Appunti Neurofarmacologia sperimentale

La presenza degli omo ed eterotrasportatori

Da ormai una 30ina d’anni nel nostro lab e in altri è stato dimostrato che trasportatori di membrana deputati a riconoscere e captare NT diversi tra di loro è un fenomeno molto comune nel SNC, sia nell’animale che molto probabilmente nell’uomo. I trasportatori per diversi NT spesso coesistono sullo stesso terminale nervoso. Nel caso più semplice di un neurone che rilascia un solo NT A sicuramente ci sarà il trasportatore A attraverso il quale il NT viene captato o rilasciato in condizioni di inversione del trasportatore. A fianco al trasportatore per il NT caratteristico (omotrasportatore) di questo neurone esiste un trasportatore sulla membrana che è in grado di riconoscere selettivamente un NT B diverso da A (eterotrasportatore) che può essere rilasciato da un neurone adiacente. A cosa serve la presenza degli omo ed eterotrasportatori? La motivazione dell’esistenza degli eterotrasportatori non è ancora chiara, ma

è sicuro chel’attivazione di un eterotrasportatore da parte del suo substrato produce attraverso meccanismi intracellulari un aumento della liberazione spontanea di acqua, ad esempio, attraverso una maggiore esocitosi -> in pratica stimola il rilascio del NT precedentemente captato attraverso l’omotrasportatore (A). A può essere anche sintetizzato tramite meccanismi endogeni e non è detto sia solo ricaptato. Gli eterotrasportatori quindi contribuiscono a regolare la quantità di NT rilasciato attraverso un meccanismo locale. È uno dei modi con cui si verifica un’interazione tra 2 NT aa molto importanti nel midollo spinale (glicina e glutammato). Infatti, è stato dimostrato che la glicina, attraverso degli eterotrasportatori specifici e selettivi per la glicina presenti su terminali nervosi spinali che rilasciano glutammato, è in grado di potenziare il rilascio spontaneo del NT glutammato. È proprio questo esempio

responsabile di un’alterazione negli animali patologici. Il rilascio di glutammato tramite glicina è molto più marcato negli animali malati che in quelli sani. Se questo fosse vero anche in vivo e nell’uomo ci sarebbe anche eccesso di rilascio di glutammato nel midollo spinale provocato dalla glicina da neuroni glutamatergici e questo potrebbe contribuire alla patologia e quindi sarebbe ipotizzabile come bersaglio farmacologico un intervento che bloccasse eccesso di glutammato a partire da glicina negli animali malati.

Per studiare questo meccanismo, agli sinaptosomi che sono marcati con aspartato radioattivo per mimare il glutammato endogeno vengono somministrate concentrazioni crescenti di glicina (la glicina è quella che attraverso l’eterotrasportatore provoca incremento del rilascio del glutammato). La glicina a varie concentrazioni via via crescenti stimola un rilascio di glutammato che diventa già molto marcato alla concentrazione di 100 mM.

Studiare questo tipo di fenomeni insolito si usa una concentrazione di agente farmacologico che evoca circa la metà dell'effetto massimo (siamo intorno all'EC50).

Come sono stati ottenuti questi dati? Da diverse camere di superfusione. In un certo gruppo di camere il trattamento è stato fatto con la concentrazione più bassa di glicina (1 mM) e non si misura niente di glutammato, nemmeno a 3 mM. Abbiamo un potenziamento se arriviamo a 100 mM. A 1000 mM abbiamo effetto massimo della glicina.

Qualcosa di simile avviene quando usiamo sinaptosomi del GABA stimolati con glicina. Si ha un maggiore rilascio di GABA. Questo è dovuto al fatto che ci sono eterotrasportatori per la glicina anche su terminali che rilasciano il GABA.

Per completare lo studio si è andato a vedere cosa fa il GABA sul rilascio del glutammato. Si è visto che potenzia il rilascio di glutammato. GABA a concentrazioni crescenti aumenta il rilascio di glutammato perché su

terminazioni glutammatergiche ci sono eterorecettori del GABA. Dall'ultimo grafico si vede che GABA non induce rilascio di glicina. Da questi grafici si può dimostrare che glicina può rilasciare glutammato grazie a eterotrasportatore? Non è dimostrato che è dovuto ad un eterotrasportatore. Come si fa a dimostrare che è coinvolto questo meccanismo? 201 grafico: scegliamo concentrazione di glicina pari a 100. Effetto della glicina che provoca rilascio di glutammato potrebbe essere dovuto a: attivazione degli eterotrasportatori, attivazione di siti recettoriali. Può agire su due tipi di recettori: recettori della glicina inibitori (stricnino sensibile) e i recettori NMDA comportandosi da coagonista. Se l'effetto della glicina misurato dalla sbarra verde chiara fosse dovuto a un recettore per la glicina, l'effetto dovrebbe essere bloccato dalla stricnina mentre la seconda sbarra verde più scuro che corrisponde alla situazione.sperimentale in cui ho aggiunto glicina più stricnina (Antagonista al recettore della glicina) è comunque alta, ho comunque effetto. L'effetto che vediamo dovuto alla glicina non è bloccato dalla stricnina e quindi non è dovuto all'attivazione sul sito NMDA. 3 colonna = 5,7 DCK (diclorochinovenato)+ glicina: l'effetto che vediamo è dovuto alla glicina e non è bloccato dal 5,7 DK e quindi non è dovuto ad attivazione sul sito NMDA. 4 colonna = effetto della glicina in presenza di GDA (GDA blocca sia GLYT1 che GLYT2): qui l'effetto è bloccato praticamente tutto. Questo grafico dimostra che come abbiamo detto all'inizio la glicina fa rilasciare il glutammato per attivazione di trasportatori della glicina, quindi sono trasportatori della glicina presenti su terminazioni nervose glutammatergiche e quindi sono eterotrasportatori della glicina presenti su terminali spinali. Analogamente si dimostra che glicina fa

