Appunti Integrati Biologia dello Sviluppo

Dipartimento di biologia

Corso di laurea in scienze biologiche

Appunti tratti dalle lezioni di biologia dello sviluppo
Dei prof. Vignali e Andreazzoli
Studente: Monica Perria
Anno accademico 2017-2018

Biologia dello sviluppo

- Prof Robert Vignali e Massimiliano Andreazzoli
- rvignali@biologia.unipi.it; massimiliano.andreazzoli@unipi.it
- Ricevimento: lunedì ore 9-13, venerdì 16-18 su appuntamento; lunedì ore 12-13.

Libri consigliati:

• Biologia dello sviluppo, Gilbert, Zanichelli -> in italiano (9^° edizione vs 10^°-11^° edizione del formato inglese).
• Biologia dello sviluppo, Wolpert, Zanichelli -> meglio Gilbert. *con slide online

Esame: ORALE

Lezione 7 marzo

I primi biologi dello sviluppo erano embriologi come Aristotele, che cresceva uova di pollo e le apriva a vari giorni della crescita descrivendole internamente. Si trattava di un'embrione descrittiva, dove veniva descritto solo cosa accadeva all'interno. Malpighi studiava anche lui le uova di pollo, ponendo il problema di come cambia l'embrione nello sviluppo:

• L'embrione è già un adulto preformato, quindi lo sviluppo è solo accrescimento di un organismo con parti già presenti in miniatura (versione preformistica).
• Lo sviluppo è epigenetico, cioè uno sviluppo progressivo in cui la forma si acquisisce gradualmente nell'embrione, quindi l'embrione è diverso dall'adulto.

Sviluppo generico: una prima fase con segregazione cellulare, detta segmentazione, poi una fase con vari movimenti cellulari, si parla di gastrulazione, uno spostamento di popolazioni cellulari fino a formare tre foglietti embrionali primordiali: interno -> endoderma, mesoderma e ectoderma -> da questi foglietti poi abbozzi di organi, ex neurolazione.

Aristotele era per l'epogenesi, un modello in voga fino al '600. Da questo momento poi si pensa al preformismo (ad es. Malpighi). Cominciano quindi esperimenti su embrioni -> embriologia sperimentale, il fondatore è Wilhelm Roux che realizza nel 1844:

- Uova di rana fertilizzato, quindi zigote che si divide dando origine a embrione a stadio di due cellule dette "blastomeri"; a questo stadio viene uccisa una delle due cellule con un ago bollente e osservò che non si sviluppava in un embrione completo, ma solo metà, quella formatasi dalla divisione del blastomero ancora in vita. Possiamo interpretare l'embrione come un mosaico di pezzi da cui scaturisce l'intero embrione, quindi potremmo pensare che un blastomero possa dare origine solo a una metà dell'embrione -> è un'interpretazione errata quella di Roux.

Altro esperimento:

- Possiamo separare i due blastomeri. Se l'embrione fosse mosaico, allora ogni blastomero dovrebbe formare una metà dell'embrione -> in realtà, ogni blastomero dà origine a un embrione intero, per cui non è uno sviluppo a mosaico. Se i blastomeri vengono separati, sono in grado di creare un intero organismo, si parla di sviluppo regolativo.

Driesch compie un esperimento simile su ricci di mare, separa i blastomeri (da cui origine una blastula, poi larva, poi organismo adulto) con una bacchetta di vetro. Una muore per effetto meccanico, l'altra dà una blastula da cui si forma una larva completa, anche se più piccola -> ancora ogni blastomero riesce a "regolarsi" e se separati otteniamo un organismo completo, sviluppo regolativo.

- Possiamo separare i blastomeri in stadio più avanzato, a 4 cellule -> separiamo 4 blastomeri, ognuno di questi darà ancora una volta una larva completa.

- Separiamo allo stadio di 8 cellule, separiamo 4 cellule superiori dette animali, dalle 4 cellule inferiori, dette vegetative -> vegetative danno embrione con derivati soprattutto a mesoderma e endoderma, animali saranno organismo con soprattutto derivati dell’ectoderma -> a questo stadio, se separate, le cellule non hanno più potenzialità regolative.

- 1924, Hilde Mangold e Spemann compiono un esperimento su anfibi: si preleva tessuto in gastrulazione da atrio dorsale dell’astioporo (su lato dorsale dell’embrione) poi trapiantato su lato ventrale di un embrione ospite allo stesso stadio di sviluppo -> l'embrione ospite forma un secondo sito di invaginazione mentre solitamente deve essercene solo uno su lato dorsale -> si forma una larva particolare, come due larve unite sui lati ventrali -> fenomeno di influenza su un embrione da altre cellule trapiantate è detto induzione, proprio perché il tessuto trapiantato era capace di organizzare lo sviluppo dell’embrione ospite si parla di "esperimento dell’organizzazione".

