Istopatologia

ISTOPATOLOGIA

Lezione 1 - Intro e Overview

Lezione 2 – Fissazione, Inclusione, Taglio, EE

Struttura di un lab di anatomia patologica: lab che effettua diagnosi delle patologie

→si →

occupa di immunoistochimica (se vengono espressi marcatori di tipo vario), patologia molecolare, FISH, PCR

laboratori che se ne occupano sono: citologia (liquidi a cui si estraggono e analizzano le cellule), istologia, criotomia

(si congela campione per dare risposta in poco tempo 15/20 min) + autopsie, che con il tempo stanno diventando

una cosa a sé

Ogni cosa tolta durante un’operazione (prelievo), viene analizzata dall’anatomia patologica (→ interagisce w reparti)

→

Anatomia patologica≠ medicina legale anatomo patologo cerca la causa di morte principalmente naturale, se c’è

sospetto di morte non per causa naturale si sospende l’autopsia che passa alla medicina legale

Flusso di lavoro in anatomia patologica:

1. Accettazione, da parte del tecnico di lab di anatomia patologica; tecnico riceve campioni da strutture

ospedale, fa controlli, codice a barre, dati paziente, guarda campione x verificare se vede il campione e se si

tratta di quello descritto dal foglio che arriva insieme al campione (ad esempio arriva fegato e nel foglio c’è

scritto intestino), quindi si guarda forma, colore, ecc, e se conforme viene mandato avanti altrimenti viene

segnalata una non conformità

2. Descrizione macroscopica e dei dettagli del campione

In anatomia patologica arrivano tessuti e cellule, arriva il tessuto nello stato in cui era presente nel paziente, ma non

è più irrorato dai vasi e quindi va in contro a degenerazione del tessuto, quindi il campione deve essere conservato

(tramite fissazione o si può usare anche criocongelamento), e nella routine fissato, che quindi fa mantenere al

tessuto la morfologia e la struttura (mentre il congelamento può modificare il campione dato che per congelamento

si possono formare dei cristalli e si possono rompere le cellule) quindi manteniamo in questo caso: morfologia e

struttura, parte enzimatica e antigenica

Fissazione avviene per reazione tra fissativo e molecole del tessuto mantenendolo nello stato + vicino alla condizione

fisiologica/fisiopatologica

→obiettivi:

• Impedire autolisi dei tessuti e crescita microrganismi

• Fissare tessuti in modo che non cambino volume e forma durante processazione

• Preparare tessuto e lasciando in condizione (integra) che permette colorazione delle sezioni

• Mantenere tessuto vicino al suo stato di vita x non perdere nessuna molecola, nel tempo

• Rendere il tessuto inalterabile

*formalina, fissativo x eccellenza, antibatterico e antifungino

Fissativi ce ne sono tanti, ma nella pratica clinica usato solo (formalina), economico, facile da usare, fissa bene, ma è

cancerogeno

(In anatomia patologica si ha un potenziale rischio biologico: il problema microbiologico si presenta solo quando

arrivano tessuti a fresco, altrimenti gli altri sono tutti sotto formalina che è antimicrobico; e un potenziale rischio

→ci

chimico, confinato alla fissazione) sono barattoli per i campioni che quando chiudi schiacci bottone che fa

scendere la formalina e ogni tanto dentro c'è anche l'olio che essendo immiscibile con la formalina rimane in

superficie e non la fa evaporare

Come viene bloccata la lisi cellulare? Praticamente la formalina forma dei legami, un reticolato tra le proteine dei

tessuti in modo da formare una rete e bloccare tutto, quindi anche occupare le tasche degli enzimi

Fattori che influenzano la fissazione: fissazione è processo che blocca l'autolisi

principale fattore: Penetrazione del fissativo, a cui partecipano altri fattori come pH, tempo, temperatura

→ la parte superficiale sarà + fissata, l'H2O andrà verso l'interno, ma comunque la formalina raggiunge l'interno del

tessuto →

TEMPO, se non lascio abbastanza il tessuto in formalina necrosi dei tessuti centrali in cui si sono attivati enzimi x

morte e degenerazione cellulare

Aumentando TEMPERATURA aumenta anche la velocità di propagazione della formalina, ma aumenta anche attività

enzimi litici, perciò, si abbassa la temperatura x rallentare si il fissativo, ma molto di + gli enzimi litici

