Istopatologia

Recap: Quali sono i marcatori prognostici?

Come marcatori non possiamo indicare solo i biomarcatori ma dobbiamo prendere in considerazione anche dimensione del tumore, isotipo, metastasi, ecc...

I biomarcatori si studiano con immunoistochimica; essa identifica componenti specifici del tessuto per mezzo di una reazione antigene-anticorpo.

Ripasso di: selezione anticorpi, fissazione, taglio, smascheramento antigenico, blocking, metodo diretto, metodo indiretto, immunoenzimatica, fluorescenza, multiple labeling, controlli (in situ: nel contesto morfologico del tessuto).

Lezione 4 - Istochimica

L'istochimica (tantissime colorazioni con tante modifiche) è la chimica nel contesto dei tessuti biologici, un insieme di tecniche utilizzate per visualizzare le strutture biologiche. Avviene prima dell'immunoistochimica, lega l'istologia, la chimica/biochimica.

4 LEGGI dell'istochimica:

1. La sostanza da studiare non deve diffondersi dal sito di origine
2. Se faccio colorazione...

1. La precipitazione deve essere insolubile e non deve diffondersi. Il microrganismo viene messo in evidenza aggiungendo un substrato che forma un precipitato che rimane sul posto. Tuttavia, bisogna fare attenzione perché in alcune sostanze questo precipitato potrebbe diffondersi.

2. Il prodotto della reazione deve essere insolubile, colorato o elettrodenso. La precipitazione deve essere insolubile e visibile all'occhio umano. Può presentare una gamma di colori e deve essere abbastanza denso da creare un contrasto rispetto allo sfondo.

3. Il metodo utilizzato deve essere specifico per il gruppo o i gruppi chimici studiati. Si utilizzano coloranti che colorano specificamente ciò che si desidera evidenziare.

4. La procedura non deve denaturare o bloccare i gruppi reattivi. La procedura comprende tutte le fasi di preparazione del campione, come la disidratazione, la fissazione, il taglio, ecc. Questo vale sia per la fase preanalitica che per quella analitica.

Colorazioni

più utilizzate: Colorazione di PAS – Saccaridi Utilizzata per rilevare presenza e accumulo di glicogeno nei tessuti (nei tessuti per forza sono presenti i carboidrati, in alcuni più di altri) → spesso usata per rilevare contaminazione batterica e funghi, perché i microrganismi formano glicocalice esterno (di carboidrati) L'elemento base di questa colorazione è l'acido periodico perché se faccio la colorazione di PAS senza questo passaggio i carboidrati non si colorano L'acido periodico ossida i carboidrati del tessuto esponendo i gruppi aldeidici, i quali poi reagiscono con il colorante che precipita e forma colorazione rosso vivo/magenta Perché viene utilizzata? Per microrganismi e per patologie rare come malattie da accumulo di glicogeno, adenocarcinomi, sarcoma alveolare, colorazione macrofagi nel morbo di Whipple NON si colora con E&E Le fibre di collagene (con o senza fibre elastiche) costituiscono la maggior parte del

tessuto connettivo denso→ disposte in modo preciso (tendini, cornea) o meno (intestino, pelle)

L'alterazione di produzione o di distribuzione spaziale di fibre di collagene porta a molte patologie, compreso cancro

Tricromica di Masson 3 coloranti per selezionare muscoli, fibre di collagene, fibrina ed eritrociti→Regola: i tessuti meno porosi sono colorati dalla molecola di colorante + piccola;colorante di grandi dimensioni penetra a spese della molecola + piccola

Muscolo, globuli rossi→ rosso

Fibre, collagene→ blu→Nuclei nero

Si usa soprattutto anche per vedere i vasi e se ci sono problemi/deformazioni nei vasi

Perché è una colorazione tricromica?

Per distinguere collagene da muscolo; muscolo è + facile da vedere se seziono in modo trasversale, riconosco subito le fibre muscolari (se muscolo sezionato in modo trasversale e coloro con E&E, esso si confonde con il collagene)

Usata per diagnosi di cambiamenti fibrotici, malattie neuromuscolari

tumori di origine muscolare NON si colora con E&E Tricromica di Gomori, colorazione nera, sono colorazioni argentiche (usano argento)

Le fibre di reticulina sono comuni nel fegato, milza e nei reni e questi modelli della reticulina possono aiutare a diagnosticare la cirrosi epatica, fibrosi midollo osseo e tumori delle cellule che rivestono vasi sanguigni, fibroblastici, tumori dei muscoli, ecc..

Pentacromica di MOVAT, per studiare tessuto cardiaco, vasi sanguigni e malattie vascolari e polmonari → Eccellente differenziazione delle fibre di collagene, elastiche, fibrina e muscolari

Colorazione di PERLS Si usa il blu di Prussia che evidenzia la presenza di Ferro nei tessuti (o nei campioni in generale, nella citologia)

Perché si usa spesso nella citologia? Perché spesso tra i campioni si ha il broncolavaggio (che si porta dietro le cellule poco adese, come ad esempio cellule tumorali → essendo e cellule infiammatorie) un campione proveniente dai polmoni (polmoni e cute sono

i primi tessuti/organi che vengono a contatto con gli inquinanti)

Inquinante: inalazione fibre di asbesto/amianto (minerale fatto di ferro e silicio) che possono causare carcinoma polmonare

I residui di ferro presenti nel campione reagiscono con il ferrocianuro di potassio che forma blu di Prussia insolubile (ferrocianuro ferrico idrato)

Tessuto adiposo →NON

Negli adipociti c'è goccia lipidica che è solubile in alcol e paraffina si fa perché se vogliamo vedere tess adiposo, la goccia lipidica si scioglie e non la vediamo, vediamo uno spazio bianco al posto di essa. QUINDI si usa tetrossido di osmio che ossida la componente lipidica (cosicché non sia solubile in alcol e paraffina)

Sudan III, colora lipidi da rosso a rosso-giallastro
Oil Red O, colora lipidi da rosso ad arancione rossastro
Sudan Black B, colora lipidi di nero

Perché studio i lipidi?

