Appunti istologia e embriologia

Citologia

Lezione 1: Introduzione alla citologia

Cellule di varia grandezza (10-50 micrometri), tipo (eucariote, procariote). Utilizzo del microscopio ottico mediante una sorgente luminosa di luce bianca, deviata verso il campione da osservare da una lente (condensatore), poi dall'obiettivo e infine dall'oculare. Risoluzione: distanza minima per cui due punti sono distinguibili; dipende dalla lunghezza d'onda, dal tipo di lenti e dal mezzo che deve attraversare la luce. (0.2 micrometri risoluzione massima).

Il microscopio ottico permette di osservare cellule viventi, dei preparati (cellule morte preparate con fissativi), l'interno delle cellule in quanto trasparenti. Non permette di osservare un corpo opaco (quindi troppo spesso); bisogna congelare il tessuto o includerlo in una sostanza solida per poi fare delle sezioni molto sottili (criostato o microscopo).

L'immunoistochimica utilizza gli anticorpi e la loro capacità di formare legami non covalenti con specifiche molecole bersaglio per individuare le cellule che contengono la molecola bersaglio dell'anticorpo. Anziché immergere una sezione in un colorante viene immersa in una soluzione contenente anticorpo, la molecola enzimatica legata all'anticorpo produce un precipitato colorato rivelando così la presenza della molecola bersaglio. Le sezioni troppo trasparenti non distinguono le strutture interne quindi si utilizzano delle colorazioni istologiche: si sfruttano le proprietà di alcune molecole, per esempio l'acidità.

L'immunofluorescenza: gli anticorpi sono coniugati a molecole fluorescenti e non ad enzimi (la molecola produce una lunghezza d'onda diversa rispetto a quella utilizzata per eccitarla). Per vedere le molecole fluorescenti si utilizza il microscopio a fluorescenza (radiazioni monocromatiche condotte attraverso l'obiettivo con uno specchio senza attraversare il preparato). Esistono molti fluorofori (molecole fluorescenti). Microscopio confocale osserva solamente un piano focale (una sola parte messa a fuoco).

Microscopio elettronico a trasmissione: osserva strutture molto piccole, utilizza un fascio di elettroni anziché luminoso (il campione non può essere una cellula vivente); risoluzione massima 0.1 nanometri; le sezioni vengono effettuate con l'ultramicrotomo e devono essere più sottili di quelle per il m. Ottico; le strutture cellulari sono trasparenti al fascio di elettroni quindi vengono colorate con preparati contenenti metalli pesanti, per esempio osmio. Nel m. elettronico a scansione vengono evidenziati gli elettroni riflessi dal campione e una lamina metallica copre il campione da analizzare.

Lezione 2: La cellula

Membrana plasmatica (membrana esterna, glicocalice, specializzazioni di membrana come ciglia, flagelli, microvilli, filopodi, giunzioni), citoplasma (organelli membranosi: mitocondri, perossisomi, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi, endosomi e lisosomi, vescicole; organelli non membranosi: centrioli e ribosomi liberi; citoscheletro: microtubuli, microfilamenti e filamenti intermedi; citosol: spazio acquoso con pH 7.4) e nucleo (involucro nucleare con doppia membrana e pori, nucleoscheletro con lamina nucleare, nucleosol cioè la componente liquida, cromatina cioè DNA e proteine, nucleolo (uno o più) dove avviene la sintesi dei ribosomi).

Mitocondri: 0.5-1 micrometro, sono dotati di due membrane, quella interna forma le creste mitocondriali che delimitano lo spazio detto matrice. All'interno sono presenti i ribosomi e il genoma mitocondriale. Sono le centrali energetiche della cellula, molto importanti per il metabolismo, avviene il ciclo di Krebs, la catena respiratoria, la beta ossidazione degli acidi grassi e la sintesi degli steroidi a partire dal colesterolo. Produzione di ROS (reactive oxygen species: sostanze per eliminare prodotti di scarto) e radicali liberi, deposito di Ca²⁺, regolano l'apoptosi.

Perossisomi: sono organelli vescicolari con diametro tra 0.5 e 1 micrometro, delimitati da una singola membrana, contenuto elettrondenso. Spesso all'interno contengono un aggregato cristallino di enzimi (cristalloide). Svolgono la perossidazione (attraverso l'enzima catalasi rimuovono il perossido d'idrogeno), la beta ossidazione di acidi grassi a catena lunga o ramificati, sintesi di plasmalogeni (lipidi che formano la guaina mielinica) e acidi biliari, rimozione ROS e radicali liberi.

Reticolo endoplasmatico: costituito da cisterne delimitate da singola membrana in continuità con l'involucro nucleare (pH neutro).

