Appunti microbiologia

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Esame

Scritto (2 domande aperte + 5 domande a risposta multipla + 1 domanda di laboratorio) + orale (l’orale riparte dalle parti “sbagliate” dello scritto): prima domanda sempre sul metabolismo.

Introduzione

I microrganismi (moo) comprendono tutti i regni del viventi. La microbiologia si divide in:

• Microbiologia generale
• Microbiologia applicata

Ruolo dei microrganismi nel nostro pianeta: fotosintesi ossigenica (cianobatteri, che sono gram negativi); il ciclo dell’azoto (fissazione dell’azoto) che è compiuto dai batteri (è un processo riduttivo influenzato dalla presenza di ossigeno). I cianobatteri producono ossigeno e fissano l’azoto. I microrganismi sono in grado di chiudere il ciclo da materia organica a composti minerali. Le comunità microbiche sono in grado di organizzarsi per compiere determinate funzioni che i singoli moo non sono in grado di sviluppare. La maggior biomassa sul pianeta è costituita dai microrganismi.

Per identificare i moo si usano tecniche di isolamento e di identificazione, negli ultimi anni stanno aumentando le tecniche molecolari di identificazione.

Metagenomica

È lo studio dei moo e delle loro comunità nel contesto del loro habitat naturale. Tutti i geni di una comunità microbica sono riferiti in modo collettivo come metagenoma.

iChip: sono dei supporti che si inseriscono nel suolo, in modo da separare la singola cellula e da consentire gli scambi metabolici.

Breve excursus storico

03/10/2016

Janssen (~1590/1610): 1° microscopio (forse anche Galileo)
Hooke (1635-1723): primo volume dedicato a osservazioni al microscopio → disegni di muffe
van Leeuwenhoek (1632-1723): scopritore del mondo microbico, primo ad osservare e descrivere i batteri (1676); padre dell’istologia. Ciò nacque dal suo studio sui tessuti
Redi (1626-1697): lavora e poi pubblica importante testo confutando la generazione spontanea (1688). Intanto comincia a prendere piede la «teoria cellulare»; ma allora?

Spallanzani (1729-1799): conduce esperimenti su sterilizzazione e nel 1770 fornisce pubblica dimostrazione di sterilizzazione del brodo (Appert→APPERTIZZAZIONE). Ancora dibattuto il punto chiave sulla generazione spontanea (problema dell’Ossigeno), ma si comincia a cogliere ruolo di moo come principio trasformatore. Cominciano in questi anni a comparire molti lavori sui lieviti, e sul loro ruolo nella fermentazione di vino e birra.

1836-37 Cagnard-Latour
Schwann
Kützing

Ancora non chiarito il possibile ruolo dei moo come agenti delle malattie, ma importanti studi sono già stati impostati e compiuti.

~1798: primi lavori riconosciuti di Jenner (immunizzazione contro vaiolo)
~1835: Bassi, pone basi per comprensione del fenomeno del contagio

Pasteur (1822-1895):
- nel 1864 pubblica e dà dimostrazione definitiva che confuta la teoria sulla generazione spontanea della vita
- dal 1857 al 1876 si occupa di fermentazioni
- tutti i processi fermentativi sono il risultato di attività microbiche
- scopre vita in assenza di O₂ (“fermentazione è vita senz’aria”)
- si occupa altresì dell’eziologia delle malattie (in particolare carbonchio, colera, rabbia)

Pasteur dimostrò che facendo passare dell’aria attraverso filtri di fulmicotone, che è ricca di microrganismi che però venivano trattenuti dal filtro; sciogliendo con un miscela di etere e alcol, le particelle venivano rilasciate e si depositavano sul fondo del liquido filtrato. L’analisi di questo materiale precipitato rivelava la presenza di numerosi microrganismi che assomigliavano a quelli spesso trovati in materiali in decomposizione. Pasteur comprese che questi microrganismi presenti nell’aria potevano depositarsi su materiali esposti e contaminarli.

L’esperimento di Pasteur: un brodo di coltura è posto in un matraccio la cui imboccatura viene modellata a collo di cigno per permettere il passaggio dell’aria ma non quello delle particelle microscopiche presenti nell’aria stessa. Il brodo viene quindi portato a ebollizione in modo da uccidere tutte le forme viventi presenti. Anche dopo un lungo periodo, il brodo non diventa torbido per la presenza dei batteri. Solo se il collo del pallone viene rotto, permettendo alle particelle sospese nell’aria di penetrare nel pallone, si osserva intorbidimento del brodo dovuto alla crescita dei microorganismi presenti nell’aria. Con il lavoro di Pasteur si segna l’inizio della Microbiologia Moderna.

