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certo range di concentrazione di hunchback infatti valori troppo alti hanno un effetto di

repressione.

Tutti i geni gap hanno un'espressione che si restringe e questo perché essi si accendono

inizialmente con una certa sovrapposizione. Le zone di sovrapposizione poi vanno a sparire

per la repressione reciproca che si viene a creare e si vengono così a creare dei margini netti

di espressione.

Essi sono i geni responsabili del passaggio dalla specificazione alla determinazione e che

porta ad avere l'embrione diviso in abbozzi segmentali.

3_GENI DI SEGMENTALITÀ = GENI PAIR-RULE

In seguito ai geni gap si attivano i pair-rule, siamo intorno alla 13esima divisione, come dimostrano

mutanti in cui si vede che manca un segmento toracico e alcuni segmenti addominali (tutti i

dispari).

I geni pair-rule sono complementari come espressione e sono espressi come file di nuclei, ognuna

delle quali corrisponde ad un parasegmento. Ogni fila esprime una combinazione unica di geni pair-

rule che però si ripete in modo alternato. Da questo momento si osserva l'embrione di drosophila

diviso in 14 parasegmenti. L'espressione di questi geni è regolata da degli specifici enhancer che

sono stati studiati con delezioni successive per vedere dove si trovano e come sono regolati. Tali

enhancer vengono legati dai prodotti genici dei geni gap che sono disposti in maniera abbastanza

larga, infatti si sovrappongono per almeno 8-10 nuclei, ovvero 2-3 segmenti. Tale scoperta fu fatta

osservando dei blastodermi che stavano divenendo cellulari e nei quali la proteina hunchback era

legata da un anticorpo con colorante rosso e la Kruppel era legata a un colorante verde. Si avevano

zone in cui era espressa solo una delle due o zone in cui erano espresse entrambe (giallo).

Tra i geni pair rule ce ne sono tre primari: hairy, runt e even skipped, il quale ha l'enhancer più

studiato. Essi hanno enhancer modulari ovvero il controllo sull'espressione di ciascuna striscia è

localizzato in una diversa regione del DNA. A tale enhancer si legano i prodotti genici dei geni gap.

→mutante fushi taratzu = mancanza elementi di segmenti alterni.

Esperimento even-skipped = è uno degli enhancers più studiati, esso è modulare, le unità modulari

sono disposte in modo tale che ciascuna unità regoli una striscia separata. Ad esempio la striscia 2 è

stata studiata con DNAsi I ed è stato visto che contiene sei siti di legame per Kruppel, tre per

Hunchback, tre per Giant e 5 per Bicoid. Inoltre si sa che la proteina Kruppel reprime la parte

anteriore e Giant al limite posteriore.

Sperimentalmente per studiare tale enhancer viene preso un gene reporter come ad esempio il gene

Lac-Z e lo si lega con differenti regioni del promotore di tale gene. Poi viene inserito il tutto in un

embrione in modo da avere, ad un certo punto, l'attivazione della trascrizione. Così si potrà capire a

cosa serve l'enhancer che stiamo studiando. I risultati sono quelli in figura.

B e C e D= embrioni di tipo selvatico in cui era stato iniettato il transgene lacZ contenente la

regione enhancer specifica per la striscia 1, 5 e 1 e 5 insieme.

E = la regione delle strisce 1 e 5 è stata iniettata con il transgene in un mutante giant e si può vedere

che manca il limite posteriore della striscia 5.

Questi geni quindi:

1) Stabiliscono i confini dei parasegmenti (e quindi iniziano ad identificarli);

2) Codificano per fattori di trascrizione con omeodominio;

3) Regolano l’espressione dei geni segment polarity.

4_GENI DI SEGMENTALITÀ = GENI SEGMENT POLARITY

mediano le interazioni tra le cellule del blastoderma cellulare. Mutazioni in questa classe di geni

comportano la delezione di una parte di ciascun segmento e la sua sostituzione con una parte che è

l'immagine speculare di un'altra porzione del segmento. Nei mutanti engrailed per esempio si ha che

porzioni della parte posteriore di ciascun segmento sono sostituite da duplicazioni della regione

anteriore del segmento successivo.