RER: presenta ribosomi sulla superficie esterna (quella verso il citosol); produzione e prima glicosilazione di proteine destinate al Golgi, lisosomi, vescicole di secrezione e alla membrana plasmatica; reazione di stress.

REL: non presenta ribosomi; deposito ioni calcio; sintesi lipidi e fosfolipidi; sintesi steroidi; rimozione composti tossici dalla cellula; sulla superficie avviene il metabolismo del glicogeno.

Apparato di Golgi: struttura formata da cisterne delimitate da singola membrana impilate una sopra l'altra. Gli spazi interni alle cisterne hanno pH 6.5. Si trova vicino al nucleo. Smista e modifica le proteine destinate ai lisosomi, alle vescicole di secrezione e alla membrana plasmatica; sintesi proteoglicani.

Vescicole: struttura sferica delimitata da singola membrana.

• Di trasporto: si staccano da un organello membranoso, trasportano grosse molecole tra RER, Golgi, lisosomi e vescicole di secrezione.
• Endocitiche: catturano porzioni extra cellulari e le introducono nella cellula.
• Di secrezione: consentono l'accumulo di macromolecole che verranno depositate fuori le cellule.

Endosomi e lisosomi: circondati da singola membrana; pH acido; coinvolti nella degradazione e digestione di materiale inglobato dall'esterno; variano da 0.1 a 1.2 micrometri.

Lezione 3: Le membrane biologiche

Secondo il modello a mosaico fluido di Singer e Nicolson del 1972 le membrane biologiche (5 nanometri circa, dipende dalla presenza o meno di doppi legami nei lipidi) sono costituite da un fluido bidimensionale grazie a due strati di lipidi. Grazie alle proprietà anfipatiche (teste polari e code idrocarburiche idrofobiche) dei lipidi le membrane rimangono stabili. I lipidi possono scambiarsi da uno strato all'altro tramite movimento flip-flop.

Tra i componenti molecolari possiamo trovare:

• Fosfolipidi: due molecole di acidi grassi (una catena è satura e l'altra insatura) legati con legame esterico al glicerolo, legato al fosfato che a sua volta è legato all'etanolammina (neutro), serina (negativa) o colina (neutro).
• Sfingolipidi: due acidi grassi insaturi legati alla sfingosina con un gruppo fosfato, legato a sua volta alla colina nella sfingomielina.
• Glicolipidi: sfingolipidi che anziché legare un gruppo fosfato legano una molecola di zuccheri (galactocerebroside, ganglioside (-)).
• Colesterolo: costituito da vari anelli idrocarburici con coda non polare e testa polare, è un componente delle membrane animali, le membrane ricche di colesterolo sono più rigide.

I due versanti delle membrane biologiche hanno composizioni lipidiche diverse. Per esempio nella membrana plasmatica la parte rivolta verso il citosol contiene fosfatidiletanolammina e fosfatidilserina mentre quella rivolta verso lo spazio extracellulare fosfatidilcolina, sfingomielina e ganglioside. I glicolipidi non sono mai presenti nel foglietto rivolto verso il citosol. Le membrane biologiche sono molto diverse tra loro sia tra cellule diverse sia tra componenti diversi della stessa cellula.

Lezione 4: Le proteine di membrana

Le proteine possono contenere regioni che assumono strutture differenti. Queste sottostrutture prendono il nome di domini. Le proteine possono spontaneamente polimerizzare quindi auto-organizzarsi in strutture più o meno complesse. All'interno delle membrane biologiche sono inserite molte proteine in quantità variabile in base al tipo di membrana. Le proteine stabiliscono interazioni idrofobiche escludendo quindi le molecole d'acqua. Si estendono attraverso il doppio strato come singole o multiple alfa eliche o come un foglietto beta arrotolato (beta barrel).

L'idrofobicità di queste molecole è spesso aumentata da una loro modifica covalente che prevede un legame con un acido grasso. Ogni aa si caratterizza per la catena laterale e quindi per il loro potenziale idrofobico. Molte proteine di membrana possiedono domini costituiti da aa idrofobici. Questi domini assumono struttura ad alfa elica transmembrana (dominio citosolico, dominio che attraversa la membrana particolarmente idrofobico e uno extracellulare). Se vi sono più sequenze con aa con alto contenuto idrofobico siamo in presenza di proteine con multipli domini transmembrana (come la batteriorodopsina).

Alcune proteine di membrana possiedono un dominio composto da foglietti beta formanti una struttura a barile con i residui idrofobici orientati verso l'esterno e quelli idrofili verso l'interno. Alcune proteine si legano alle membrane indirettamente: formano legami covalenti o non covalenti a proteine transmembrana (si possono trovare su ambedue i versanti delle membrane); altre possiedono domini che penetrano nella membrana ma non la attraversano: il dominio idrofobico rimane confinato in un versante del doppio strato lipidico. Sono proteine di membrana ma non di transmembrana (si possono trovare su proteine poste sul lato citosolico della membrana).