MA (Biopsia prostatica è sottilissima quindi posso alzare la temperatura senza deteriorare il campione essendo esso

molto piccolo, ci mette meno la formalina a bloccare tutto che gli enzimi litici ad attivare e degradare il tessuto)

Le temperature utilizzate: tra 0-4°C (se creo situazione di sottovuoto blocco quasi totalmente enzimi litici, con buste

sottovuoto)

PH OTTIMALE, pH 6-8, vengono utilizzati sistemi tampone

Esempio: tessuto tumorale grande e troppo morbido da tagliare (faccio qualche taglio profondo per far arrivare

subito la formalina anche al centro), prefissazione di 2/3 ore x permettermi di fare prelievo xk tessuto un po' + rigido,

e poi rimette a fissare (penetrazione del fissativo garantisce buona fissazione)

Fissativi: si usava anche il mercurio, ma ora si usano formalina(formaldeide)>paraformaldeide>glutaraldeide (-> in

ordine di velocità, perciò formalina + usato)

→ spessore del campione è ovviamente fondamentale, dimensioni per biocassetta, quindi prelievo:

2lunghx2larghx0,5 di spessore cm

TEMPO:

▪ Ipofissazione, mi fa perdere sia antigenicità (xk antigene non c'è +, per lisi) e mi fa perdere morfologia

→necrosi

tessuto

▪ Iperfissazione, problema antigenico (fissativo blocca antigene proteico e punti a cui l'anticorpo si sarebbe

legato perciò non si può legare, l'antigene è quindi mascherato dal fissativo)

Formalina è il gold standard, fissativo x eccellenza dell'istologia

Formalina in natura è un gas, non esiste al 100%, dipende quindi quanto posso saturare la soluzione, io posso

→In

saturare una concentrazione fino al 40% lab si usa 10% (del 40%) quindi la concentrazione della soluzione di

lavoro è al 4%

Amminoacidi della formaldeide: lisina, cisteina tirosina, serina, glutammina formano complessi reattivi che possono

combinarsi tra loro formando ponti di metilene (cross-link) o con gruppi idrogeno

H2O corrente (del rubinetto, ad esempio, essendo pieno di cariche quindi di ioni calcio, essi si vanno a legare ai ponti

→si

disolfuro non legati ancora bene, gli ioni si portano via questi ponti evita iperfissazione perché vengono tolti

residui di formalina) può revertire la formazione di alcuni ponti

Pericoli associati a uso della formaldeide, irritante, corrosiva, può causare sensibilizzazione allergica; è stata elencata

→

come "cancerogena per l'uomo" cancro nasofaringeo, cancro sinonasale e leucemia mieloide

→

Glutaraldeide, fissativo + forte, forma legami + forti e + rapidamente ma + lenta a penetrare nel tessuto, perciò

usata formalina →

Fissativi mercuriali, in generale poco o niente usati non usato oggi

Alcol (metanolo o etanolo) usato x disidratare (togliere acqua) tessuto e inducono indurimento; per passare da un

liquido ad un altro devo utilizzare intermedi a concentrazioni scalari

Diafanizzazione da alcol a paraffina, utilizzo xiloro, tanto solubile in H2O che in paraffina, poi campione posso

metterlo in paraffina

Alcol denatura proteine, fa perdere funzione enzimi litici, ottimo fissativo (per la citologia) ma questa coagulazione

delle proteine (denaturate) mi rovina la morfologia

Esame estemporaneo: su campioni freschi inviati al lab durante un'operazione chirurgica, risultato entro 15 minuti

→ problema, perdiamo morfologia e si formano i cristalli ed esplodono le cellule xk l'acqua quando ghiaccia si

→utilizzo

espande quindi azoto liquido a temperature molto basse + isopropanolo x non far bruciare il tessuto

(congelamento a -80)

→si taglia con criostato a -20°C

Cryo-preservazione quasi esclusivamente x esami intra-operatori (x colorazione e studio attività dei lipidi che sono

solubili in alcol 100% che quindi li scioglie, anche la paraffina li scioglie, perciò è più comodo studiarli in questo

modo); è veloce e non altera struttura proteica ma è tecnicamente complesso e ha una conservazione limitata nel

tempo

*4% di formaldeide nella soluzione al 10% del laboratorio, inoltre in questa soluzione c’è tampone per mantenere pH

soluzione (perché la soluzione con formalina tende a diventare acida)