A livello della trascrizione di questi geni si hanno relazioni tra le varie cellule che si sono formate e

i geni polarity assolvono a due compiti:

consolidano la periodicità dei parasegmenti stabilita dai primi fattori di trascrizione;

• attraverso la comunicazione cellula cellula si stabiliscono i destini cellulari all'interno di

• ciascun parasegmento.

Questi geni codificano per proteine che sono costituenti delle vie di trasduzione del segnale

Wingless e Hedgehog. Una fila di cellule di un parasegmento esprimerà la prima proteina mentre

una sola fila di un parasegmento esprimerà la seconda e la chiave è l'attivazione del gene engrailed

nelle cellule che esprimeranno la proteina Hedgehog. La sua trascrizione viene attivata in cellule

con alte concentrazioni di fattori come Even skipped, Fushi tarazu o Paired e viene invece inattivata

nelle cellule con alte concentrazioni di Odd skipped, Runt o Sloppy paired. Da ciò ne deriva che

Engrailed si trova espressa in 14 strisce lungo l'asse antero-posteriore ed esse determinano il

confine anteriore di ciascun parasegmento ovvero il margine posteriore di ogni segmento.

Il gene wingless si trova espresso nella fila anteriore a quella dove si trova espresso il gene

engrailed poiché ha necessità di poca o nulla presenza di Even-skipped o Fushi tarazu e della

presenza di Sloppy-paired.

Dopo l'avviamento questo modello deve essere mantenuto anche dopo che il proprio iniziatore non

viene più prodotto: ciò avviene grazie a un mantenimento dovuto alle cellule vicine. Le cellule con

Hedgehog attivano l'espressione di wingless nella cellula vicina mentre la proteina Wingless viene

recepita da quella che esprime Hedgehog e mantiene l'espressione di quest'ultima.

→Via di espressione del segnale Wnt = l'mRNA wingless viene trasferita all'apice della cellula

grazie al suo 3'UTR e qui viene tradotto. La proteina poi viene tradotta e secreta. Essa viene legata

dalle cellule che esprimono engrailed e hodgehog (nelle cellule in cui engrailed è espressa) e si

attiva così la via di trasduzione che permette la continua espressione di engrailed. Armadillo è il

nome della β-

catenina in

Drosophila. Qui

svolge il ruolo di

fattore della

trascrizione.

Si ritiene che la

diffusione di

queste proteine

stabilisca dei

gradienti mediante

i quali i parasegmenti acquisiscono la loro identità.

Le cellule che esprimono wingless producono peli sottili; le cellule che esprimono hedgehog sono

vicine alla prima fila di cellule che si trova nell'epidermide dorsale; le cellule che esprimono

engrailed divengono quelle posteriori estreme di ciascun segmento.

Uno degli effetti del segment polarity è quello di distinguere un compartimento dall'altro e di far

produrre i dentelli mediante i quali drosophila aderisce al substrato che devono essere presenti solo

nella parte anteriore di ciascun segmento. Ciò è reso possibile dal fatto che dove non è presente wg

si formano tali dentelli e viceversa. Nel mutante wg si hanno sia nella parte anteriore che posteriore

e si ha la perdita del ciclo regolatorio citato sopra.

5_GENI SELETTORI OMEOTICI

specificano le caratteristiche di ciascun segmento e la maggior parte di essi è contenuta in due

regioni del cromosoma 3. Uno di essi è il complesso Antennipedia che conferiscono identità ai

segmenti del capo e del torace, un altro è il complesso Bithorax responsabile dell'identità

segmentale dei segmenti addominali. La regione che contiene entrambi spesso viene chiamata

complesso omeotico.

Non è casuale la loro disposizione gli uni vicini agli altri, infatti i geni che sono più vicini al 3'

controllano regioni più anteriori e quelli più al 5' controllano regioni più posteriori. Questa è la

collinearità spaziale che è un processo mediante il quale è possibile allineare i geni sul cromosoma

con i segmenti dell'embrione. Si osserva anche la dominanza dei geni posteriori essi infatti

reprimono l’espressione dei più anteriori. Ad es.: Antp inizialmente 4-12, poi 4,5 ovvero la sua

espressione regredisce.

