Appunti integrati di biologia molecolare

REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI, IL PROMOTORE E IL TERMINATORE

Nella biologia molecolare si intende gene un tratto specifico di DNA che contiene tutte le informazioni sufficienti per esprimere una qualsiasi molecola esercitante una funzione. Concetto fondamentale è quello del cis-acting, cioè la modalità d'azione di un elemento del DNA presente sulla stessa molecola dell'elemento bersaglio, cioè la modalità d'azione e del trans-acting, di un elemento del DNA che agisce su un bersaglio presente in una molecola diversa (ad esempio su cromosomi diversi).

Il promotore raggruppa le sequenze a frequenza di legame, il posizionamento e l'inizio dell'attività dell'RNA polimerasi. Il terminatore è posto alla fine del gene, ed è costituito da elementi in cis, che dirigono la

Cessazione dell'attività e il distacco della RNA polimerasi. Per identificare l'origine di un gene si usa il metodo RACE (Rapid amplification of cDNA ends), si estrae il RNA e lo si inserisce in una provetta insieme ad un enzima retrotrascrittasi. Si usa un primer specifico nel caso di un gene conosciuto o, da un primer casuale, nel caso si vogliano studiare diversi RNA dalla sequenza non nota. Entra in gioco un altro enzima che aggiunge una coda di A; le copie amplificate del cDNA vengono quindi sequenziate per l'identificazione di nuove unità di trascrizione.

Nei procarioti appena viene sintetizzato l'mRNA, inizia il processo anche di traduzione e quindi vi è l'attacco dei ribosomi sulla catena di RNA. Sul gene vi sono quindi tantissimi enzimi in azione: vi è la sintesi del DNA se il batterio (E.coli) dispone dei nutrienti, vi sono gli enzimi del riparo che controllano le varie lesioni, vi sono le RNA polimerasi e i ribosomi che...

sintetizzano le proteine.sequenze del promotore sono riconosciute dal fattore sigma (σ) facente parte il complesso

Nei procarioti le σdella RNA polimerasi. In E.coli esistono 5 proteine differenti che riconoscono sequenze diverse tra loro

• σ70, riguarda la maggior parte dei geni.
• σ32, riguarda tratti dei geni che codificano per le proteine che si occupano della risposta al calore.
• σ28, riguarda tratti dei geni che codificano per le proteine per la produzione del flagello.
• σ38, riguarda tratti dei geni che codificano per le proteine che si occupano della risposta allo stress.
• σ54, che si occupano del metabolismo dell'azoto.riguarda tratti dei geni che codificano per le proteine

Come funziona il fattore σ? σ4Proteina sigma è composta da 4 diverse regioni che si legano a regioni specifiche del promotore: la regioneσ3 lega l'elemento σ2 al tratto per l'apertura del DNA,

σ1 si lega nel tratto -35 del promotore, -10, lega si lega al tratto corrispondente al +1. Altro elemento importante per la sintesi, è l'elemento UP contatto dal α dominio C-terminale della subunità α ha una "coda" che si prolunga a monte della sequenza della polimerasi: la subunità -35 ed è in grado di legarsi direttamente al DNA. Una sequenza consenso è una sequenza ideale (teorica), che descrive la più frequente (o la più affine) interazione del DNA con la sua proteina regolatrice. L'attacco σ di sul DNA avviene grazie ad un flipping, svolto σ2, dell'adenina in posizione dal fattore -11 e della timina in posizione -7. Questo evento (cambiamento conformazionale del DNA), facilita da una parte, la fusione della RNA polimerasi al promotore, e dall'altra lo svolgimento della elica del DNA senza consumo di ATP. Ad esempio, la base che si trova più

Frequentemente al-35 è una T. l'RNA polimerasi dal promotore? Come procede?

Esistono 3 modelli a riguardo:

• Passaggio a transiente, la polimerasi incomincia a incorporare, poi tornare indietro grazie ad un'attività esonucleasica finché un evento non procede in una direzione lineare e sigma viene staccato.
• A bruco, si pensa che la polimerasi riesca ad allungarsi in una certa fase del suo legame con sigma, e può quindi variare la struttura conformazionale.
• Accartocciamento, è il DNA che forma delle forcine per cui si accorcia, e la polimerasi avanza.

