Appunti Neurofarmacologia sperimentale

Neurofarmacologia sperimentale

Il neurotrasmettitore viene rilasciato per esocitosi quando arriva il potenziale d'azione. Esso attiva i recettori post-sinaptici e da questo si avrà un effetto, cioè il passaggio del messaggio dal pre-sinaptico al post-sinaptico. Il segnale può essere eccitatorio o inibitorio.

Autorecettori e trasportatori

Il neurotrasmettitore può attivare dei recettori presenti sulla stessa terminazione da cui sono stati rilasciati, chiamati autorecettori. Hanno un meccanismo a feedback negativo: la loro attivazione determina una riduzione del rilascio del neurotrasmettitore.

Il trasportatore selettivo per la captazione è una proteina trasmembrana che serve per ricaptare il neurotrasmettitore dalla sinapsi e che successivamente viene immesso in vescicole sinaptiche che poi danno luogo all’esocitosi.

Eterorecettori e rami neuronali

Eterorecettore: recettore per altro trasmettitore.

Possono esserci dei rami ricorrenti, cioè parti di assone che si sdoppiano e ritornano verso il corpo cellulare rilasciando il neurotrasmettitore su autorecettori posti sul corpo cellulare e che decorrono in modo collaterale all’assone principale.

Tipologie di neuroni

Gli interneuroni sono neuroni molto corti che si sviluppano in un’area cerebrale. I neuroni di proiezione hanno il corpo cellulare in un’area cerebrale e innervano un’altra area. Un neurone può mandare messaggi ad altri neuroni posti a distanza attivando dei recettori attraverso il liquido cefalorachidiano.

Unità di misura in farmacologia sperimentale

In farmacologia sperimentale le unità di misura vanno dal milligrammo (mg) in giù per la massa o dal millimolare (mM) in giù per le concentrazioni delle soluzioni.

• Milligrammo (mg) = 1x10^-3 g
• Microgrammo (µg) = 1x10^-6 g
• Nanogrammo (ng) = 1x10^-9 g
• Picogrammo (pg) = 1x10^-12 g
• Femtogrammo (fg) = 1x10^-15 g

Neurotrasmissione

La neurotrasmissione avviene attraverso i neurotrasmettitori, che sono dei mediatori chimici. È composta da diverse fasi.

Fasi della neurotrasmissione

Per ogni neurotrasmettitore la prima fase è la biosintesi. Per la noradrenalina, ad esempio, si parte dalla tirosina, un amminoacido che viene fatto entrare nel neurone attraverso un trasportatore Na+ dipendente. La tirosina-idrossilasi la trasforma in dopa, successivamente viene trasformata in dopamina tramite l’enzima dopa-decarbossilasi e poi grazie alla β-idrossilasi in noradrenalina che viene immagazzinata nelle vescicole sinaptiche. Le vescicole sono rivestite da un doppio strato fosfolipidico, si trovano all’interno del terminale nervoso e contengono una certa quantità di neurotrasmettitore. All’arrivo del potenziale d’azione si ha l’esocitosi: il neurotrasmettitore viene rilasciato nella sinapsi e va ad attivare i recettori posti sul neurone post-sinaptico. In questo modo si ha il passaggio dell’impulso dal neurone pre-sinaptico al neurone post-sinaptico.

La seconda fase comprende l’immagazzinamento del neurotrasmettitore nelle vescicole sinaptiche. La terza fase è la fusione calcio dipendente delle vescicole con la membrana sinaptica, e comprende l’esocitosi. Il calcio entra attraverso canali calcio voltaggio dipendente; quando si aprono, il calcio dall’esterno entra all’interno del neurone perché è più concentrato all’esterno, e questo innesca la fusione delle vescicole con la membrana sinaptica e quindi l’esocitosi. Il neurotrasmettitore rilasciato può attivare recettori post-sinaptici o pre-sinaptici (sono inibitori). A questo punto, il neurotrasmettitore può essere ricaptato attraverso un trasportatore specifico localizzato sulla terminazione nervosa che l’ha rilasciato (solitamente è Na dipendente, sfrutta il gradiente del Na che è maggiore all’esterno per importare il neurotrasmettitore) oppure viene metabolizzato (viene inattivato). Le MAO (monoamminossidasi) e le COMPT sono responsabili del metabolismo della noradrenalina.