Alcune proteine formano legami covalenti con specifici lipidi, venendo così ancorate al doppio strato lipidico (lipidi diversi per legare proteine sul lato citosolico e lato esterno). Un modo di ancoraggio molto comune delle proteine sul lato extracellulare avviene tramite GPI (glicosil-fosfatidil-inositolo) in cui una proteina è legata ad una porzione polisaccaridica complessa a sua volta legata ai fosfolipidi di membrana. Le proteine della membrana plasmatica in genere possiedono carboidrati: la glicosilazione delle proteine di membrana avviene sui domini esposti allo spazio esterno. L'insieme delle proteine glicosilate e delle catene di polisaccaridi costituisce il glicocalice: protegge la cellula dal danno meccanico e chimico e tiene lontano i corpi estranei.

Lezione 5: Trasportatori e pompe

Più piccola è la molecola e meno si associa all'acqua e più rapidamente attraverserà la membrana. Con il coefficiente di permeabilità possiamo valutare il comportamento delle molecole (O₂, CO₂ attraversano le membrane; gli ioni no perché Kp basso). L'impossibilità di diffusione degli ioni consente di mantenere nel citosol concentrazioni ioniche differenti e quindi creare un potenziale.

Le proteine trasportatrici hanno parti mobili in grado di spostare le molecole attraverso la membrana, compiono dei cambiamenti conformazionali (due: sito soluto esposto su un lato della membrana o sull'altro) per spostare le molecole di soluto.

Le proteine canale formano un poro idrofilico che consente il passaggio di piccoli ioni inorganici con velocità maggiore. Ogni proteina canale è specifica per un determinato soluto e le mutazioni provocano le canalopatie (fibrosi cistica).

Diffusione facilitata o trasporto passivo (proteine canali o trasportatrici): se la molecola è neutra o apolare si muoverà attraverso la membrana seguendo il suo gradiente di concentrazione, se è carica seguirà il gradiente di concentrazione e quello elettrico (gradiente elettrochimico).

Trasporto attivo (proteine trasportatrici): trasporto uniporto (un solo soluto), trasporto accoppiato (trasporto di un soluto dipende da quello di una seconda molecola): simporto (stessa direzione) o antiporto (direzioni opposte).

Trasporto passivo del glucosio: entra nella cellula secondo il suo gradiente di concentrazione (maggiore all'esterno). Trasporto facilitato del glucosio: entra nella cellula in sinporto con due ioni Na+, a volte per andare al contrario del suo gradiente di concentrazione (cinetica simile ad enzima-substrato).

Trasporto nei globuli rossi: a livello dei tessuti la CO₂ è altamente concentrata e entra nei globuli rossi, dove viene trasformata in bicarbonato dall'anidrasi carbonica. Questo libera uno ione H+ che combinandosi all'emoglobina aiuta a liberare O₂. Lo ione HCO₃^- non si accumula nel citosol: viene scambiato in antiporto con lo ione Cl-. A livello dei polmoni l'ossigeno è altamente concentrato e si lega all'Hb che cede ioni H+. Questi vengono utilizzati dall'anidrasi carbonica per trasformare gli ioni bicarbonato in CO₂ e H₂O. La CO₂ esce dai globuli rossi e viene ceduta all'aria. Lo ione HCO₃^- entra nel citosol: viene scambiato in antiporto con lo ione Cl- che è accumulato nel citosol.

Pompe: mediano il trasporto attivo utilizzando l'energia sprigionatasi dall'idrolisi dell'ATP in ADP per trasportare ioni o molecole da un versante all'altro della membrana.

• Pompe di tipo P (fosfato): trasportano ioni, tipicamente in antiporto con altri ioni. L'ATP viene utilizzata per fosforilare un dominio proteico della pompa, portando alla modifica allosterica della stessa (pompa sodio/potassio).
• Pompe di tipo F (fosforilation factor) e V (vacuolar): entrambe deputate al trasporto di ioni H+ in seguito al legame con ATP o ADP. Le F si trovano principalmente nella membrana interna dei mitocondri (ATP sintasi) e sfruttano il gradiente elettrochimico degli ioni H+ per sintetizzare ATP (in determinate condizioni possono funzionare in senso inverso). Le V si trovano nelle membrane dei lisosomi dove grazie all'idrolisi dell'ATP pompano attivamente ioni H+ all'interno del lume (mantenendo l'ambiente acido).
• Pompe di tipo ABC (ATP binding cassette): trasportano piccole molecole non cariche al di fuori della cellula. Sono utilizzate per detossicare le cellule e per il trasporto di alcuni metaboliti.

