Appunti Laboratorio Quantitativo

HPLC

La cromatografia liquida ad alta prestazione (high performance liquid chromatography, HPLC) si sviluppò negli anni ‘60 al fine di

analizzare molecole che non potevano essere trattate dalla normale gas cromatografia. L’HPLC è l’evoluzione strumentale ad alta

efficienza della cromatografia liquida su colonna. Le principali caratteristiche dell’HPLC possono essere così riassunte: ↓diametro

particelle percolazione In conseguenza a ciò, è necessario aumentare la

⇒ ⇒ ⇒ ⇒

↑impaccamento ↑efficienza ↑resistenza ↓flusso

pressione per forzare il solvente attraverso l’impaccamento costituito da particelle fini.

Classificazione delle tecniche HPLC

1° metodo di classificazione (basato sulle fasi mobile e stazionaria):

cromatografia normale o a fase diretta (fase stazionaria idrofila, fase mobile lipofila);

cromatografia a fase inversa (fase stazionaria lipofila, fase mobile idrofila).

2° metodo di classificazione (basato sul meccanismo di separazione):

cromatografia di adsorbimento liquido-solido;

cromatografia di ripartizione liquido-liquido;

cromatografia di esclusione;

cromatografia di scambio ionico;

cromatografia di affinità.

Fase stazionaria

Il supporto più comune per la fase stazionaria è costituito da particelle microporose di silice di forma sferica. La silice non può

essere usata per pH > 12 in quanto si scioglie. Infatti, per 8 < pH< 12 si usano matrici polimeriche come il polistirene.

Funzionalizzazione della silice

La silice esterificata (1) è suscettibile all’idrolisi e pertanto non si può usare per fasi acquose o alcoli. Le fasi stazionarie più

stabili sono quelle con formula Si-O-Si-R e cioè con un legame silossanico (3).

La silice può essere funzionalizzata con diversi gruppi adatti per cromatografia a scambio ionico, ripartizione, ecc.

Fase stazionaria e pH

Fasi mobili acide (pH < 2) tendono ad idrolizzare i legami silossanici della fase stazionaria. Il problema si risolve inserendo

sostituenti ingombranti come l’isobutile.

La fase mobile

La scelta della fase mobile dipende dalla fase stazionaria (fase mobile lipofila in cromatografia normale e polare-mediamente

polare in fase inversa). I requisiti fondamentali che una fase mobile per HPLC deve avere sono:

bassa viscosità; i

mmiscibilità con la fase stazionaria;

capacità di solubilizzare il campione;

compatibilità con il rivelatore;

bassa corrosività;

bassa volatilità;

basso costo;

elevata purezza.

La forza ( ε°) è il parametro che definisce la forza di eluizione del solvente quando usato come fase mobile sul gel di silice. La

viscosità deve essere inferiore a 1.

Esempi di fase mobile: acetone, etanolo, metanolo, acido acetico.

Fattori strumentali

Eluizione di composti neutri: il tempo di eluizione di un composto neutro è determinato dal bilancio tra la sua polarità e la sua

lipofilia, mentre il pH della fase mobile non esercita alcun effetto. Nel caso della cromatografia a fase inversa, quanto più il

composto è lipofilo, tanto più è trattenuto dalla fase stazionaria, mentre la situazione si inverte nel caso della cromatografia a

fase diretta.

Eluizione di composti ionizzabili: è necessaria una fase mobile tamponata per ottenere gli analiti nella forma completamente

indissociata (cromatografia di ripartizione) o dissociata (es. cromatografia scambio ionico). Nel caso di analiti acidi, il pH deve

essere almeno di due unità inferiori al pKa per avere l’analita in forma completamente indissociata, mentre, nel caso di composti

basici, il pH deve essere maggiore di due unità rispetto alla pKa. Scelta della modalità di separazione

Sistema di pompaggio (pompa alternativa)

La pompa è costituita da un pistone in zaffiro traslato avanti e indietro da un motore elettrico connesso ad un manovellismo.

Quando il pistone è traslato verso sinistra, la depressione fa aprire la valvola a sfera inferiore consentendo l’aspirazione del

solvente. Quando, invece, il pistone è traslato verso destra, la sovrapressione fa chiudere la valvola inferiore ed aprire quella

superiore, spingendo il liquido in colonna. Lo smorzatore di impulsi compensa la discontinuità del flusso e di pressione dovuto al

movimento oscillante del pistone.

Sistema di smorzamento

Lo smorzatore di impulsi compensa la discontinuità del flusso e di pressione dovuto al movimento oscillante del pistone. Può

essere di diverso tipo:

sistema spirale: ad ogni colpo del pistone la spirale aumenta il diametro assorbendo l’energia della pulsazione;

smorzamento a membrana: una membrana separa la fase mobile da un liquido parzialmente comprimibile.

Pompa alternativa a doppia testata

Nella pompa alternativa a doppia testata, i due pistoni lavorano in opposizione, ovverosia quando uno comprime, l’altro aspira e

viceversa. L’onda di pressione risultante di una pompa è sfasata di 180 gradi rispetto all’altra. Come risultato, si ha una pressione

maggiormente costante.