Lister: ANTISEPSI CHIRURGICA (1867)

Tyndall e Cohn: esistenza di spore batteriche

Koch (1843-1910): padre della microbiologia medica - chiarisce l’eziologia di molte malattie (carbonchio, tubercolosi, difterite, ecc), definendo la specificità biologica (4 postulati)

1. Il moo deve essere sempre presente in caso di una determinata malattia, e assente in individui sani.
2. Il moo sospetto deve poter essere isolato dal soggetto malato e fatto crescere in una coltura pura.
3. Il moo così isolato, se inoculato in un organismo sano, deve sviluppare la stessa malattia.
4. Dal nuovo ospite infetto deve poter essere nuovamente isolato il medesimo moo.

Pone le basi per tecniche di coltivazione in vitro e criteri di tassonomia batterica. Nel corso di studi nel suo laboratorio furono sviluppate molte tecniche microbiologiche, alcune delle quali sono tuttora in uso. Il primo contributo importante allo sviluppo delle tecniche batteriologiche fu il metodo per coltivare i microrganismi su terreni solidi per farli crescere separatamente l’uno dall’altro. Il primo tentativo per solidificare i terreni liquidi fu quello di usare la gelatina, ma i risultati non furono soddisfacenti per la natura stessa dell’agente solidificante usato; la gelatina fonde a temperature appena superiori a 37°C e inoltre può essere degradata da microrganismi proteolitici. Si passò quindi ad usare fette di patata, sulla cui superficie potevano crescere microrganismi formando delle specie di colonie. Purtroppo la patata non consentiva la crescita di qualsiasi tipo di moo.

Walter Hesse, un allievo di Koch impegnato in ricerche sulla qualità dell’aria, prese ispirazione dalla moglie, la quale usava l’agar come agente solidificante per preparare le gelatine di frutta. L’uso dell’agar presentava un duplice vantaggio rispetto alla gelatina: liquefava alla temperatura di 100°C ma rimane allo stato liquido fino a 45°C; inoltre non viene degradato da moo, salvo per poche eccezioni. Nello stesso laboratorio un altro allievo di Koch, Petri, introdusse l’uso di scatole di vetro, dette capsule di Petri, nelle quali preparare i terreni solidi.

Rivisitazione moderna in chiave molecolare dei postulati

1. Il gene implicato nella patogenicità o virulenza deve essere sempre presente in tutti i ceppi patogeni di una data specie e sempre assente nelle specie non patogene.
2. L’inattivazione selettiva del gene deve portare ad una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.
3. La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità o virulenza. Parimenti, l’introduzione del gene implicato nella patogenicità in un ceppo non patogeno lo trasforma in patogeno.

Koch (1843-1910): chiarisce l’eziologia di molte malattie (carbonchio, tubercolosi, difterite, ecc), definendo la specificità biologica (4 postulati) - pone le basi per tecniche di coltivazione in vitro e criteri di tassonomia batterica - Fannie Eilshemius Hesse: utilizzo di agar - Julius Petri: piastre di Petri (1887)

Ehrlich (1854-1915): basi di futura immunologia e chemioterapia, nonché colorazioni differenziali (es: blu di metilene)
Gram (1853-1938): colorazione differenziale di batteri, che da lui prese il nome, pubblicata nel 1884
Beijerinck (1851-1931): cicli biogeochimici, colture di arricchimento, «virus filtrabile» (utilizzo del filtro di Chamberland, 1851-1908)
Winogradsky (1856-1953): scopre solfobatteri e introduce concetto di autotrofia e chemiolitotrofia
Kluyver (1888-1956): studi fondamentali di biochimica e sul metabolismo, potremmo definirlo fondatore di biochimica comparata («nelle reazioni biochimiche esiste unitarietà») chiarisce che la caratteristica di base di tutti i processi metabolici è il trasferimento di idrogeno (o, diremo noi oggi ancora più modernamente, di elettroni)

Esempi:

• Formula generale per respirazione: AH + B → A + BH₂
• Formula generale per fotosintesi: 5CO₂ + 2H₂A → CH₂O + H₂O + 2A

I suoi studi sono stati di fondamentale importanza perché la microbiologia fosse accettata come disciplina biologica.

