se ci troviamo ad alte temperature ci troveremo

nella fase morbida dove lo strato di fosfolipidi risulterà distanziato e quindi avrà una

maggiore permeabilità.

Se riabbasso la temperatura torniamo immediatamente alla fase rigida. (Guarda sotto)

TRANSIZIONE DI FASE-1( transizione

principale)

Le membrane costituite da fosfolipidi sono caratterizzate dall’esistenza di una transizione

di fase termoreversibile detta “TRANSIZIONE PRINCIPALE” durante la quale la membrana

passa da una fase ordinata di “GEL” ad una più fluida e disordinata “LIQUIDO-

CRISTALLINA” nella quale le molecole hanno più libertà di movimento.

Questa transizione è un processo ENDOTERMICO e si verifica in un intervallo di temperatura

attorno ad un valore detto main transition temperature o Tm.

Perché si verifica questa transizione?

Il motivo per cui si verifica questa transizione è che nella fase di gel le catene aciliche degli

• acidi grassi si trovano nella loro conformazione più stabile che è quella tutta trans.

In questa conformazione le catene sono al massimo della loro estensione e formano

uno strato molto ordinato

Sottoponendo i lipidi in fase gel ad un graduale aumento della temperatura essi

acquistano energia che consente loro di portarsi dalla conformazione tutta trans a quella

gauche che è più disordinata ed occupa un volume maggiore.

quasi tutti i legami passano alla conformazione

Quando si arriva alla T m

gauche e il doppio strato diventa più disordinato e permeabile.

PRETRANSIZIONI

Ci possono essere anche delle pretransizioni rispetto a quella principale, quando scaldiamo una

fase di fosfolipidi nel doppio strato abbiamo delle modificazioni.

Se osserviamo un tracciato DSC (calorimetria a scansione differenziale) (questo sotto) vediamo

che sull’asse delle y abbiamo il calore assorbito heat flow e sull’asse delle x abbiamo la

temperatura

A che temperatura siamo? (Soprattutto per quanto riguarda la

transizione principale)

Con quella principale siamo sui 20 ed i 50 gradi a seconda del tipo di fosfolipide.

• Per alcuni fosfolipidi quando vengono somministrati a 37 gradi, se danno una

• transizione inferiore ai 37 gradi si troveranno nella conformazione più disordinata e

flessibile

Quelli che hanno una transizione superiore ai 37 gradi resteranno nella conformazione più

• rigida.

Se poi andiamo a formare i liposomi con delle miscele di fosfolipidi, quando andiamo a

• fare un’analisi DSC, ogni fosfolipide avrà la sua transizione ed otterrò nel grafico un

picco allargato che copre un discreto range di temperatura, più che di temperatura di

transizione si parlerà di INTERVALLO

Da cosa dipende la T m?

Tipo di fosfolipide, cioè dalla natura della testa polare

• Dalla lunghezza delle catene aciliche ( la T aumenta con l’aumentare del numero di

• atomi di carbonio) (lunghezza acido grasso)

Dal numero di insaturazioni ( la T diminuisce con l’aumentare del numero di doppi

• legami)

INFLUENZA DI SOSTANZE NON

FOSFOLIPIDICHE SULLA Tm

Nella formazione dei liposomi oltre ai fosfolipidi potrebbero essere utilizzate delle

sostanze lipofile ma comunque ad attività tensioattiva.

Quella più utilizzata è il colesterolo, essa avrà un effetto importante sulla Tm.

Il colesterolo ha una struttura anfipatica che gli permette di inserirsi in un doppio strato lipidico

con l’OH (parte polare) orientata verso la fase acquosa ed il gruppo steroide con la catena

alchilica (parte liofila) adiacente alle catene di acidi grassi dei fosfolipidi.

Il gruppo OH del colesterolo forma legami idrogeno con le teste polari dei fosfolipidi.

EFFETTO DEL COLESTEROLO SUL DOPPIO

STRATO LIPIDICO

Nel momento in cui il colesterolo si va ad intercalare tra le catene degli acidi grassi,

porta rigidità a tutto il doppio strato.

IL GRUPPO STEROIDEO PLANARE DEL COLESTEROLO SI INSERISCE TRA

LE CATENE DEGLI ACIDI GRASSI DEI FOSFOLIPIDI A LIVELLO DEI PRIMI

10 ATOMI DI CARBONIO E ESSENDO RELATIVAMENTE RIGIDO NE RIDUCE

IL MOVIMENTO: D’ALTRA PARTE I RESTANTI ATOMI DI CARBONIO HANNO

Più SPAZIO PER MUOVERSI

Più colesterolo inseriamo nella composizione dei liposomi più il doppio strato

• tenderà alla rigidità. Questo si verifica soprattutto al di sopra della Tm perché

chiaramente il colesterolo non va incontro a nessuna transizione ( mentre i

fosfolipidi si).