Si comincia a pensare all’esistenza di sostanze organo-formative, cioè in grado di influenzare lo sviluppo degli organi dell’organismo. Maggiore comprensione si ottiene solo intorno agli anni ’90, dopo la scoperta della doppia elica del DNA e studio del DNA, traduzione, trascrizione, proteina con biologia molecolare -> particolari proteine che regolano il DNA per regolare la trascrizione genica, abbiamo molti livelli in realtà di regolazione genetica anche a livello di mRNA, fosforilazione proteine ecc. -> "fattori di trascrizione" o "proteine regolatrici". Grazie a biologia molecolare e clonazione genica capiamo sviluppo in termini molecolare: ad esempio in embrione di Xenopus (rana modello) possiamo iniettare un solo gene trascritto in mRNA per alterare lo sviluppo, ad esempio mRNA di Cerberus porta alla formazione di due teste sull’organismo.

Definizione sviluppo molecolare grazie a Drosophila, organismo modello che permise di isolare tutti i geni e studiarne la funzione regolatoria nello sviluppo -> sono geni condivisi con tutti i metazoi.

Drosophila

Introdotta come modello all’inizio del ‘900, un uovo fecondato in un giorno di embriogenesi forma una larva. La larva attraversa tre stadi (1 gg-1 gg-2 gg), diventa una pupa (impupamento) e dopo 4 giorni schiude in un adulto. Drosophila viene introdotta per lo studio dell’ereditarietà dei caratteri -> si vuole vedere come gli alleli regolano caratteri semplici come il colore dell’occhio che è normalmente rosso, ma se gli alleli vengono mutati possono diventare bianchi, questo mutante è detto "White".

Drosophila nello stadio larvale ha nelle ghiandole salivari dei cromosomi politenici che, se colorati, danno un bandeggio con regolare successione di zone colorate scure e zone non colorate -> si ha sempre lo stesso pattern a un certo sviluppo della larva, dal bandeggio possiamo capire dove si trovano gli alleli e eventualmente vedere la posizione delle mutazioni sui cromosomi. In questo modo si ottiene una mappa cromosomica -> cominciamo a evidenziare mutazioni più importanti che variano l’intera forma dell’individuo, induciamo con mutagenesi queste mutazioni tramite raggi X o composti mutageni per modificare i geni casualmente, studiamo le generazioni che si incrociano fra loro in modo da far venire fuori le mutazioni -> si studiano alterazioni dello sviluppo.

Drosophila con torace diviso in 3 segmenti: T1, T2, T3 ognuno con un paio di zampe -> insetti sono ESAPODI!

• T1 non ha ali,
• T2 porta un paio di ali,
• T3 porta ali molto ridotte dette "bilancieri", per questo sono DITTERI (due ali).

• Un mutante sviluppava ali normali anche su T3 perché T3 si era mutato in T2 -> mutazione bitorax.
• Altro mutante detto "antennapedia" con sviluppo zampe al posto delle antenne.

Nobel ’95: Ed Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard, Eric Wieschaus

Animali modello

• Drosophila melanogaster
• Xenopus laevis
• Danio rerio (zebrafish)
• Mus musculus (topo)
• Caenorhabditis elegans, un nematode in cui ogni organismo possiede sempre lo stesso numero di 959 cellule somatiche fisse, sviluppo in 3 giorni completamente noto -> mutazione porta a numero di cellule diverso, poi si cerca di isolare i geni alla base della mutazione -> geni conservati anche nell’uomo, Nobel nel 2002 a Sydney Brenner.
• Smithies, Capecchi e Evans Nobel nel 2007 per aver utilizzato cellule staminali di mammiferi, poi in coltura, poi modificate geneticamente in modo controllato su topo sostituendo a gene wild type un gene mutante -> topo diventa un modello di studio.

Differenziamento

Lo zigote inizia a dividersi, si forma un embrione detto blastula, poi gastrulazione che porta ai 3 foglietti embrionali ognuno darà origine a tessuti differenziati:

• Ectoderma -> epidermide, tutto sistema nervoso;
• Mesoderma -> tessuto osseo, cartilagineo, muscolare, sangue, cellule del rene;
• Endoderma -> digerente e respiratorio, anche ghiandole pancreas e fegato.

Cellule germinali evolvono separatamente dai foglietti embrionali.