La loro espressione è mantenuta costante per tutta la vita dell'insetto dalle proteine Trithorax che

mantengono attivi i geni già attivati, mentre quelli inattivi sono mantenuti repressi dalle proteine

Polycomb.

I geni omeotici sono anche chiamati geni architetto poiché dettano le strutture che poi i geni

successivi, o operai, dovranno mantenere.

→mutante omeotico = una certa porzione dell'asse corporeo è stato cambiato in un altro, un

segmento è stato cambiato con un altro.

Normalmente il segmento T1 porta una coppia di zampe, T2 una coppia di zampe e una di ali e il T3

l'ultima coppia di zampe e i bilancieri.

→mutante bithorax = il segmento T3 viene trasformato in T2 poiché il gene Ubx viene inattivato. Il

gene antennapedia viene mantenuto anche in parasegmenti più posteriori e viene bloccato solo dai

geni successivi. Esso quindi invade i parasegmenti corrispondenti al segmento toracico T3.

Sono stati fatti incrociare anche mutanti di questo tipo per ottenere mutanti anche nei segmenti

successivi e ciò mostra che antennipedia si può espandere di più e trasformare tutti i segmenti

addominali in T2.

→ mutante antennipedia = è un mutante in cui il gene viene sovraespresso o espresso

ectopicamente. La mutazione colpisce una regione di Drosophila che è regolatoria e fa in modo che

antennipedia venga espressa in altri segmenti, oltre che in T2. Si può avere ad esempio la

trasformazione che causa lo sviluppo di un insetto che ha un paio di zampe ectopiche al posto delle

antenne.

Mutante per guadagno di funzione dovuto all’attivazione ectopica del gene antennapedia nella testa:

A causa della dominanza dei geni posteriori la testa assume delle caratteristiche posteriori.

POLARITÀ DORSO VENTRALE

Anche per capire come viene definito l'asse dorso-ventrale sono stati osservati i mutanti di

drosophila.

La polarità dorsoventrale è stabilita dal gradiente del fattore di trascrizione Dorsal che deriva da un

mRNA materno. Esso non si dispone come Bicoid in un sincizio, ma viene a formarsi su un campo

di cellule che si è formato in seguito a eventi di segnalazione cellula-cellula.

Dorsal è stato individuato in un mutante dorsalizzato in cui anche la parte ventrale è dorsale.

La specificazione di questo asse è formata da molte tappe e la più critica è quella al 14esimo ciclo

di suddivisione, in cui si ha il trasferimento della Dorsal dal citoplasma al nucleo delle cellule

ventrali. L'assenza di un gene materno di nome cactus provoca la ventralizzazione di tutte le cellule.

Esso è uno di quei geni necessari affinché dorsal penetri solo nei nuclei delle cellule che si trovano

sulla superficie ventrale dell'embrione.

La proteina dorsal viene prodotta circa 90 minuti dopo la fecondazione e a questo stadio si trova

dispersa in tutto l'embrione. Essa agisce però da morfogeno proprio perché viene internalizzata solo

nei nuclei delle cellule ventrali, dove poi si lega a certi geni attivandone o meno la trascrizione. Se

non entra i geni ventrali non vengono trascritti e quelli dorsali non vengono repressi e tutto

l'embrione risulta dorsalizzato.

Tale meccanismo riceve conferma dallo studio di mutanti o completamente ventralizzati, dove

dorsal entra in tutti i nuclei, o completamente dorsalizzati, dove dorsal non entra in nessun nucleo.

Ciò che comunica alla proteina dorsal di entrare solo nei nuclei ventrali sembra essere l'interazione

tra l'oocito e le cellule follicolari. In origine il nucleo dell'oocito si trova all'estremo posteriore della

cellula ovvero lontano dalle nutrici. Poi si sposta in posizione anteriore dorsale e segnala alle cellule

follicolari soprastanti di divenire dorsali più alte. Il segnale di dorsalizzazione inviato dal nucleo è il

prodotto dal gene gurken (viene trascritto nell'oocito aploide). L'mRNA così prodotto si localizza in

una zona semilunare tra il nucleo e la membrana dell'oocito e la proteina prodotta forma un

gradiente antero posteriore lungo la superficie dorsale dell'oocito. La proteina può diffondere poco e

per questo raggiunge le cellule follicolari più vicine al nucleo. Se tale gene è mutante nella madre si

ottengono sia le cellule follicolari che l'oocito ventralizzati, mentre se riguarda solo le cellule

follicolari solo esse saranno ventralizzate e l'embrione sarà normale.