1929 Alexander Fleming: penicillina
1930 Gerhard Domagk: sulfamidici
1946: Edward Tatum e Joshua Lederberg: coniugazione batterica
1960: Jacques Monod e Francois Jacob: primo modello di regolazione di espressione genica in batteri
1967: Thomas Brock: isola «batteri» ipertermofili (poi definiti Archea, Carl Woese e George Fox, 1977)
1969: Howard Temin, David Baltimore, Renato Dulbecco: retrovirus e trascrittasi inversa
1981 Stanley Prusiner: primo isolamento di prioni
1985: Kary Mullis: PCR
1995: Craig Venter e Hamilton Smith: primo sequenziamento di genoma (Haemophilus influenzae)

L’origine della vita

L’origine della vita sulla terra è databile entro un periodo compreso tra i 4,4 miliardi di anni fa, quando l’acqua allo stato liquido comparve sulla superficie terrestre, e i 2,7 miliardi di anni fa quando la prima incontrovertibile evidenza della vita è verificata da isotopi stabili e biomarcatori molecolari che mostrano l’attività della fotosintesi.

L’interrogativo su come si originò la vita sulla Terra si rese possibile soprattutto in seguito allo sviluppo della teoria dell’evoluzione per selezione naturale, elaborata in modo indipendente da Wallace e da Darwin nel 1858 la quale suggeriva che tutte le forme di vita sono legate da relazioni di discendenza comune, attraverso ramificazioni di alberi filogenetici che riconducono ad un unico progenitore, estremamente semplice da punto di vista biologico.

Il processo evolutivo che ha portato alla formazione di un sistema complesso e organizzato a partire dal mondo prebiotico è durato centinaia di milioni di anni, ed è avvenuto attraverso tappe successive di eventi che, dopo un numero elevato di tentativi e grazie all’intervento della selezione naturale, hanno portato a sistemi progressivamente più complessi.

La prima tappa fondamentale è stata la produzione di semplici molecole organiche, come amminoacidi e nucleotidi, che costituiscono “i mattoni della vita”. Gli esperimenti di Miller ed altri hanno dimostrato che questo evento era realizzabile nelle condizioni chimico-fisiche della terra primordiale, caratterizzata da un’atmosfera riducente inoltre, il ritrovamento di molecole organiche nello spazio, all’interno di nebulose e meteoriti, ha dimostrato che queste reazioni sono avvenute anche in altri luoghi dell’universo, tanto che alcuni scienziati ritengono che le prime biomolecole siano state trasportate sulla terra per mezzo di meteoriti.

La questione più difficile è spiegare come, questi semplici composti organici, concentrati nei mari in un brodo primordiale, poterono formarsi delle cellule dotate dei requisiti minimi essenziali per poter essere considerate viventi, cioè la capacità di utilizzare materiali presenti nell’ambiente per mantenere la propria struttura, organizzazione e potersi riprodurre.

Teoria della generazione spontanea

Era una credenza molto diffusa fino al 17º secolo, secondo cui la vita potesse nascere in modo “spontaneo” dalla materia inerte o inanimata, tramite l’effetto di flussi vitali. Si riteneva infatti che Dio avesse creato direttamente solo gli esseri viventi superiori mentre quelli “inferiori” (come vermi e gli insetti) potessero nascere spontaneamente dal fango o da carcasse in putrefazione. La teoria della generazione spontanea fu confutata da Redi e Spallanzani.

Redi prese otto barattoli, in ognuno dei quali introdusse pezzi di diversi animali e li divise in due gruppi di 4:

• Senza tappo (gruppo di controllo)
• Con tappo (gruppo sperimentale)

Nei barattoli del gruppo di controllo si osservano delle mosche, che venivano a contatto diretto con la carne e, dopo poco tempo, si sviluppavano diverse larve; nei barattoli tappati non furono ritrovate né larve, né mosche. Questi risultati non erano ancora conclusivi, poiché, per eliminare qualsiasi dubbio sulla possibilità che la mancata circolazione d’aria, nei recipienti chiusi potesse in qualche modo interferire con lo sviluppo delle larve, seguì un altro esperimento nel quale i barattoli del gruppo sperimentale furono chiusi con della garza che permetteva la circolazione dell’aria, impedendo l’ingresso delle mosche. Anche in questo caso non si svilupparono larve, confermando i precedenti risultati sperimentali.