Analisi quantitativa in HPLC

Metodi di analisi quantitativa in HPLC

Metodo dello standard esterno: per utilizzarlo si deve preparare le soluzioni di riferimento contenenti lo standard di analita (a

purezza certificata) mediante il metodo della diluizione progressiva; analizzare le soluzioni standard separatamente dal campione;

riportare le aree relative ai picchi delle soluzioni di riferimento in un grafico rispetto alle relative concentrazioni;

calcolare la retta di calibrazione col metodo dei minimi quadrati; analizzare il campione e, dal valore di area del picco (valore y) e

dall’equazione della retta di calibrazione, determinare la concentrazione (valore di x).

In alternativa, se è nota una risposta lineare in un determinato intervallo di concentrazioni, si può eseguire una calibrazione ad un

solo punto con una sola soluzione standard.

Diluizioni progressiva

La diluizione progressiva o seriale è un procedimento ripetuto per ottenere una diluizione geometrica o progressiva della

soluzione originale. Dal punto di vista pratico, nel caso di una diluizione seriale decimale, si parte da

una soluzione a concentrazione nota: nella provetta A, mettere 1 ml di

soluzione di partenza e aggiungere 9 ml di solvente (diluizione 1:10); nella provetta B, mettere 1 ml di soluzione A e aggiungere 9

ml di solvente (diluizione 1:10 rispetto ad A e 1:100 rispetto alla soluzione di partenza); nella provetta C, mettere 1 ml di

soluzione B e aggiungere 9 ml di solvente (diluizione 1:10 rispetto ad B e 1:1000 rispetto alla soluzione di partenza).

Standard esterno con calibrazione ad un punto

Una soluzione standard è preparata sciogliendo 103,5 mg di uno composto di riferimento in 500 ml di solvente.

Un’aliquota pari a 25 μl è iniettata in una colonna HPLC e l’area del picco risulta pari a 153885.

99,6 mg del campione da analizzare sono sciolti in 500 ml, 25 μl dei quali sono stati iniettati nella colonna.

l’aera del picco risultante è stata di 147906.

La concentrazione incognita si determina dalla seguente proporzione: As / Ar = Cs / Cr

dove: As e Cs sono l’area del picco e la concentrazione dello standard, mentre Ar e Cr sono l’area del picco e la concentrazione

dell’analita. Da cui deriva: Cr = Cs . Ar / A.

La concentrazione dello standard di riferimento è: 103,5 mg / 500 mg/ml = 0,21 mg/ml

La concentrazione di Cr è: Cr = Cs . Ar / As = 0,21 x 147906 / 153885 = 0,19 mg/ml

La quantità del campione nella soluzione incognita risulta: 0,19 . 500 = 99,6 mg.

Metodo dello standard interno: Il metodo dello standard interno permette di compensare gli errori analitici legati alla

preparazione del campione e all’analisi strumentale (es. variabili legate alla quantità di campione iniettato).

Rispetto al metodo dello standard esterno, prevede l’aggiunta di un composto chiamato standard interno a concentrazione nota,

sia alle soluzioni di riferimento, sia al campione da determinare.

Nell’allestimento della curva di calibrazione, si considera il rapporto delle aree tra analita/standard interno.

Qualora non si utilizzi uno spettrometro di massa come analizzatore, lo standard interno deve essere un analogo dell’analita e, in

particolare, deve:

• essere separato dall’analita e dagli altri componenti il campione;

• avere proprietà chimico-fisiche analoghe al campione;

• avere una risposta al detector simile all’analita;

• essere presente in una concentrazione dello stesso ordine di grandezza dell’analita incognito.

Metodo delle aggiunte standard: Il metodo delle aggiunte standard è utilizzato quando si vuole determinare la concentrazione di

un analita sciolto in una matrice che contiene sostanze che possono interferire con la risposta dell’analita al detector.

Si aggiungono quantità note e crescenti di standard a volumi noti e costanti della soluzione del campione incognito.

Normalizzazione: E’ un’analisi semiquantitativa che fornisce il contenuto % di un analita.

Si può applicare quando i componenti della miscela forniscono una risposta simile al detector.

Il risultato quantitativo è espresso calcolando l’area del picco dell’analita rispetto alla somme

delle aree dei componenti la miscela:

dove A è l’area dell’analita A.

Applicazioni dell’HPLC: ampicillin anhydrous, liquorice root (estratto di liquirizia), fluoxetine hydrochloride (prozac), antazolina e

nafazolina collirio soluzione, iodio unguento, camomilla estratto idroalcoolico.

Gascromatografia

Nella gascromatografia (Gas Chromatography, GC) la fase mobile è un gas permanente (carrier o gas di trasporto) che fluisce

attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. All’uscita della colonna è posto il rivelatore che, connesso ad un sistema

di registrazione, fornisce il gascromatogramma.

Perequisiti fondamentali

devono essere soddisfatti i seguenti criteri:

In GC è fondamentale che gli analiti possano essere vaporizzati per via termica e a pressione ambiente (principale limite).

I componenti della miscela, una volta vaporizzati, sono separati per effetto della ripartizione tra una fase gassosa mobile e una

fase stazionaria. La fase mobile

non interagisce con l’analita e

funge esclusivamente da

carrier.

La separazione dipende quindi

dalle caratteristiche chimico-

fisiche della fase stazionaria e

dalla temperatura.

Gascromatografo

Classificazione delle tecniche cromatografiche

In base allo stato fisico della fase stazionaria, la gascromatografia può essere classificata in:

gas solido

gas liquido

In base alle caratteristiche geometriche della colonna, la gascromatografia può essere classificata in:

a colonne impaccate;

a colonne capillari.

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