Nella terminazione rho-indipendente, il segnale di arresto è contenuto completamente nel DNA. Nella regione di terminazione sono contenute delle sequenze a simmetria diadica che trascrivono per C e G che andranno ad appaiarsi fortemente tra loro formando una forcina terminale al RNA. A valle del DNA vi è una sequenza di di U sull'RNA che favorisce lo staccamento.

della polimerasi.adenine che trascrive per una sequenza per l'attivazione della proteina Rho. Sul DNA viNelle terminazioni Rho-dipendenti il DNA prende parte solo è una sequenza detta RUT ricca di guanina, di cui il consenso è ancora poco noto, che quando viene trascrittasull'RNA, viene riconosciuta da Rho la quale comincia a scorrere come un elicasi in direzione della sintesi.

L'OPERONEI livelli di espressione di un gene, garantiti dall'RNA polimerasi in assenza di fattori di attivazione dellatrascrizione (attività costitutiva) sono relativamente bassi. Questo livello di partenza può essere ulteriormenteridotto da specifiche proteine dette repressori, che bloccano il legame della polimerasi al promotore, o puòa seconda dell'espressione genica, siessere aumentato grazie a proteine stimolanti dette attivatori. Quindi haun livello minimo di espressione (con inibitori), un livello basale (attività costitutiva) e un

livello che può variare a seconda della presenza degli attivatori. Gli attivatori prendono contatto con la RNA polimerasi e con tratto attivatore, producendo delle modificazioni allosteriche della RNA polimerasi che producono un cambiamento dei fattori sigma che ne aumentano l'affinità sul promotore.

Gli attivatori possono funzionare in maniera diretta se sono legati a siti adiacenti, o se sono su siti distanti inducono un ripiegamento del DNA associandosi grazie ad un legame cooperativo: vi sono delle proteine che anch'esse facilitano la torsione del DNA contribuendo quindi all'espressione genica.

Un legame cooperativo è un'interazione chimica tra regolazioni allosteriche, e prevede che i legami in successione aumentino l'affinità l'uno verso l'altro, quindi la frequenza che avvenga il legame aumenta se in precedenza c'è già stato lo stesso tipo di interazione (es. polimerizzazione).

I fattori che

Regolano la trascrizione si sono evoluti in famiglie, co-evolvendosi con i loro geni bersaglio. I procarioti controllano fenotipi inducibili raggruppando gruppi di geni che sono funzionalmente legati. Questi geni raggruppati sono chiamati operoni, e sono quindi composti da sequenze regolatrici seguite da una lunga sequenza codificante che codifica per più proteine; questa sequenza produce un RNA contenente più sequenze codificanti, detto RNA policistronico. È l'operone.

Esempio classico, Lac in E.coli costituito da 3 geni: LacZ (codifica per beta-galattosidasi, enzima che scinde il lattosio in glucosio e galattosio), LacY (codifica per permeasi, un canale che fa entrare il lattosio nel batterio), LacA (funzione poco nota, aggiunge gruppi acetili), un operatore, un promotore e un sito a monte per l'attivatore è lattosio nell'ambiente, l'operone Lac è spento in quanto sull'operone CAP. Quando non vivi è repressore che ne blocca l'attività.

legame con la polimerasi. Quando CAP si lega cAMP, due molecole di cAMP, producono una variazione conformazionale che fa assumere una forma protrundente con il suo sito di legame a monte dell'operone. Alle estremità di CAP, il quale può ora legarsi, CAP viene riconosciuto quindi dalla subunità α della polimerasi che andrà a potenziare la trascrizione, velocizzando l'isomerizzazione della catena.

L'operone Lac in risposta al lattosio è un esempio di regolazione negativa della trascrizione, in quanto l'allolattosio sblocca un repressore, mentre la regolazione di CAP è un esempio di regolazione positiva, in quanto vi è un attivatore che induce la trascrizione. regione attuatore presente sull'operone triptofano.

Vi è un altro tipo di regolazione degli operoni dovuta alla che codifica per la sintesi dell'aa triptofano. Quando il Trp scarseggia, il ribosoma ritarda in corrispondenza di due codoni adiacenti.

codificanti