Il neurotrasmettitore entra nella vescicola grazie a un trasportatore vescicolare. La vescicola subisce una traslocazione verso la membrana grazie a delle proteine. La prima tappa è il docking (l’ancoraggio), cioè l’interazione tra proteine che si trovano sulla membrana della vescicola e proteine che si trovano sulla membrana plasmatica, avviene in zone attive. Successivamente avviene il priming (preparazione) in cui la vescicola e la membrana interagiscono sempre di più. All’arrivo del potenziale d’azione si aprono i canali calcio dipendente, il calcio entra all’interno e questo innesca delle reazioni tra proteine delle membrane vescicolari e della membrana plasmatica che portano alla fusione della vescicola con la membrana plasmatica e quindi il neurotrasmettitore viene riversato all’esterno per esocitosi. Successivamente la vescicola viene recuperata attraverso un processo di endocitosi: la vescicola si riforma, viene traslocata e si fonde con l’endosoma oppure viene riciclata direttamente. Dall’endosoma si creano nuove vescicole che poi vengono caricate con altro neurotrasmettitore.

Il neurotrasmettitore può essere rilasciato anche con meccanismi differenti. Per esempio, in condizioni patologiche o sotto l’effetto di alcuni farmaci, il trasportatore, che solitamente ricapta il neurotrasmettitore dall’esterno verso l’interno, può rilasciarlo (è bidirezionale). In questo caso, il neurotrasmettitore deve essere citoplasmatico per essere rilasciato (non deve trovarsi in vescicole).

Modelli sperimentali nella neurotrasmissione

Esistono vari modelli sperimentali per studiare i meccanismi della neurotrasmissione anche in caso di assunzione di farmaci (come modificano la neurotrasmissione). Un modello molto versatile sono i sinaptosomi, terminazioni nervose isolate provenienti da un neurone che si trovano in una certa area cerebrale. Si ottengono per omogeneizzazione del materiale biologico, si fa in una soluzione di saccarosio. Si ottiene una sospensione che contiene i sinaptosomi. La terminazione dell’assone si rompe e questo si rivescicola, sono strutture semisferiche di pochi micron e mantengono all’interno tutte le strutture vitali. Il sinaptosoma è un modello semplificato che permette di studiare gli eventi pre-sinaptici relativi al rilascio di neurotrasmettitore e si possono studiare gli effetti limitanti recettoriali dovuti a modificazioni del rilascio in seguito all’assunzione di determinate sostanze. Si possono ottenere da molti neuroni differenti.

Dagli astrociti (cellule gliali), durante il processo di omogeneizzazione, si formano i gliosomi che in alcune condizioni possono rilasciare neurotrasmettitore. Si formano con un gradiente differente rispetto a quello degli sinaptosomi, le varie fasi si distinguono per le concentrazioni di percoll (è un polimero). I gliosomi si trovano nella banda più in alto, i sinaptosomi si trovano nella banda tra 10-20% di percoll. Le varie fasi si separano con la centrifuga.

Con i sinaptosomi si possono studiare vari fenomeni come la biosintesi, l’uptake (ricaptazione del neurotrasmettitore), il rilascio di neurotrasmettitore e monitorare i parametri intraterminali (concentrazioni di ioni Ca²⁺). Questi fenomeni si possono osservare in condizioni normali o sotto l’effetto di alcune sostanze (condizioni farmacologiche).

Superfusione

La superfusione ci permette di studiare il rilascio di neurotrasmettitore dai sinaptosomi. Nella sospensione di sinaptosomi ci sono tutti i terminali nervosi contenuti nel tessuto cerebrale di partenza. Questa tecnica ci permette di isolare un determinato neurotrasmettitore. La superfusione ci consente di studiare la popolazione nervosa che ci interessa trattando per esempio il campione con dopamina radioattiva trascurando gli altri neurotrasmettitori che non ci interessano. Questa tecnica consiste di stratificare i sinaptosomi su un monostrato che viene posto su un filtro dotato di piccoli pori (microporoso) che permettono il passaggio solo di piccole molecole come i neurotrasmettitori. Il tutto viene poi posizionato su setto di vetro. Il sistema poi viene immesso in una camera mantenuta a 37° contenente una soluzione fisiologica. Tutto questo è collegato tramite tubi molto sottili a una pompa peristaltica che determina un richiamo di liquido, si ha una perfusione dello strato di sinaptosomi dall’altro verso il basso. Viene raccolto il liquido che contiene i neurotrasmettitori rilasciati. Questa tecnica permette di semplificare l’interpretazione di alcuni risultati. Tutti i neurotrasmettitori rilasciati da tutte le terminazioni nervose presenti nel monostrato vengono rimossi e l’ambiente rimane libero da queste sostanze e quindi non c’è un’alterazione del rilascio di neurotrasmettitore dovuto all’effetto di sostanze rilasciate da strutture adiacenti o dalla stessa struttura. L’unico neurotrasmettitore che resta nell’ambiente è quello che abbiamo aggiunto noi (per esempio la dopamina radioattiva). Se aggiungo un farmaco e vedo che il rilascio del neurotrasmettitore interessato è alterato, posso dire che questa modificazione del rilascio è dovuta solo all’interazione del farmaco aggiunto, non ci sono effetti indiretti. Studiando il rilascio di dopamina e noto che il rilascio è modificato a seguito dell’aggiunta di una determinata sostanza, posso dedurre che il rilascio è determinato da strutture presenti su questo terminale sinaptico e non su altri terminali. Questa tecnica è importante per comprendere i meccanismi delle sostanze farmacologiche, tossicologiche e biologiche: permette di capire come esse alterano il meccanismo del rilascio.