La proteina gurken viene recepita da un recettore, codificato dal gene torpedo, che si trova sulle

cellule follicolari. Se tale recettore è mutante si ottengono embrioni ventralizzati.

Quando torpedo viene attivato si ha la repressione del gene pipe. Esso viene attivato solo nelle

cellule follicolari ventrali e qui attiva nudel, che viene poi secreta in direzione della membrana

plasmatica delle cellule ventrali dell'embrione. Essa poco più tardi dà il via allo sviluppo di tre

serinproteasi che sono secrete dall'embrione nel fluido perivitellino. Esse sono prodotte in forma

inattiva e vengono attivate mediante il distacco di una parte peptidica. Nudel attiva la prima, che poi

attiva la seconda che infine scinde la terza. Quest'ultima scinde la proteina Spatzle che può legarsi

al proprio recettore sulla membrana dell'oocito, il prodotto del gene materno toll. Esso è distribuito

in maniera uniforme nella membrana cellulare dell'uovo ma viene legato solo nella parte dove è

presente Spatzle ovvero nella parte ventrale.

Toll attiva la proteinchinasi pelle che fosforila cactus. Essa una volta fosforilata non è più in grado

di legare dorsal che quindi entra nel nucleo delle cellule ventrali.

La proteina dorsal a questo punto si occupa, grazie alla sua distribuzione secondo un gradiente, di

specificare le cellule in cui si trova. Il gradiente si forma grazie al gradiente di spatzle che ha il

livello più elevato nella parte ventrale.

Osservando una mappa presuntiva al 14esimo ciclo di divisione

si vede in evidenza il fatto che le 16 cellule con la più alta

concentrazione di quest'ultima diventeranno mesoderma, mentre

le cellule successive verso l'alto divengono gliali e neuroni, le

due cellule ancora successive divengono epidermide ventrale e

formano la catena nervosa ventrale ed infine le 9 cellule al di

sopra formano l'epidermide dorsale. Le 6 più dorsali invece

formeranno il rivestimento aminosieroso dell'embrione.

Nella gastrulazione il primo evento è l'invaginazione delle 16

cellule che formeranno tessuti muscolari, adiposi e le gonadi.

Dorsal agisce su di esse in due modi:

attiva geni specifici che danno origine al fenotipo mesodermico che hanno enhancer che

✔ richiedono elevate quantità della proteina dorsal;

inibisce i geni dorsali

essa quindi agisce sia come attivatore che come repressore.

I geni che attiva sono twist, snail e rhomboid: il primo attiva geni mesodermici, il secondo reprime

quelli non mesodermici come rhomboid. Quest'ultimo non viene quindi espresso nelle più ventrali

ma in quelle adiacenti al mesoderma in modo da formare l'ectoderma neurale presuntivo. I livelli

intermedi di dorsal poi attivano la trascrizione del gene short gastrulation in due strisce laterali che

stanno a fianco della regione in cui si esprime twist e codifica per una proteina che impedisce

all'ectoderma di divenire ipoderma e dà inizio ai processi di differenziamento neurale.

→esperimento = chimere della linea germinale ottenute scambiando le cellule polari = sono state

scambiate le cellule polari di un embrione wt con quello di una madre con un difetto in torpedo.

L'embrione wt con cellule derivanti da difetto di torpedo danno origine a femmine di tipo selvatico

mentre l'altro dà origine a femmine con difetto torpedo che depongono uova wt. Le uova con difetto

di torpedo nell'ovario wt producono embrioni normali mentre le uova wt in un ovario di madre

mutante danno origine a embrioni ventralizzati.