1) Pompa di tipo P: SERCA pompa Ca²⁺ che viene rimosso dal citosol (a riposo la concentrazione citosolica è molto bassa rispetto a quella extracellulare). Il calcio viene pompato dal citosol al lume contro il gradiente elettrochimico. Stato E1 la pompa ha due siti di legame per lo ione Ca rivolti verso il citosol, il legame dell'ATP e la fosforilazione provocano dei cambiamenti conformazionali che chiudono i siti di legame del calcio, le eliche transmembrana della pompa si riposizionano in modo da liberare gli ioni calcio verso il lume del reticolo sarcoplasmatico in scambio con due ioni H+ (E2). Gli ioni H+ legati alla pompa inducono la defosforilazione, il rilascio degli H+ sul lato citosolico ed il ripristino dello stato iniziale. Un'altra pompa di tipo P è la Na-K: scambiata tre ioni Na+ (esterno) con 2 ioni K+ (citosol) mantenendo il gradiente di membrana leggermente negativo verso l'interno (pompa antiporto detto anche ATPasi Na-K).

3) Pompe ABC: ATPasi di trasporto, contengono due cassette che legano ATP: il legame porta alla dimerizzazione dei domini e ad un cambiamento conformazionale tale per cui molecole apolari vengono espulse (azione detossificante). I primi trasportatori ABC eucariotici presentano la capacità di pompare farmaci idrofobici fuori dal citosol come le multi drug resistance pump che resistono a molti agenti chemioterapici pompando i farmaci fuori dalle cellule.

Lezione 6: Proteine canale

I canali possono trovarsi in conformazione aperta o chiusa e devono garantire elevata selettività (i pori invece non sono selettivi: porine presenti nella membrana mitocondriale esterna in altre membrane risulterebbero deleterie). Possono veicolare fino a 100 milioni di ioni al secondo rispetto alle 1000 molecole di un trasportatore. Mediano solo trasporto passivo. Gli stimoli che provocano l'apertura dei canali ionici sono: un cambiamento nel voltaggio (Na, K, Ca), il legame con una molecola detta ligando dal lato extracellulare (neurotrasmettitori: aceticolina, serotonina, glutammato, GABA, glicina) o sul lato intracellulare, stimoli meccanici.

L'elevata selettività è data da un filtro di selettività presente sul canale. Per poter passare attraverso il canale gli ioni devono perdere le molecole d'acqua che li idratano e stabilire nuove interazioni deboli (non covalenti) con gli aa della parte interna del canale. La composizione e la distanza di questi aa consentiranno ad alcuni ioni di passare e ad altri no. I canali ionici non sono sempre aperti, si aprono in risposta ad un determinato stimolo.

I canali ionici più diffusi sono quelli del potassio. Gli ioni K stabiliscono interazioni deboli con gli ossigeni dei gruppi amminici. Gli ioni K occupano nel filtro di selettività le posizioni 1,3 o 2,4. Quando uno ione K dal lato citosolico si avvicina al filtro di selettività esso risulta altamente idratato, per poter entrare nel filtro deve perdere le molecole d'acqua e andare ad occupare la posizione P4, gli ioni di K si dispongono in fila indiana nella fase di attraversamento del canale. Lo ione sodio perderebbe troppa energia rispetto al guadagno che riceverebbe nell'entrare nel filtro di selettività del K. Oltre al mantenimento del potenziale di membrana i canali K sono cruciali per altri processi come la produzione di HCl nello stomaco.

Le cellule parietali utilizzano almeno 4 complessi proteici che veicolano ioni di cui 2 sono trasportatori e 2 canali. Lo ione Cl entra nelle cellule in antiporto con lo ione bicarbonato, ioni H+ e Cl- si trovano nella cellula parietale. Ioni Cl- escono dalla cellule con appositi canali del cloro presenti sul dominio della membrana plasmatica che si affaccia verso il lume dello stomaco, sullo stesso dominio un antiporto scambia ioni H+ con ioni K+.

Il potenziale di riposo della membrana plasmatica viene mantenuto per la presenza della pompa Na+ K+ ed il suo valore è dovuto dal flusso di ioni K attraverso i canali di riposo del K+ che sono sempre aperti. Il potenziale di riposo è calcolabile dall'equazione di Nernst V= (RT)/(zF)ln Cp/Ci (Vk=-89mV). I neuroni ricevono, traducono e trasmettono segnali. L'informazione viene trasmessa all'assone e poi alla cellula, il segnale consiste in cambiamenti di potenziale elettrico attraverso la membrana.