Perché ci sono patologie da accumulo di lipidi, si può valutare stetosi epatica (fegato)

grasso in cui c'è anomalo accumulo di trigliceridi)

I coloranti che vengono usati sono coloranti spesso affini agli acidi grassi

Colorazione per DNA

Feulgen (DNA) Si tratta di un intercalante del DNA, usata per identificare materiale cromosomico o DNA nei campioni di cellula

A che ci serve? Perché la quantità di DNA mi dice quanto si replica la cellula, esempio nella cellula tumorale si replica tanto e spesso ci sono + nuclei nella stessa cellula perché non fa tempo a dividersi

Perché questa colorazione non viene molto usata ma si preferisce la E&E?

Perché faccio la E&E per vedere dei colori quindi se nucleo è pieno di DNA lo vedo tanto blu

Colorazioni per microrganismi:

Ziehl-Neelsen Colorazione acido-esistente (colorazione magenta), ci sono modificazioni che riescono a distinguere i sottotipi di Micobatteri (tubercolosis, ulcerans, leprae, ecc)

Mycobacterium tubercolosis, batterio aerobico che richiede tanto ossigeno, infatti si

ritrova poi nei polmoniLa parete dei micobatteri contiene lipidi che li rende cerosi, idrofobici e impermeabili a colorazioni GramWarthin Starry Silver H. pylori infettano lo stomaco, presente nella metà delle persone nel mondo, può essere causa di stress, gastriti e può dare ulcere peptidicheIn questo caso si tratta di colorazioni argentiche che li colorano di nero, si usano nitrato d'argento*Pannello, tutti quei kit che servono x quella diagnosi o pannello custom (scelto da me, sostituzione fatta da me nel pannello)RECAPIstologia si basa sulle colorazioni- coloranti acidi- coloranti basiciPrincipale: E&EIstochimica: chimica nel contesto dei tessuti biologici; insieme di tecniche utilizzate per visualizzare le strutture biologiche→ imaging di cellule e tessuti usando la microscopia4 leggi istochimicaColorazione -> reazione di PAS: acido periodico ossida carboidrati del tessuto per produrre gruppi aldeidici; questo gruppo si condensa con il reagente xrosso x dimostrare componente del tessuto con attacchi dicarboidrati. La distasi e l'a-amilasi nel reagente reagiscono sul glicogeno e lo polimerizzano in unità di zucchero +piccola (maltosio e glucosio) che vengono lavate fuori dalla sezione(alcuni microrganismi hanno glicocalice che si colora di rosso magenta)→SudanTessuto adiposo III Lezione 5 – Microscopia Il microscopio ottico è un microscopio che usa la luce visibile e un sistema di lenti x generare immagini ingrandite di piccoli oggetti. Microscopi ottici inventati nel XVII secolo La luce si comporta in maniera differente x quello che vado a vedere→Campo elettrico e magnetico propagazione nello spazio→Effetto fotoelettrico x cui la luce interagendo con elemento metallico è in grado di far espellere elettroni dall'elemento metallico (metallo: i suoi atomi non sono separati, condivide elettroni tutti insieme, per cui conduce corrente elettrica, se gli elettroni non

fossero condivisi non conduce); la luce deve avere una massa quindi per farespellere elettroni

Louis de Broglie: →la spiegazione migliore sulla luce: la luce è sia un'onda elettromagnetica che una particella (fotone) ladefinizione, quindi, è moto di una particella associato al movimento di un’onda elettromagnetica

Interazione della luce con la materia:

Nel grafico della rifrazione c’è anche lo specchio quindi la riflessione, l’onda elettromagnetica colpisce lo specchio ese la rifrazione è perfetta i gradi coincidono; ma ci interessa poco, ci serve la diffrazione, fenomeno per cui quandoun’onda elettromagnetica passa tra due mezzi di diversa densità, da uno + bassa a uno + alta, rallenta (es. lucedall'aria al vetro rallenta) e cambia la sua direzione, cambia angolo di incidenza (cucchiaino dentro l’acqua che da→fuori sembra spezzato) di cosa sono fatti i microscopi? Di lenti, di cosa sono fatte le lenti? Vetro

Inferenza,

importante xk mi può dare artefatti quando guardo vetrino, nel microscopio ho la luce bianca ma ognitanto vedo dei colori (guardando in una bolla di sapone vedo l’arcobaleno, perché all’inizio entra luce bianca e poivedo l’arcobaleno? Perché quando la luce entra, viene deviata attraversando questo mezzo e interagiscono dando→fenomeno di interferenza nella bolla non si vede tutto l’arcobaleno ma in base all’inclinazione vedo i rossi, o i→blu/verdi, ecc..) succede perché ci sono tante lenti e a forza di deviare la luce ogni tanto si vede qualche colore

Polarizzazione della luce, ci sono molecole che se arriva luce non polarizzata (che si muove in tutti i campi dipropagazione come sole e lampadine), attraversano filtro che seleziona solo una via di propagazione

Le lenti ottiche La lente convergente focalizza in un unico punto i raggi paralleli