Formalina: formazione reticolato proteico catalizzando ponti metilenici tra amminoacidi presenti nelle proteine (sia

all’interno della stessa proteina, sia tra le proteine vicine della cellula come il citoscheletro)

→reazione →rompo,

“reversibile” per i legami: blocco legame parziale (per revertire legame non è una vera

reazione di reversione perché rompo legami parziali)

→legami metilenici chiamati cross-link

Il lavaggio con acqua corrente serve per la parte superficiale che può risultare iperfissata e i legami sono + deboli,

quindi per non coprire troppo gli antigeni si esegue il lavaggio

In chirurgia, durante un’operazione invece di utilizzare barattoli di formalina che possono risultare tossici, il

frammento del campione viene messo in un sacchetto sottovuoto, mantenuto in frigo e poi mandato in anatomia

patologica per lavorazione con formalina

Flusso di lavoro: →descrive

Fase macroscopica macroscopica campione

→prelievo

Fase di riduzione o prelievo della parte di interesse di lesioni ecc, tagli devono entrare nelle biocassette

Fissazione può avvenire prima (processazione diretta) del prelievo o dopo (va messo in formalina)

Processazione del tessuto: aumentare resistenza al taglio per permettere di tagliare sezioni sottili

Campione in formalina, lavo con acqua corrente per iperfissazione e devo processare campione

→disidratazione: alcol toglie acqua per prenderne il posto all’interno delle cellule (alcol e acqua sono solubili qindi è

facile prenderne il posto), ma alcol non è solubile in paraffina, quindi, ha bisogno di un mezzo che sia solubile sia in

alcol che in paraffina: xilene

→chiarificazione: xilene dissolve l’alcol; passaggio tra alcol e paraffina ma dato che alcol non è solubile in paraffina

uso xilene che è solubile in entrambe (xilene è estremamente tossico, si usano altri solubili come il noxi, non tossico)

→inclusione: paraffina, prende il posto dello xilene; paraffina è la cera delle candele, più pura al 100%. Ha come

temperatura di fusione 55/60°C, liquida poco viscosa e solidifica tutto il tessuto insieme perché è stato trattato

Procedimento: prendo i campioni, non tanti, si

mettono su piastra dell’inclusore, piastra calda (x

mantenere paraffina liquida), apro la cassettina

mettendo la parte del numero verso l’inclusore

(perché coperchio può saltar via e cadere a terra o

addosso img2), si sceglie la formella (in acciaio)

idonea al campione della biocassetta (img3), poi mi

metto al centro in uno spazio dove è refrigerato

(quando si va a tagliare al microtomo, per

formazione vetrino , comincio a tagliare da sotto il

blocchetto, quindi quando devo includere il

campione devo cercare di spingerlo il più possibile

verso il fondo, in modo da facilitare sgrossamento

img3 spingo campione). In questo spazio refrigerato

dopo aver spinto campione, lo includo in paraffina

che solidifica subito, metto coperchio e riaggiungo paraffina liquida (xk paraffina quando solidifica si restringe e

→

quindi fare ulteriore strato sopra) metto formella nella piastra refrigerata

Infine, paraffina ben solidificata, si stacca campione da formella in acciaio ed è pronta per taglio e sgrossamento

Nei processatori, ci sono i primi due passaggi per la formalina ma non vengono usati per problemi di sicurezza,

perché non lavoro sotto cappa ed è pericoloso mettere formalina nelle taniche quindi faccio solo altri passaggi;

formalina fatta prima sotto cappa

Procedimento: 1,2 (formalina che non si fa),3,4,5,6,7,8 (alcol 80%, 95%,95%,100%,100%,100%), 9,10 (xylene 100%,

100%), 11, 12, 13, 14 (paraffina)

Il taglio: vengono usati due tipi di microtomi, rotativo e a slitta; cambia se si muove il campione o la lama

Rotativo si muove il campione / a slitta il campione sta fermo e si muove la lama

In questa sezione ci sono:

- Piastra refirgerante 20°C

- Bagnetto caldo

- Vaschetta acqua fredda

Taglio prevede due fasi: sgrossamento, in cui si toglie la paraffina per arrivare al campione, con spessore + elevato

→taglio

come 10 micron, finché non si arriva sul campione 3/ 4 micron che è il taglio standard che si fa x campione