A temperatura superiore della Tm l’effetto del colesterolo è un effetto

• condensante, cioè viene ridotta la motilità delle catene aciliche e quindi la

fluidità del doppio strato.

A temperature inferiori alla Tm l’effetto del colesterolo è sempre fluidificante, cioè quello di

• impedire ai fosfolipidi di interagire troppo strettamente tra loro. In questo caso il sistema è

più fluido e permeabile di quanto non sarebbe senza colesterolo. Questo effetto è detto

EFFETTO MODULANTE.

Qual’è il possibile vantaggio?

Bisogna tener presente la stabilità del liposoma e la buona riuscita dello stesso, magari

inserendo il colesterolo si riesce meglio nella realizzazione.

L’effetto dato dalla presenza del colesterolo inoltre potrebbe avere riscontro anche

nel rilascio.

COMPOSIZIONE DEI LIPOSOMI

I liposomi sono costituiti da fosfolipidi naturali o sintetici ma possono contenere altre sostanze

come il colesterolo e polimeri idrofili coniugati ai lipidi.

Si possono preparare liposomi caratterizzati da cariche positive o negative sulla membrana.

I fosfolipidi possono essere neutri o carichi. Questo perché la testa polare a seconda se è

• neutra,positiva o negativa tende ad orientarsi in un tipo di tessuto piuttosto che in un altro.

Se la testa polare presenta delle cariche nette la formazione di liposomi risulterà essere più

• stabile in quanto essi avranno minore tendenza ad aggregarsi tra loro.

L’introduzione di cariche sulla superficie dei liposomi contenenti vari doppi strati

• concentrici porta alla repulsione dei bilayers con aumento dello spazio tra questi e di

conseguenza aumenta il volume del compartimento acquoso.

I liposomi carichi negativamente tendono a non interagire con le proteine plastiche

• generalmente anch’esse cariche negativamente.

-Per conferire carica positiva (+) si possono inserire nei liposomi lipidi come :la

STEARILAMMINA.

-Mentre per ottenere una carica negativa (-): l’acido FOSFATIDICO, LA FOSFATIDILSERINA

PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI

1.METODO DEL FILM o “Thin layer

evaporation”

Il metodo del thin layer evaporation è un metodo per la preparazione dei liposomi.

Serve ad ottenere MLV e SUV

È suddiviso in due fasi:

1. andiamo a dissolvere in un solvente organico i fosfolipidi ( spesso si usa una

miscela di cloroformio-metanolo 2:1 ma la miscela non è sempre questa).

Cambiando il solvente organico qualche differenza la si nota nella formazione

del liposoma

Se dobbiamo dissolvere nel liposoma un p.a liposolubile lo aggiungo adesso nel

solvente organico.

2. La soluzione di fosfolipidi ed eventualmente p.a viene evaporata al rotavapor (sottovuoto

con blando riscaldamento). Si forma un sottile strato di materiale sulle pareti del pallone

(film lipidico)

3. Andiamo ad aggiungere nel pallone la fase acquosa. Se nel liposoma dobbiamo caricare il

principio attivo idrosolubile, lo metto adesso. La dispersione viene agitata fino ad assumere

un aspetto omogeneo.

4. Nel momento in cui aggiungo la fase acquosa i fosfolipidi che stavano nello strato sottile di

materiale passano in acqua e formano Liposomi. i liposomi che si formano potrebbero essere

anche molto grandi ( non otteniamo tutte particelle uguali tra loro ma abbiamo una vera e

propria DISTRIBUZIONE DIMENSIONALE)

Con questo metodo adesso si hanno solamente MLV ovvero liposomi multilamellari,

>micrometri.

RIDIMENSIONAMENTO DELLE MLV

Vi sono metodi diversi per ottenere i SUV più piccoli:

1. IMMERGERE IN UNA SORGENTE ULTRASONICA:SONICAZIONE (bagno ad

ultrasuoni) l’onda ultrasonica ha elevata potenza. Gli ultrasuoni sono caratterizzati da

frequenza,periodo e potenza (energia che possiede l’onda). Quando l’onda ultrasonica ha

elevata potenza e si propaga all’interno della fase acquosa, il liposoma si rompe in liposomi

via via più piccoli. Maggiore è la potenza degli ultrasuoni e più lungo è il tempo di

sonicazione e più i liposomi vengono piccoli.

ad elevata energia e per tempi sufficientemente

2. OMOGENEIZZAZIONE:

lunghi, continuo fino a quando non arriviamo alle dimensioni desiderate

(attorno ai 100nm)

3. ESTRUSIONE: la soluzione viene fatta passare attraverso dei filtri a membrana (tipo quelli

che si usano per la preparazione degli iniettabili. La nostra soluzione viene fatta passare

attraverso pori molto piccoli. Se ho un liposoma di 5 micrometri e pretendo di farlo passare

attraverso un poro da 0.2 micrometri non posso. Ma se lo faccio passare attraverso un foro di

