Appunti Integrati Biologia dello Sviluppo

MODELLO SINERGISTICO:

nel lato dorsale dell’embrione l’azione della beta catenina si complementa agli

induttori del mesoderma (ricorda, senza beta catenina niente mesoderma

dorsale anche se ci sono FGF e activina), nella zona dove si ha

sovrapposizione di localizzazione fra activina/FGF e beta catenina si ha la

specificazione dell’organizzatore.

In termini molecolari la sinergia di queste 2 vie è mostrata *img -> gene

goosecoid (ma anche altri geni dell’organizzatore possono essere attivati in

questo modo):

Può essere attivato perché la beta catenina (+ fattore Tcf-3) attiva un

- gene per una proteina (Siamois) che a sua volta attiva il gene di

goosecoid (fattore trascrizionale che lega la regione regolatoria).

Nella regione regolatoria di goosecoid agiscono anche le molecole

- della via di trasduzione di TGF beta, cioè le activine.

Quindi le due vie convergono sulla stessa regione regolatoria determinando

l’accensione del gene dell’organizzatore. La specificazione dell’organizzazione,

in termini molecolari, vede la sinergia fra la via di Wnt attraverso Siamois e della via di activina e TGF beta.

Lezione 2 Maggio

Massimiliano Andreazzoli: massimiliano.andreazzoli@unipi.it

Ricevimento: lunedì h 12-13

Riprendiamo:

Le cellule vegetative producono segnali di induzione mesodemica.

Drosophila -> ha permesso comprensione dello sviluppo embrionale con generale.

Anfibi -> ha permesso la comprensione dello sviluppo embrionale tipico dei vertebrati.

Anfibi e pesci hanno sviluppo esterno a differenza dei mammiferi -> per questo riusciamo a fare studi

embrionali avanzati.

Nieuwkoop si domandò come si formasse il mesoderma: vediamo territori presuntivi su anfibio diviso a metà ->

zona marginale darà mesoderma (muscolatura, cuore, sangue ossa), zona vegetale da endoderma (darà tubo

digerente primitivo nei vertebrati da cui i formerà il tubo digerente definitivo dell’adulto e tutti gli organi annessi

come fegato pancreas e polmoni) e polo animale darà ectoderma (tessuto neurale, epidermide).

Domanda di Nieuwkoop: come si forma il mesoderma?

 N.B. Mesoderma dorsale è quello che va incontro a epibolia.

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Nieuwkoop capì che era l’endoderma ad indurre il mesoderma: prese la massa vegetativa di un embrione e lo

mise a contatto con l’ectoderma di un altro embrione e lasciano il tutto per più di un giorno vide che l’ectoderma

era diventato mesoderma -> ora usiamo marcatori specifici per mesoderma con ibridazione in situ, mentre

Nieuwkoop usava all’epoca sistemi istologici (implicano tempi più lunghi).

Vediamo che il mesoderma is forma nella regione intermedia di contatto fra polo animale e vegetativo, è quindi

una regione di confine. Se lasciamo il tutto a contatto per più di un gg tutto il polo animale si convertiva in

mesoderma.

Come siamo sicuri che siano le cellule endodermiche e non quelle ectodermiche ad indurre il mesoderma?

Marchiamo le cellule ectodermiche e vediamo che sono quelle che si trasformano in mesoderma, quindi deve

essere l’endoderma ad indurre il cambiamento. Possiamo usare organismi albini di Xenopus e wild type (che

hanno calotta animale di colore marrone scuro (in modo da distinguere le due porzioni embrionali) o usiamo

marcatori specifici (con GFP o coloranti vitali -> iniettiamo un mRNA messaggero codificante per la GFP

anche allo stadio di una cellula in modo che nelle divisioni successive sarà espresso e tutta la calotta animale sarà

di colore verde fluorescente).

Esperimento: Induzione del mesoderma di Dale e Slack

Usano un embrione più precoce alo stadio di 32 cellule -> a questo stadio in cui possiamo ancora fare una

mappa del destino si chiedono se c’è una differenza fra il mesoderma indotto dai blastomeri dorsali, ventrali o

intermedio vegetativo.

Quindi si procede mettendone a contatto l’ectoderma con i singolo blastomeri separati del polo vegetativi:

vediamo il blastomero D1, il blastomero più dorsale, il D2 e D3 , sono quelli intermedi, e D 4 che è il più

ventrale -> valutiamo non solo l’induzione, ma anche il tipo di mesoderma indotto.

Dividiamo tre tipi di mesoderma: dorsale, intermedio e ventrale.

Ricombinando D1 con polo animale nel 77% dei

- casi otteniamo mesoderma di tipo dorsale e 23%

dei casi con mesoderma intermedio e 05 die casi

on mesoderma ventrale.

Se uso D2 (intermedio più vicino a quello dorsale)

- nel 61% dei casi ho mesoderma intermedio, 28 %

mes ventrale e 11 % mes intermedio .

Se uso D3 , intermedio più vicino. Ventrale, 55%

- dei casi ho mesoderma ventrale, 45 % intermedio e

5% dorsale.

D4, blastomero vegetativo ventrale ottengo 42%

- intermedio, 42% vetrate e 16% dorsale -> caso più

strano.

Deduciamo che la posizione dei diversi blastomeri vegetativi determina il tipo di mesoderma lungo l’asse dorso

ventrale che si formerà quando vengono messi a contato con la calotta animale. Vediamo che non ho una

separazione netta dell’induzione, ma è una situazione di sviluppo piuttosto plastica.

 Quando ho un problema complesso non studio l’embrione intero, ma divido in protoni e studio

separatamente le varie parti.

N.B. Mentre la ascidie hanno uno sviluppo molto selettivo d tipo a mosaico, gli anfibi sono molto più vicini a

uno sviluppo di tipo regolativo, quindi sono più plastici.