Notare analogia con le cellule della linea linfoide = il percorso descritto per la proteina Dorsal è

molto simile a quello che si verifica nei mammiferi con il trasferimento del fattore di trascrizione

NF-kB nel nucleo dei linfociti. Infatti si nota un'analogia tra Dorsal e NF-kB, tra I-B e Cactus, tra

la proteina Toll e il recettore dell'interleuchina 1, tra la proteina Pelle e una protein chinasi associata

a IL-1 e tra le sequenze sul DNA riconosciute da Dorsale e quelle riconosciute da NF-kB.

ZEBRAFISH

i pesci zebra hanno prole numerosa, si riproducono tutto l'anno, sono facili da mantenere, hanno

embrioni trasparenti che si sviluppano fuori dell'organismo materno ed infine possono essere

facilmente allevati in modo da poter selezionare e propagare i mutanti. Il loro sviluppo è molto

rapido così che circa 24 ore dopo la fecondazione l'embrione ha formato la maggior parte dei suoi

tessuti e degli abbozzi degli organi.

La fecondazione è appunto esterna e si possono ottenere tra le 100 e le 200 uova.

Questo pesciolino è molto utile in quanto che dal punto di vista genetico c'è omologia di circa il

70% con l'uomo ed è facilmente manipolabile.

Per ottenere un mutante di zebrafish in genere si espone un maschio ad un agente mutageno in

modo da far mutare le cellule della linea germinale. In seguito lo si fa incrociare con una femmina

wt e si osserva la mutazione nella progenie. A seconda dell'allele dominante o recessivo potrò

osservare il risultato della mutazione sin dalla prima generazione o in seguito a ulteriori incroci.

Esso è il primo organismo nella quale è stata effettuata una mutagenesi intensiva.

L'uovo di zebrafish è telolecitico e la segmentazione è di tipo meroblastico, le divisioni non sono

complete e questo permette il passaggio di molecole da una cellula a un'altra.

Nelle prime 12 divisioni riveste un ruolo importante l'mRNA materno ed è perciò da tenere di conto

che mutazioni in queste fasi potrebbero essere dovute allo zigote o alle combinazioni materne.

È possibile fondere il gene della GFP con promotori ed enhancer di zebrafish e poi inserire il tutto

negli embrioni. In questo modo si può osservare dove si vanno a localizzare ed esprimere specifici

geni. Gli embrioni inoltre sono sensibili alle molecole morfoliniche antisenso ( A Morpholino is a

type of oligomer molecule used in molecular biology to modify gene expression. Its molecular structure

has DNA bases attached to a backbone of methylenemorpholine rings linked through

) e a piccole molecole disciolte in acqua, caratteristica che ci consente

phosphorodiamidate groups.

di poterli usare per testare farmaci che potrebbero essere dannosi per lo sviluppo dei vertebrati.

Lo ione calcio ha un ruolo importante in queste prime fasi, esso stimola le contrazioni del

citoscheletro actinico determinando l'accumulo del citoplasma nel polo animale dell'embrione e ha

anche un ruolo nelle successive contrazioni, nella determinazione dell'asse destra-sinistra, per

approfondire il solco di segmentazione e per riparare la membrana dopo la separazione dei

blastomeri.

SEGMENTAZIONE

ha luogo principalmente nel blastodisco, ovvero in quella regione sottile di citoplasma che è privo

di vitello e che si trova al polo animale. Le divisioni non dividono completamente l'uovo e per

questo si definisce meroblastica discoidale (interessa solo il blastodisco). Le onde di calcio, che

iniziano in seguito alla fecondazione, stimolano la contrazione del citoscheletro actinico che va a

spremere il citoplasma del polo animale. L'uovo acquista così una forma piriforme con il

blastodisco in posizione apicale.

Le prime divisioni sono meridiane ed equatoriali, sono rapide e durano circa 15 minuti ciascuna. Le

prime 12 divisioni sono sincrone e portano alla formazione di un piccolo cumulo di cellule al polo

animale, che costituisce il blastoderma, e che sta al di sopra della grande cellula del tuorlo. In questa

fase le cellule mantengono connessioni le une con le altre e si ha così il passaggio di molecole.

Dalla 10ima divisione si ha la MBT come in Xenopus, inizia la trascrizione dei geni dello zigote e

le divisioni cellulari rallentano. Si identificano tre diverse popolazioni cellulari:

strato sinciziale del vitellino = si forma quando le cellule al margine vegetativo del

✗ blastoderma si fondono con la sottostante del vitello. Si ha una disposizione anulare dei

nuclei in seno a quella parte del citoplasma che si trova subito al di sotto del blastoderma.