Un altro metodo prevede l’utilizzo di fibre di tessuto nervoso. Si ottengono delle fettine del tessuto nervoso. Questo trattamento permette di ottenere tessuto più integrato, è più vicino alla realtà perché queste porzioni di tessuto mantengono la circuitistica presente nel neurone. Si possono fare studi con una sorta di superfusione: la fettina si mette su una barriera di polipropilene, ci sono degli elettrodi di platino sopra e sotto il campione e c’è il liquido di perfusione, cioè la soluzione fisiologica che passa dal basso verso l’alto. Gli elettrodi danno delle stimolazioni elettriche che mimano l’attività del neurone. Tutto il sistema è contenuto in una camera. Le camere vengono messe in bagno termostato per mantenere la temperatura fisiologica. Si possono avere 8-10 camere. I dati ottenuti derivano da una struttura più integrata, più simile alla realtà, ma sono difficili da interpretare perché il sistema è più complesso. È una metodica complementare a quella dei sinaptosomi.

Un modello ancora più complicato è lavorando in vivo. Soprattutto si utilizzano i ratti. Si lavora sull’intero cervello. È un modello reale. È possibile misurare il liquido raccolto durante la dialisi. Si può quantificare il rilascio di un certo neurotrasmettitore in una certa area che viene modificato da vari stimoli differenti. Con questa tecnica si è dimostrato che tutte le sostanze d’abuso aumentano il rilascio di dopamina soprattutto nel nucleo accumbens (l’area del piacere e della gratificazione). Quando si utilizzano queste tecniche i risultati sono molto variabili, all’aumentare della complessità del sistema su cui si lavora aumenta la variabilità dei dati che si ottengono, quindi sono necessari più esperimenti ed è molto difficile la loro interpretazione.

Con queste tecniche si possono mimare delle alterazioni chimiche tipiche di alcune neuropatologie. Grazie all’azione della Na/K ATPasi (presente in tutte le cellule) la concentrazione di ioni potassio nel mezzo che simula il liquido cefalo-arachidiano è di 5 mM (millimolare), mentre all’interno delle cellule è di 150 mM. Questo avviene perché c’è un trasporto di K verso l’interno e un trasporto di Na verso l’esterno. La concentrazione dell’Na normalmente è di 150 mM all’esterno e di 5 mM all’interno del neurone. È possibile alterare il mezzo di perfusione mimando quello che avviene in alcune neuropatologie come l’ischemia cerebrale e nell’epilessia. In queste patologie il K extracellulare può salire fino a 50-70 mM. Se creo una soluzione di superfusione che contiene 50-70 mM di K, mimo queste patologie e si considera come modello chimico per studiare i meccanismi coinvolti nelle modificazioni del rilascio.

Il glutammato spesso è implicato nei danni che si hanno in varie neuropatologie. Per studiare le condizioni che mimano l’ischemia della corteccia cerebrale, si preparano i sinaptosomi e si marcano con glutammato radioattivo o con aspartato radioattivo che mima il glutammato endogeno. Si misura il rilascio in condizioni basali, a questo punto la terminazione nervosa viene sottoposta alla perfusione con 50 mM di K per mimare le condizioni dell’ischemia.