ROTAZIONE CORTICALE

Avviene nella fecondazione, ho una rotazione del citoplasma corticale, detto cortex, che ruota rispetto al

citoplasma più interno -> in seguito alla rotazione viene definitivo l’asse dorso ventrale -> il pt di entrata dello

spermatozoo è il lato ventrale, quello opposto darà il lato dorsale.

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Rotazione è determinata dal citoscheletro, ovvero dalla polimerizzazione dei micro tubuli.

Esperimento:

Irradiamo con UV la parte vegetava (usiamo questa parte per convenzione), raggi UV bloccano la

polimerizzazione die microtubuli e in base alla quantità di UV irradiati o alla durata del trattamento posso avere

un blocco parzialmente o completo della rotazione corticale -> l’embrione manca di strutture anteriori e alcune

dorsali per trattamenti basi o intermedi, con forte trattamento invece l’embrione avrà solo strutture di tipo

ventrali.

Trapianto dal centro di Nieuwkoop:

Trapiantiamo blastomero vegetativo da embrione normale in embrione irradiato con UV.

È stato visto che se prendiamo un blastomero vegetativo dorsale e lo sostituiamo in un blastomero vegetativo

dell’embrione tratta con UV, si formerà una larva normale.

Altro saggio: trapiantiamo blastomero vegetativo dorsale in un embrione normale in cui viene eliminato un

blastomero vegetativo ventrale -> l’embrione formerà due labbra del blastoporo, quindi avremo due principi

della gastrulazione e si formeranno due assi corporei.

Quindi il blastomero dorsale vegetativo deve avere qualche particolare caratteristica che gli permette di

recuperare un embrione di formare un asse dorso ventrale: è il blastomero che induce il mesoderma dorsale.

Esistono due tipi segnali:

1. Uno induce mesoderma generale;

2. Un altro induce mesoderma inviato da cellule dell’endoderma dorsale -> quindi viene indotto il labbro

dorsale (che è l’organizzatore).

Molecole coinvolte in questi due segnali devono avere dei requisiti:

Espressione nell’endoderma;

- Espressione nel blastula precoce (molto prima della gastrulazione);

- Deve avere l’attività di induttore mesodermico, mimando dli effetti dei trapianti di cellule endodermiche

- (indurre secondo organizzatore).

Per vedere l’espressione nell’endoderma usiamo anticorpi, con la tecnica dell’immunostained, o ibridazione in

situ; per vedere espressione al momento della blastula precoce facciamo una RT-PCR o Western Blot, se

vogliamo seguire la proteina.

Per saggiare l’attività da induttore mesodermico: facciamo saggio di induzione mesodermica o saggio degli

animal caps che consiste nel prelevare la calotta animale, metterla su piastra Petri in soluzione fisiologica (senza

fattori di crescita o altri ormoni -> questi vanno invece aggiunti nel caso dei mammiferi) .

Passiamo poi ad aggiungere nel terreno un fattore specifico per vedere se quella molecola riesca a indurre o

meno il mesoderma (se si allora ha l’attività di induttore mesodermico)-> se lasciamo animal cap nella sola

soluzione fisiologia darà ectoderma, mentre nell’embrione la parte darebbe sistema neurale e epidermide.

Quindi le animal cap son cellule pluripotenti che in base al contesto riescono a sviluppare diverse tipologie

cellulari -> sono plastiche.

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Usando questi criteri ora sappiamo che i fattori coinvolti sono:

Zigotici: proteine sintetizzate dallo zigote dopo la blastula transition in cui si attiva la trascrizione zigotica

- come TGF-beta, tra cui le Xenopus Nodal Related (Xnr1, Xnr2,Xnr 4) che sono simili all’activina (stessa

famiglia) e derrier;

Materni: come TGF-beta -> sia fattori secreti quale Vg-1 che fattori di trascrizione come Veg-T ->

- depositati nella parte vegetativa dell’oocita, sono sia mRNA che proteine.

Veg T e Vg 1 sono ereditati come messaggeri: Vg 1 nella parte vegetativa dell’ovocita, visto con ibridazione in

situ di un embrione sezionato (spiega tecnica di ibridazione in situ) -> simile situazione per Veg T.

Vg 1 e Veg T riescono ad attivare brachiuri, un fattore trascrizione che a sua volta un FGF particolare, eFGF

(FGF embrionale) -> eFGF è una proteina secreta che ha come effetto un’ulteriore attivazione di brachiuri (è un

feedback positivo sull’espressione di brachiuri).

Con ibridazione in situ vediamo espressione di brachiuri (in img

vediamo lato vegetativo, stadio di una blastula precoce, segno nero

apicale è l’inizio della gastrulazione con le cellule a bottiglia ):

distribuzione ad anello, in sez trasversale è espresso in punti specifici

(marcati in rosso) marginali sul lato vegetativo che corrisponde al

mesoderma.

Brachiuri non solo è un marcatore, ma è un gene fondamentale ne l’induzione mesodermica perché è i primo

gene mesodermico ad essere attivato (poi espressione mantenuta con feedback) e brachiuri attiverà a sua vota

tutti gli altri geni mesodermici.

*rivedi cascata di segnalazione TGF-beta e BMP

Un secondo segale è quello inviato dal centro di Nieuwkoop-> induce mesoderma dorsale grazie alla beta-

catenina. È una molecola di adesione che permette l’interazione fra cellule, in particolare la beta catenina ha

anche una fx di elemento di traduzione finale, ovvero un effettore di Wnt.

Via di trasduzione del segale:

Wnt sono proteine secrete, bene distinte da TGF. Beta perché hanno un loro proprio recettore, frizzle