Il differenziamento è dovuto ad azione genica:

- 1883 Weismann, Teoria del plasma germinale: la linea germinale possiede tutti i determinanti per tutte le linee di cellule somatiche -> mano a mano che si differenziano, le cellule perdono alcuni determinanti, mantengono solo quelli che servono per una determinata differenziazione. Questi determinanti per lui stavano nel nucleo sui cromosomi (all’epoca non si conosceva nemmeno il DNA) elaborando sostanze che in qualche modo venivano poi passate nel citoplasma -> grande scoperta, aveva già intuito DNA e mRNA.

La teoria vede l'embrione come un mosaico di pezzi, ogni gene (tassello) è fondamentale per lo sviluppo -> sviluppo a mosaico, implica un nucleo inizialmente totipotente, con tutti i determinanti, nel corso della differenziazione il nucleo perde questa totipotenza perché riducono i loro determinanti. Questo modello non è considerato valido per tutti gli organismi, ma poteva essere messo alla prova con vari esperimenti.

Esperimento di legatura di Spemann

Zigote di tritone si divide in due blastomeri; Spemann crea una strozzatura con un capello finissimo intorno al blastomero sx, allo stadio di 8 cellule, costringendo il nucleo di questa cellula a spostarsi sul blastomero dx: cellula dx con 2 nuclei, cellula sx con 1 cellula. Alla successiva divisione (16 cellule) Spemann allenta la strozzatura e permette a un nucleo di passare sul blastomero sx che era ancora anucleato -> effettua poi una strozzatura finale separando i due blastomeri, ora si ha lo sviluppo separato con un blastomero con 1 solo nucleo e un altro ricco di nuclei.

Se l’ipotesi di Weismann fosse vera, questi nuclei avrebbero dovuto perdere parte della totipotenza, avendo già subito alcune divisioni, quindi l’embrione sx (con un nucleo) non potrebbe più generare una larva completa -> in realtà, si formano due larve complete, quindi almeno nelle prime fasi dello sviluppo le cellule non perdono i determinanti, ma sono totipotenti.

- 1952: esperimenti per dimostrare totipotenza delle cellule a vari stadi dello sviluppo, lavorando su rana. Bucano l’embrione dopo la fecondazione eliminando il contributo materno: l’embrione va incontro a un fenomeno di "attivazione", cioè parte lo sviluppo embrionale, anche se noi abbiamo eliminato il nucleo -> vengono iniettate cellule con nuclei a vari gradi dello sviluppo -> non abbiamo uno sviluppo completo, l'organismo muore a stadio larvale, ma la percentuale che arriva allo stadio di girino varia a seconda dello stadio del nucleo che abbiamo iniettato -> più è avanzato lo stadio di sviluppo del nucleo, minore è la percentuale di organismo che arriva a stadio di girino. Significato: nel corso dello sviluppo viene persa la totipotenza.

- Gurdon: stesso esperimento, ma preleva nuclei da cellule di organismi adulti (da zampa). Usa cellule wild-type e inietta nucleo di un organismo albino -> solo una piccola percentuale di embrioni riesce a crescere, si arrestava però lo sviluppo ad esempio al termine della gastrulazione. Quindi preleva embrioni e li trapianta in un altro uovo e ripete trapianto-iniezione prima del termine dello sviluppo fino ad ottenere degli organi adulti. Quindi nuclei somatici inizialmente sono totipotenti e possono essere "riprogrammati" se li facciamo tornare allo stadio embrionali -> ora avviene su studi di cellule staminali INDOTTE.

- Permisero esperimenti di clonazione su animali come per Pecora Dolly. Efficienza di questo esperimento inizialmente molto bassa, ora più alta. Ora cellule staminali (embrionali o adulte) sono in grado di dare origine a tutti i tessuti o ad una parte di essi -> prelevo cellule embrionali da blastocisti di un mammifero, poi le metto in coltura e eventualmente modificate geneticamente. Possiamo mantenere queste cellule modificate in coltura con dei fattori di crescita stimolando il loro rinnovamento/potenzialità poi eliminando alcuni fattori di crescita possiamo portarli verso il differenziamento di un tipo di differenziazione. Per questo sono usate come modello di differenziamento per studiare varietà genica e sviluppo organismo -> costruiamo "organoidi" per curare determinate malattie -> ad es. prendo cellula coda topo malato, impiantiamo in ovocita del nucleo, facciamo diventare ovocita in embrione, preleviamo cellule staminali embrionali (che sono mutanti), le attiviamo in coltura con vettori correggiamo i geni mutanti e reimpiantiamo cellule staminali corrette in organismo malato -> OPPURE possiamo riprogrammare cellule adulte si parla di cellule staminali indotte, riportiamo cellule adulte a stadio embrionale = sono iPSC, Yamanaka Nobel 2012.

