Compendio di appunti di istopatologia

CHIARIFICAZIONE E IMPREGNAZIONE IN PARAFFINA.

PROCESSAZIONE

a. La processazione ha lo scopo di far si che tessuto che precedentemente è stato fissato in

formalina (a contenuto acquoso) possa essere incluso in paraffina. Esso la paraffina

idrofobica è necessario disidratare il tessuto attraverso scale alcoliche crescenti. Questa

procedura è definita DISIDRATAZIONE.

DISIDRATAZIONE

b. La disidratazione avviene prima di mettere paraffina il tessuto. Per disidratazione s'intende

un agente chimico anidro nel quale viene immerso il tessuto. Nella disidratazione gli

obiettivi sono : sostituire l'acqua nei tessuti, no coartazione dei tessuti, solubile e miscibile

con solventi intermedi. Durante tale processo il pezzo viene messo in scala con

concentrazioni crescenti di alcool etilico ( 50 70 100 % di alcol) e successivamente avviene la

chiarificazione.

Successivamente alla disidratazione vi è il processo della chiarificazione.

CHIARIFICAZIONE

c. La CHIARIFICAZIONE o DIAFANIZZAZIONE è importante per reidratare e colorare il

tessuto. Nella chiarificazione viene rimossa completamente la paraffina.

Questa operazione viene compiuta da un agente detto appunto chiarificante . E' un

composto intermedio solubile nelle soluzioni disidratante e impregnate : questo agente

chiarificante è lo XILOLO.

NB: la chiarificazione permette, inoltre, di omogenizzare il tessuto e renderlo più

impregnabile . Downloaded by francesca lako (francescalako@icloud.com)

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Le due fasi sopra descritte sono fasi che vengono svolte in modo automatico da uno

strumento chiamato processatore, il quale successivamente al termine del lavoro

impregna in paraffina.

IMPREGNAZIONE

d. La PARAFFINA è una miscela di idrocarburi saturi ad elevato peso molecolare nonchè il

mezzo di inclusione più utilizzato. (Non viene utilizzato per microscopia elettronica, ma si

usano resine ipossiliche o acriliche con funzione di compattare e rendere sezionabile il

tessuto). A temperatura ambiente la paraffina la troviamo solida. Ha una temperatura di

fusione compresa da 56-58°C (in laboratorio vi è uno strumento particolare che la riscalda e

quindi la scioglie). Dopo che è stata sciolto un operatore dispensa la paraffina nel

blocchetto in cui vi è il campione tissutale da analizzare e viene lasciato raffreddare. Questa

operazione viene compita da un operatore e quindi manualmente in quanto sono importanti

procedure in cui viene orientato il pezzo e ciò è di fondamentale importanza per andare a

sezionare ed analizzare ciò che è di nostro interesse. Alcune caratteristiche della paraffina

sono di: essere insolubili in acqua e alcol , ma sono solubili in sostanze chiarificanti (es.

xilolo). La caratteristica di essere solubile in xilolo è importante al fine di compiere

nuovamente la chiarificazione e ciò serve per compiere la colorazione che altrimenti non

verrebbe.

Il tessuto, una volta impregnato di paraffina liquida, diventa un tessuto compatto, elastico e

rivestito di un mezzo solido e ciò diventa un blocchetto.

E' bene fare attenzione a: l'inquinamento del campione , all'orientamento dei tessuti e

al livello del materiale incluso (se è presente in più frammenti).

TAGLIO (allestimento di sezioni microtomiche)

4. Il taglio delle sezioni istologiche viene eseguito con il microtomo che ci permette di tagliare

sezioni spesse 4-6 μm. I maggiori problemi legati all'utilizzo del microtomo sono : lo spessore

delle sezioni e l'angolo e filo della lama.

IL MICROTOMO

Cos'è ? Un micròtomo è uno strumento per mezzo del quale vengono realizzate sezioni

istologiche di campioni di tessuto animale o vegetalecome pure di altri materiali anche non

biologici, per esempio sezioni sottili di rocce e ghiacci, con appositi e diversi apparati.

Tipologie :

Il microtomo in istologia e microscopia ottica

• Il sezionamento di un tessuto è una delle procedure più importanti per lo studio istologico.

Perché un tessuto sia analizzabile tramitemicroscopio ottico, deve essere tagliato in fette

molto sottili, in modo da permettere alla luce di attraversarlo. Con un microtomo, si

riescono a realizzare sezioni di meno di 10 μm di spessore, in media 4.

Esistono due tipi di macchinario per questo scopo a seconda della preparazione del

tessuto: microtomo e criostato.

Il microtomo che può essere costruttivamente rotatorio, a slitta o a cuscinetti lineari,

manuale o motorizzato, è destinato a tagliare campioni precedentemente trattati e inclusi

in paraffina . Il processo di inclusione serve a rendere il tessuto maggiormente consistente

al taglio. Downloaded by francesca lako (francescalako@icloud.com)

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Il criostato, generalmente a meccanismo rotatorio, congela il campione di tessuto e

permette in questo modo il taglio di questo in forma congelata. Gli esami di tessuti

sezionati col criostato vengono usati dove una risposta istologica a scopo medico-

diagnostico è necessaria entro tempi brevi (circa 30 minuti contro 1 - 2 giorni in paraffina)

per permettere al chirurgo di definire la parte eventualmente da asportare durante il corso

di un intervento.