*ritaglio: quando viene richiesto il taglio di un campione x ulteriori accertamenti, campione già sgrassato ma ogni

volta che taglio cambia sempre un po’ l’inclinazione; quindi, bisogna allineare on base al campione

Dopo il taglio di campione

→Acqua fredda mi consente di aprire la sezione soprattutto se è arrotolata e si possono eliminare pieghe presenti

nelle sezioni, grazie ad un pennello e un vetrino che poi si ristacca e mano a mano la si tira senza rovinarla

→Faccio aderire sezione sul vetrino per capillarità e sposto il vetrino con campione in acqua calda da cui la sezione si

stacca dal vetrino, a 38/40°C la paraffina si allarga quindi si allarga la sezione che galleggia in questo bagnetto

Vetrini utilizzati:

• Carica positiva, trattengono + forte sezione su vetrino e lo uso quando mi serve una particolare tecnica su

quella sezione, come ad esempio l’immunoistochimica (la sezione così non si stacca)

• Vetrino normale, non carico, x colorazioni semplici basta questo vetrino ma si può usare anche quello a

carica positiva (che costa di + quindi non conviene)

Ottenuto il vetrino con la sezione metto il vetrino in stufa a 60°C x 20 min, un po’di paraffina in eccesso si toglie ma

lo faccio per far aderire bene la sezione al vetrino (quando raccolgo vetrino rimane un po’ di acqua che in questo

modo faccio evaporare) MA perché faccio questo passaggio? Perché poi il vetrino torna in xilene e in questo modo la

sezione si staccherebbe dal vetrino (perché acqua si impasterebbe con xilene)

Arrivati alla paraffina, tutte le metodiche che si fanno dopo (ibridazioni in situ, colorazioni, ecc) le faccio tutte con

→

solventi acquosi e quindi devo rifare la scala al contrario con il vetrino questa volta ( xylene, alcol, acqua) si toglie

paraffina e si reintroduce l’acqua

Ematossilina & Eosina

Colorazione base, la + utilizzata x fare diagnosi microscopica →

Ematossilina colorante basico, che colora molecole acide di blu (acidi nucleici) acidofilo →

Eosina colorante acido, che colora molecole basiche di arancio/rosso (citoplasma e proteine) basofilo

→Risultato: nuclei blu e citoplasma rosa/arancio →

Un colorante è specifico, l’ematossilina (legame molto forte, non lo tolgo con niente) viene fatto prima quindi x

circa 4 minuti; mentre l’eosina è aspecifico quindi colora tutto dopo

→Per questo faccio prima quello specifico senno quello aspecifico mi colora tutto →

Lavo in acqua corrente almeno il doppio del tempo della prima colorazione (se ematossilina 4 min lavo in acqua x

8 min) perché l’acqua corrente carica di ioni che tolgono ematossilina che ha legato in modo aspecifico quindi legami

→differenziazione

non saldi, tolgo residui

*Non in tutti i posti l’acqua è piena di ioni quindi in questi casi si usa acido cloridrico in acqua x caricare l’acqua

Poi si colora con eosina (aspecifico, che colora tutto in rapporto alla densità del campione) dove ci sono organelli +

scuri, dove ci sarà solo citoplasma saranno + chiari

Faccio le metodiche che mi servono (es. immunoistochimica) e volendo posso rendere il campione PERMANENTE,

facendo nuovamente una processazione da acqua a xylene:

➔ Rendere permanente un vetrino: Mentre l’ematossilina non si toglie, l’eosina è solubile in acqua quindi i

lavaggi (processazione da acqua in alcol devono essere molto veloci altrimenti si portano via tutta l’eosina,

gli altri + lenti). Torno quindi allo xilene e faccio questo processo al contrario x montare un vetrino (x mettere

resina solubile in xilene sul vetrino, questa resina attacca copri oggetto al vetrino e soluzione colorata si può

preservare anche x 15/20 anni)

Lezione 3 – Immunoistochimica

Tecnica x rilevare presenza di specifici marcatori proteici che possono classificare e stadiare i tumori

Vengono utilizzati anticorpi:

- Policlonali, riconoscono diversi epitopi di una proteina

- Monoclonali riconosce solo un epitopo (si evita errore perché il policlonale può selezionare epitopo che non

fa parte della proteina di interesse)

Fissazione: impedire degradazione degli antigeni (del tessuto), mantiene la loro distribuzione spaziale, formalina può

mascherarmi questi ant