1. Rilascio di GABA tramite eterotrasportatori e non recettori.
2. Fenomeni importanti sono 2:
   • Rilascio di glutammato provocato da glicina.
   • Rilascio di glutammato provocato dal GABA. L'ultimo grafico dimostra che anche nel caso di rilascio di glutammato provocato dal GABA il fenomeno è dovuto all'attivazione di eterotrasportatori che sono trasportatori per il GABA localizzati su terminali glutammatergici.
3. Dando antagonisti del recettore GABA A e del recettore GABA B non si ha modifica dell'effetto del GABA e quindi recettori del GABA non sono coinvolti.
4. SKF è un bloccante selettivo del trasportatore per il GABA. Quando è presente non si ha più l'effetto di rilascio di glutammato grazie al GABA.
5. Il GABA tramite eterotrasportatori di tipo gabaergico stimola il rilascio di glutammato da terminazioni glutammatergiche.
6. Curva gialla rappresenta il fenomeno descritto negli animali transgenici che non si ammalano (SOD1+). Essi sovraesprimono l'enzima.

superossidodismutasi 1 umanosano. Il fenomeno è analogo a quello dei topi non trasgenici. (caso descritto prima)Se faccio lo stesso esperimento negli animali mutanti che esprimono il gene per laSOD1 umana mutata e che sono malati e con i sintomi (curva verde) noto che laglicina fa rilasciare glutammato con un'efficienza superiore (quasi del doppio). Neglianimali patologici c'è un eccesso di rilascio di glutammato provocato dalla glicina. Unadelle cause della SLA è eccesso di glutammato e quindi questo può rappresentare unodei meccanismi con cui c'è eccesso di rilascio di glutammato. Questi dati sono stati 21replicati almeno 5 o 6 o 7 volte per avere una deviazione standard sufficientementepiccola da poter dire che c'è una differenza significativa statisticamente tra i duefenomeni.In questi animali ci sono almeno due alterazioni:eccessivo rilascio di glutammato provocato dalla glicina eccessivo rilascio di glutammato

provocato dal GABA Visto che glicina e GABA sono quasi sicuramente presenti a livello delle terminazioni glutammatergiche questo potrebbe essere un meccanismo di incremento dell'amidazione glutammatergica che abbiamo detto all'inizio essere una causa della patologia. Il primo grafico mostra che glicina fa rilasciare glutammato nel midollo spinale di animali SOD1+ (di controllo) e SOD1 (-) non transgenici di controllo. Questi animali a differenza di quelli precedenti hanno tra i 2 e tre mesi di vita, sono presintomatici e questo è importante perché si osserva che nel gruppo SOD1 G93A mutanti che si ammalerebbero dopo 1 mese c'è già eccessivo rilascio di glutammato da parte della glicina. Nel grafico a destra si guardano gli effetti di 3 concentrazioni di glicina sul rilascio di glutammato negli animali di controllo (bianco e giallo) non mutanti (Questi animali hanno un solo mese di vita) a 30 mM di glicina fanno rilasciare poco glutammato. Pur essendo

animali molto presintomatici negli animali mutanti c'è rilascio di molto più glutammato che negli animali di controllo. Aumentando la concentrazione di glicina si vede sempre questo fenomeno. L'alterazione del glutammato prodotto dalla glicina è data da glicina presente nellabiofase, normalmente lo fa in maniera maggiore negli animali che presentano lamutazione (già negli animali con un mese di vita). Se questo fosse vero nell'uomo, questo alterato rilascio di glutammato osservabile a tutte le età in questi animali (anche quando non presentano sintomi) è correlabile più a meccanismi di tipo eziologico (che stanno tra le cause della patologia) che come conseguenza della patologia perché si evidenziano già a età precoce quando la malattia ancora non c'è e quindi potrebbe essere utile ipotizzare come possibile bersaglio farmacologico. Appropriati bloccanti dei trasportatori della glicina

bloccando questo fenomeno che è eccessivo nella patologia e che forse può contribuire alle cause della patologia. Si è osservato che il rilascio spontaneo di trizio aspartato = glut (senza glicina) è maggiore negli animali mutanti soprattutto in quelli di 30-40 gg di vita. Quindi anche il semplice rilascio di glutammato non stimolato dagli eterotrasportatori è già più alto di natura nel midollo spinale degli animali che si ammalano. Anche questo è un fenomeno su cui è più difficile intervenire perché è un rilascio basale spontaneo ma correlabile a cause più che a conseguenze di patologia. La comunicazione tra neuroni avviene in vari modi: - Rilascio di trasmettitore che attiva recettori post-sinaptici - Un neurone manda il neurotrasmettitore su recettori che sono localizzati sulla terminazione nervosa di un altro neurone, questi recettori sono detti pre-sinaptici. Possono essere attivati dai

neurotrasmettitori rilasciati dallo ste