Microtomo in microscopia elettronica a trasmissione

• Per preparare campioni destinati ad essere analizzati tramite microscopio elettronico a

trasmissione (TEM), si utilizza l'ultramicrotomo, uno strumento concettualmente simile, in

grado di eseguire sezioni anche più sottili (fino a poche decine di nm) in resina, previa gli

usuali trattamenti di fissazione desidratazione diafanizzazione. Le sezioni vengono fatte

flottare in acqua od altri liquidi, e raccolte su di una reticella metallica, eventualmente

rivestita da una sottile pellicola di carbonio.

In tutti questi strumenti generalmente il campione da sezionare viene fatto avanzare da un

meccanismo micrometrico mentre la lama si muove a tagliare con le varie modalità elencate.

Nei sistemi motorizzati in genere è la lama ad avanzare.

La lama può essere simile ad un rasoio a mano, intercambiabile (come un rasoio a lamette) per il

taglio in paraffina, in vetro o minerale, anche in diamante per le sezioni ultrafini ed in resina,

rotante, diamantata e laser, per usi petrografici e geo-paleontologici. A seconda dello spessore e

quindi dell'uso, le sezioni si classificano in: spesse, normali, semifini, ultrafini. Recentemente, è

stato commercializzato ed utilizzato (2007) un microtomo laser, operante nel vicino infrarosso, per

usi biologici. Lo strumento, un laser a femtosecondi guidato da un sistema di scansione,

distrugge termicamente un piano di circa un micrometro, permettendo di ottenere sezioni da 5 a

100 μm. Permette anche sezioni non piane, secondo superfici desiderate.

Le sezioni ottenute in tutti i casi vengono variamente trattate per evidenziare le strutture

microscopiche con opportune procedure di laboratorio (eliminazione del materiale di

inclusione, colorazione, rimozione di particolari micro-strutture, esecuzione di reazioni chimiche

volte a rivelare particolari composti, eccetera).

COLORAZIONE (uso delle reazioni chimiche )

5. MONITORAGGIO

6.

DIAGNOSI INTRAOPERATORIA: è un esame istologico che viene effettuato in corso di intervento

chirurgico. Viene eseguito attraverso diverse procedure quale :

Fissazione per mezzo di congelamento (fissazione fisica) di materiale a fresco

1. Taglio al criostato

2. Colorazione : blu di Toluidina ed Ematossilina

3.

-Eosina rapida. Le indicazione per eseguire tale

procedura sono :

Confermare la natura della lezione

1. Indicare la operabilità

2. Radicalità dell'intervento

3. Efficacia dell'intervento.

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CITOLOGIA

La Citologia studia le caratteristiche morfologiche delle cellule. Si divide in: ESFOLIATIVA ed

AGOASPIRATIVA .

ESFOLIATIVA

a. la citologia esfoliativa si occupa più di screening. Si divide in DIRETTA( espettorato, urina,

veramento, liquor) ed INDIRETTA(screening come per es. paptest) .

AGOASPIRATIVA

b. Può essere eseguita sotto guida Eco TAC oppure a mano libera.

ALLESTIMENTO DI PREPARATI CITOLOGICI

ALLESTIMENTO DEL MATERIALE.

1. l'allestimento del materiale può avvenire attraverso : striscio (citologia agoaspirativa ,

versamenti , scraping o brushing), strato sottile (citologia cervico-vaginale), citospin

(urine), citoincluso.

FISSAZIONE

2. La fissazione può avvenire per mezzo di : fissativi liquidi (come ad es. etanolo al 95% con

EDTA, formalina tamponata , metanolo + acetone), a pellicola attrverso l'utilizzo di

areosol (pray) cioè uno spray di alcol etilico oppure altro tipo di fissazione è quello per

essicamento. Quest'ultimo viene usato soprattutto per compiere colorazioni che non

richiedono fissazioni come per es. may gunward- gimsa, colorazione di blu toluidina.

COLORAZIONI

3. Secondo Papanicolau

• EE

• Blu di Toluidina

• May-Grünwald – Giemsa

•

CELL BLOCK

Alcune volte le agoaspirazione vengono messe su vetrino , mentre il residuo nell'ago viene

lavato in soluzione lisante fissativa , si aggiunge sangue alla provetta e trombina e si forma un

coaugulo che intrappola le cellule e tutto viene fissato in formalina che si indurisce ed incluso in

paraffina. Il vantaggio di questa procedura ci permette è che ci trattare il materiale citologico

come se fosse materiale istologico e farne sezioni e quindi colorarlo. Questa procedura è

denominata CELL BLOCK.

LE PRINCIPALI REAZIONI IN ISTOCHIMICA

le reazioni in istochimica possono essere :

BASOFILA : vi è una affinità di un substrato istologico per un colorante basico. Il

• gruppi amminici (-NH2) che funzionano da cationi.

colorante basico contiene

ACIDOFILA: vi è una affinità di un substrato istologico per un colorante acido. Il

• colorante acido ha gruppi

carbossibilici (-COOH) che funzionano da anioni.

I MECCANISMI DI AZIONE DEI COLORANTI

Esistono diversi tipi di colorazione : chimiche, fisiche , chimico-fisiche.

COLORAZIONI CHIMICHE :in esse si ha una reazione tra colorante e substrato

• attraverso legami chimici specifici come nel caso delle colorazioni istochimiche.

COLORAZIONI FISICHE : si sviluppano attraverso meccanismi fisici tra colorante e

• substrato. Questi

legami fisici che avvengono tra substrato e colorante sono : solubilità, diffusione e

imbibizione , impregnazione.

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COLORAZIONI CHIMICO-FISICHE: Le colorazioni chimico fisiche possono avvenire per

• mezzo di due

tipologie di assorbimento: ASSORBIMENTO ELETTRICO in cui vi è la formazione di Sali

tra strutture elett