Tuttavia l’avvento e lo sviluppo e il perfezionamento del microscopio, portò ad una generale ripresa della teoria, poiché si scoprirono altre forme di vita, prima sconosciute, come funghi, batteri e vari protozoi: si notò infatti che bastava mettere delle sostanze organiche in decomposizione in un luogo caldo per breve tempo e delle strane “bestiole viventi” apparivano sulla superficie.

Alcuni anni più tardi Spallanzani sottopose ad ebollizione per un’ora delle zuppe, poi sigillò le beute di vetro, che contenevano il brodo, fondendo le aperture. Il brodo ottenuto era sterile e non si rilevò la crescita di microrganismi nemmeno dopo diversi giorni. In un gruppo di controllo, bollì il brodo solo per alcuni minuti e osservò che in queste beute erano cresciuti microrganismi. In un terzo gruppo bollì il brodo per un’ora, ma chiuse le beute con tappi di sughero (che erano abbastanza larghi per il passaggio dell’aria) ed anche in questo caso osservò lo sviluppo di microorganismi. Spallanzani concluse che, mentre un’ora di bollitura sterilizzava la zuppa, pochi minuti non erano sufficienti per uccidere tutte le forme viventi inizialmente presenti ed inoltre i microorganismi potevano essere anche trasportati dall’aria, come era avvenuto nelle beute del terzo gruppo.

Pasteur riuscì a confutare la teoria della generazione spontanea. Egli impiegò per i suoi esperimenti dei matracci a collo d’oca, che permettevano l’entrata dell’ossigeno, elemento indispensabile allo sviluppo della vita, ma impedivano che il liquido all’interno venisse a contatto con agenti contaminanti come spore e batteri. Egli bollì il contenuto dei matracci uccidendo così ogni forma di vita all’interno, e dimostrò che i microorganismi riapparivano solo se il collo dei matracci veniva rotto, permettendo agli agenti contaminanti di entrare.

Nel 1924 Oparin intuì che fu la carenza di ossigeno atmosferico a precedere la catena degli eventi, la quale avrebbe condotto all’evoluzione della vita. In presenza di ossigeno, la radiazione ultravioletta sarebbe stata prontamente schermata dalla formazione di ozono. Oparin ipotizzò che, in un’atmosfera povera di ossigeno e per azione della luce solare, si sarebbero prodotte molecole organiche, le quali, accumulate nei mari primitivi, avrebbero formato un “brodo primordiale”. Queste prime sostanze organiche si sarebbero combinate formando molecole sempre più complesse, fino ad arrivare ai coacervati. Queste goccioline, simili nell’aspetto alle attuali cellule, si sarebbero accresciute per fusione con altre gocce e riprodotte attraverso la divisione in gocce figlie, ottenendo così un metabolismo primordiale in cui quei fattori che promuovevano l’integrità cellulare si mantenevano, al contrario degli altri che si estinguevano.

I modelli attualmente accettati si basano su alcune scoperte circa l’origine delle componenti molecolari e cellulari della vita:

1. Le condizioni pre-biotiche hanno permesso lo sviluppo di talune piccole molecole basilari per la vita, come gli amminoacidi (esperimento di Miller-Urey).
2. I fosfolipidi possono spontaneamente formare un doppio strato, componente base della membrana cellulare.
3. La polimerizzazione di nucleotidi di molecole casuali di RNA potrebbe aver originato i ribozimi autoreplicantesi (ipotesi del mondo a RNA).
4. Una selezione naturale diretta verso una maggiore efficienza catalitica e diversità ha prodotto i ribozimi dotati di attività peptidil transferasica, dalla formazione di complessi tra oligopeptidi e molecole di RNA. Nacque così il primo ribosoma, e la sintesi proteica divenne più prevalente.
5. Le proteine hanno superato i ribozimi per abilità catalitica, divenendo quindi i biopolimeri dominanti. Gli acidi nucleici sono stati limitati ad una funzione prettamente genomica.

Le sostanze da cui si pensa che la vita si sia formata sono:

• Metano
• Ammoniaca
• Acqua
• Acido solfidrico
• Anidride carbonica o monossido di carbonio
• Fosfati

Negli anni '50 e '60 Sidney Fox studiò la formazione spontanea di strutture peptidiche in condizioni che potrebbero...