1-2 micrometri ci passa perché è flessibile e sotto la spinta della pressione esercitata si piega

e passa. Nel fare questo si rompe e ottengo liposomi molto più piccoli. Si potrebbe prendere

dei filtri ora con fori di 500nm e li filtro ulteriormente e vado avanti cosi con filtri con fori

sempre più piccoli. Il problema a questo punto è che i porti delle membrane fino a

determinate dimensioni sono abbastanza regolari e standard ma quando voglio farlo molto

piccolo 70nm tipo, inizia a venir meno la garanzia di avere porti tutti uguali. La dimensione

del liposoma di conseguenza cambierà (aumento della variabilità)

4. COMBINAZIONE DEI VARI SISTEMI

SX Attraverso il metodo dell’estrusione da un liposoma multilamellare si passa ad uno di piccole

dimensioni

DX vediamo invece come gli ultrasuoni provochino una deformazione, si stacca uno sorta di

protuberanza dal liposoma stesso e se ne forma un altro più piccolo. La tendenza ad una taglia

sempre più piccola avviene man mano in maniera abbastanza caotica.

2.MICROFLUIDICA (metodo di preparazione

dei liposomi) SCHEDINE DI

Metodo completamente diverso dal precedente che prevede l’utilizzo di

MICROFLUIDICA: sono tavolette contenenti dei piccolissimi canali, molto

simili alle schede elettroniche dei computer. All’inizio della tavoletta ci sono degli ingressi.

I canali possono avere strutture diverse:

lineari

• Curvi a 90° etc

•

Dentro questi canali vengono separati ad una certa pressione fasi liquide che normalmente sono

MISCIBILI tra loro.

Quando arrivano al canale principale la velocità di questi flussi è tale che continuano ad andare

ognuno per la propria strada senza mischiarsi (anche se sono fatti di liquidi miscibili). Ovviamente

però vengono a contatto ma è come se si trattasse di un interfaccia (è una sorta di interfaccia perché

in realtà le fasi sono miscibili tra loro).

Nel punto in cui vengono a contatto succede che:

Se mettiamo i nostri fosfolipidi in ISOPROPIL ALCOL (solvente organico miscibile in

• acqua) e nei canali laterali facciamo arrivare la fase acquosa (tampone fosfato) all’uscita del

canale raccogliamo dei liposomi perché il fosfolipide dal canale di isopropil alcol con

l’interfaccia fittizia passa in acqua e forma il liposoma ben più piccolo di quello che si forma

con il metodo classico.

I liposomi sono sufficientemente piccoli per i nostri scopi?

Non è detto, può darsi che sia necessario intervenire per rimpicciolirli ulteriormente

Il problema è : nell’ultima unità di tempo quanti liposomi raccolgo? Pochissimi perché le

schedine in plexiglas sono piccole quindi pensare di traferire questa cosa su scala

industriale è ancora difficile (non ci si è riusciti). Bisognerebbe avere tante schedine che

funzionano contemporaneamente.

LIPOSOMIDI PRIMA GENERAZIONE 1°

I liposomi di prima generazione sono quelli che vengono fuori dai fosfolipidi nudi e crudi

colesterolo sfingolipidi)

(eventualmente aggiunti di o di

SFINGOLIPIDI sfingosina

Gli hanno come scheletro la al posto della glicerina e si

trovano soprattutto nello strato corneo e fanno da collante tra i corneociti rigenerati e

morti dello strato corneo.

I liposomi di prima generazione sono semplici liposomi che vengono caricati di p.a

• e vengono iniettati anche endovena.

Rimangono in circolazione poco tempo perché la fine di questi liposomi è la

• neutralizzazione e l’eliminazione smaltimento ad opera dei macrofagi (vengono

riconosciuti dal sistema immunitario).

LIPOSOMI DI SECONDA GENERAZIONE O

"STEALTH LIPOSOME” 2°

Si è quindi pensato di passare a quelli di SECONDA GENERAZIONE: gli STEALTH

LIPOSOME liposomi invisibili.

Questi sono creati tramite un fenomeno chiamato PEGILAZIONE.

Viene mascherato/nascosto al sistema immunitario e resta in circolazione molto più a lungo

rilasciando p.a.

Esempio tipico di un liposoma di 2°generazione e quello della DOXORUBICINA (antitumorale)

La doxorubicina con l’acqua si trova all’interno del liposoma e le teste polari del doppio strato

fosfolipidico che puntano verso l’interno formano delle MESOFASI

La mesofase è una fase liotropica a cristalli liquidi. Si forma una specie di gel all’interno del

liposoma.

I liposomi di prima generazione sono ormai superati completamente però bisogna

liposoma pegilato non è specifico e non riconosce un determinato

sottolineare che il

substrato biologico ma si distribuisce dappertutto. 3°generazione.

Ecco allora che si stanno cercando di riprodurre i liposomi di Abbiamo

monoclonali”

pe