Lezione 9 marzo

Aspetti dello sviluppo

• Specificazione regionale: meccanismi genetico-molecolari per individuare la regione anteriore e posteriore nell’embrione.
• Differenziamento: formazione di molti tipi cellulari a partire da un’unica cellula iniziale, lo zigote che inizialmente è totipotente.
• Morfogenesi: creazione della forma, non solo quella anatomica definitiva, ma anche la forma nello sviluppo embrionale durante la gastrulazione -> cellule si spostano e formano un abbozzo del tubo digerente.
• Crescita e proliferazione cellulare: aumento dimensionale e riproporzionamento delle parti corporee.
• Riproduzione: differenziamento delle cellule germinali rispetto alla linea somatica e fecondazione in vitro.
• Evoluzione: embriologia chiarifica rapporti evolutivi e morfologia fra varie specie. Evoluzione si realizza tramite dei cambiamenti ereditabili nello sviluppo, in cui le modificazioni sono su base genetica -> anche le variazioni adattative come la dimensione del becco sono regolati da meccanismi molecolari evolutivi.

Meccanismi molecolari per la costruzione dell’organismo, sono ampiamente conservati. -> geni che definiscono la forma di Drosophila sono gli stessi per l’asse antero-posteriore nel topo -> sono i geni HOX o omeotici.

• Ex gene eyeless dei vertebrati è lo stesso del gene Pax6 per lo sviluppo dell’occhio -> nel topo, se eliminiamo il gene avremo l’assenza dell’occhio, mentre nell’uomo provoca patologie come l’assenza dell’iride.
• Anomalie da mutazioni in topo e uomo provoca in entrambi i casi una mancanza di pigmentazioni in modo simile sul corpo.
• 2001 mappatura completa dei cromosomi, importante per riconoscere malattie genetiche.

Biologia dello sviluppo integra: embriologia, biologia evoluzionistica, genetica, fisiologia, biologia molecolare e cellulare, anatomia comparata, bioinformatica.

Relazioni evolutive fra i metazoi

Noi vertebrati siamo deuterostomi, formiamo bocca in una seconda apertura rispetto alla prima apertura nello sviluppo che darà origine all’ano vs protostomi, tutti altri. La principale differenza tra protostomi e deuterostomi sta nel fatto che il blastoporo, nei protostomi origina la bocca, mentre nei deuterostomi origina l’apertura anale.

Cordati caratterizzati da:

• Notocorda, sistema assile per sostegno dell’embrione, che viene a volte mantenuto nell’adulto, ma solitamente sostituito da colonna vertebrale.
• Sopra notocorda si forma tubo neurale dorsale, con sotto il tubo digerente; avremo anche delle tasche branchiali e una coda post anale.

Tre sottotipi di Cordati:

• Emicefalocordati, notocorda non si estende fino all’enfecalo, ma si estende dalla metà posteriore del capo.
• Cefalocordati, notocorda si estende oltre il tubo neurale, dall’estremità anteriore a quella posteriore del corpo -> anfiosso, morfologicamente più vicino a vertebrati.
• Urocordati, a cui appartengono i Tunicati, hanno una corda limitata allo stadio larvale nell’estremità caudale della larva -> ascidie, su base di analisi genomiche sembrano essere più vicine dei cefalocordati ai vertebrati.

Anfiosso

Animale marino, fisso nella sabbia da cui fuoriesce solo la parte anteriore in cui ho l’apertura boccale con i tentacoli orali, un’apertura per veicolare l’acqua all’interno che viene passata da un complesso apparato branchiale che filtra le particelle, infatti negli anfiossi ho delle branchie con funzione respiratoria poco importante -> respirazione per diffusione, piccoli animali. Ho tubo digerente, faringe con fessure branchiali, ano terminale.

Urocordati (contengono i tunicati)

Notocorda solo nella larva, regione detta "testa" con organo fotosensibile e un ganglio (piccolo cervello semplice). Larva poi ha un’apertura anteriore, una faringe, delle fessure branchiali e l’acqua entra attraversa un sifone inalante, viene emessa poi esternamente tramite un sifone branchiale. Larva si fissa al substrato e si trasforma con metamorfosi per cui notocorda viene riassorbita e animale diventa un grande apparato filtratore, acqua entra, filtrato in un cestello branchiale ed eliminata con sifone esalante; particelle passano tramite un tubo digerente. È un animale coloniale.

Sviluppo a mosaico

Assi di simmetria:

• Piano sagittale (se spostato verso dx e sx è detto parasaggitale)
• Piano orizzontale