Nell’ischemia collassano i gradienti elettrochimici per mancanza di ossigeno e nutrienti. Tra le varie conseguenze, il K esterno aumenta a 50-70 mM. Normalmente il K è più concentrato all’interno che all’esterno, quindi esce attraverso dei canali K specifici posti sulla membrana della terminazione nervosa e questo permette di mantenere negativo il potenziale di membrana (a riposo è -70 mVolt). Quando il potassio esterno aumenta, il gradiente elettrochimico tra interno ed esterno diminuisce, quindi la velocità dell’uscita del potassio si riduce e questo genera una depolarizzazione patologica (il potenziale di membrana aumenta, diventa meno negativo). Con 50 mM di K si crea una forte depolarizzazione del terminale nervoso, che non è fisiologica. Queste depolarizzazioni patologiche sono tipiche dell’ischemia e dell’epilessia. In queste condizioni si evidenziano dei meccanismi di rilascio del neurotrasmettitore che sono aggiuntivi alla normale esocitosi (l’esocitosi avviene sempre) e sono stati studiati grazie all’utilizzo dei sinaptosomi. Questa depolarizzazione patologica provoca un’attivazione dei canali Na voltaggio dipendenti che fanno entrare una grossa quantità di Na all’interno e questo depolarizza ulteriormente la cellula. Inoltre, Na viene scambiato con il Ca che si trova nel mitocondrio attraverso degli scambiatori Na/Ca detti mNCX, questo fa aumentare la concentrazione di calcio intracellulare e di conseguenza aumenta l’esocitosi per esempio di glutammato. Se il glutammato viene rilasciato in eccesso, attiva i recettori glutammatergici in modo eccessivo e questo può portare alla morte dei neuroni eccitati. Il glutammato è carico negativamente e può penetrare attraverso i canali anionici posti sul terminale sinaptico e questo aumenta ulteriormente la sua fuoriuscita. Si deve intervenire farmacologicamente per ridurre il rilascio eccessivo di glutammato. Ogni tappa può essere il bersaglio del farmaco. Vennero studiati dei bloccanti dello scambiatore Na/Ca posto sul mitocondrio. Queste sostanze riducono l’uscita di Ca dal mitocondrio e quindi riducono il rilascio di glutammato. Queste sostanze possono essere potenziali farmaci anti-ischemici. Altri candidati come possibili farmaci sono i bloccanti dei canali Ca (riducono il rilascio di neurotrasmettitore).

Per poter sviluppare nuovi neurofarmaci è importante capire i meccanismi di neurotrasmissione. (Molti neurotrasmettitori vengono rilasciati in eccesso in condizioni ischemiche oltre al glutammato).

Anche i gliosomi sono in grado di trasportare il glutammato perché sono dotati di un trasportatore specifico. Per studiare il meccanismo, il campione di gliosomi venne trattato con glutammato o aspartato radioattivo. Con alte depolarizzazioni c’è un eccessivo rilascio di glutammato che deriva dalle cellule gliali. Nella situazione ischemica, quindi, si ha un eccesso di rilascio di glutammato da parte delle cellule gliali attraverso il trasportatore; si ha un rilascio carrier-mediato (non avviene per esocitosi ma attraverso un trasportatore invertito). Una sostanza che blocca questo meccanismo può avere anche altre azioni, ad esempio può essere una sostanza tossica e quindi è difficile produrre nuovi neurofarmaci.

Ippocampo e ischemia

Nell’ippocampo (importante per la memoria), in caso di ischemia, oltre al rilascio di glutammato, c’è anche un eccessivo rilascio di GABA che attiva i recettori GABA su cellule adiacenti in modo eccessivo e questo provoca l’inibizione e un’eccessiva entrata di acqua attraverso i recettori canale, aumentando il volume cellulare e danneggiando il neurone. Nelle depolarizzazioni patologiche, dovute a una concentrazione esterna di 50-70 mM di K, si ha l’attivazione dei canali Ca voltaggio dipendenti che provocano l’esocitosi e l’ingresso di Na all’interno del terminale nervoso che provoca l’attivazione dello scambiatore Na/Ca a livello mitocondriale, portando a una maggiore esocitosi. Il rilascio è aumentato anche dallo scambiatore Na/Ca che si trova a livello della membrana plasmatica, detto pMCX, trasporta il Na all’esterno contro il Ca all’interno e quindi si ha un ulteriore rilascio di neurotrasmettitore. Sono stati studiati degli inibitori di pMCX, sono dei possibili farmaci anti-ischemici. Il GABA può fuoriuscire anche dal carrier, cioè dal trasportatore che normalmente ricapta il neurotrasmettitore. Con la concentrazione di Na elevata all’interno, si inverte il suo gradiente e il GABA fuoriesce attraverso l’inversione di questo trasportatore.

Veratridina

Il terminale nervoso si può depolarizzare anche con un alcaloide del Veratro, cioè la veratridina. Questo composto è un potente attivatore dei canali Na, mantiene aperti questi canali facendo entrare il Na all’interno della cellula. Questo permette di mimare l’ischemia. Anche in questo caso si hanno 4 meccanismi di rilascio. Con la depolarizzazione...