Si forma poi lo strato sinciziale del vitellino interno = ottenuto dallo spostamento di alcuni

nuclei del sincizio al di sotto del blastoderma dovuto alla espansione di quest'ultimo verso

il polo vegetativo e dell'avvolgimento della cellula del vitello. Altri nuclei invece si

spostano in direzione del polo vegetativo e si arrestano davanti al margine del blastoderma

formando lo strato sinciziale esterno.

Strato di rivestimento o EVL = è formato dalle cellule più superficiali del blastoderma che

✗ formano una lamina epiteliale monostratificata. Esso diviene poi il periderma che è un

rivestimento extraembrionale con funzione protettiva

cellule profonde = sono le cellule tra lo strato di rivestimento e lo strato sinciziale e che

✗ daranno origine all'embrione vero e proprio.

Il destino delle cellule viene determinato poco prima che inizi la gastrulazione.

GASTRULAZIONE

il primo movimento è l'epibolia delle cellule del blastoderma al di sopra del vitello: le cellule

profonde si spostano verso l'esterno intercalandosi tra quelle più superficiali. Queste cellule poi si

spostano verso il polo vegetativo, sulla superficie del vitello. Tale movimento però non è dovuto ai

blastomeri stessi ma è una conseguenza della espansione dello strato sinciziale dentro alla cellula

del vitello. È stato visto che se si interrompe la connessione tra YSL e EVL le cellule di quest'ultimo

e quelle profonde tornano indietro alla sommità del tuorlo, mentre Ysl continua la sua espansione

attorno alla cellula del tuorlo.

Mentre procede l'epibolia le cellule del blastoderma profondo colmano lo spazio che si viene a

formare tra lo strato sinciziale e quello di rivestimento. Nel corso dell'epibolia un lato del

blastoderma diviene più spesso dell'altro e questa sarà la sede della futura superficie dorsale

(scoperto tramite esperimenti di marcatura cellulare).

Dopo che è avvenuta circa il 50% dell'epibolia si ha un ispessimento del margine del blastoderma

che effettua l'epibolia e diviene l'anello germinativo. Esso è formato da uno strato superficiale,

chiamato epiblasto, che darà origine a vari precursori neurali e all'epidermide e uno profondo,

chiamato ipoblasto, che darà origine ai precursori del mesoderma e dell'endoderma.

La formazione dell'epiblasto e dell'ipoblasto si forma attraverso due processi che si pensa

avvengano insieme:

delaminazione, ovvero spostamento verso l'interno delle cellule che formeranno l'ipoblasto

• epibolia delle cellule superficiali del blastoderma e loro migrazione verso il polo animale

• sempre per formare lipoblasto.

Una volta formati questi due strati alcune cellule dell'uno e dell'altro si intercalano nel futuro lato

dorsale formano un ispessimento localizzato che prende il nome di scudo embrionale. Esso è

l'equivalente dal punto di vista funzionale del labbro dorsale del blastoporo visto negli anfibi (è in

grado di indurre la formazione di un secondo asse embrionale quando viene trapiantato in un

embrione ospite). A partire dallo scudo l'epiblasto si allunga in tutta la linea dorsale dell'embrione

per estensione convergente e si riconosce in questa zona il cordomesoderma, che formerà la

notocorda. Ai suoi lati troviamo poi il mesoderma parassiale che contiene le cellule che formeranno

i somiti mesodermici dai quali poi si otterrà la muscolatura.

I movimenti di convergenza e di estensione dell'epiblasto portano le cellule neurali presuntive nella

linea mediana dorsale dove formano la chiglia o carena o piastra neurale. Essa è una larga fascia di

precursori neurali che si estendono sopra il mesoderma parassiale e assiale. Invece le cellule che

restano nell'epiblasto formeranno l'ectoderma.

Al polo vegetativo si chiude infine l'anello che formava lo scudo e si forma così l'embrione vero e

proprio con un'epibolia al 100%. A questa stadio di possono già osservare diversi foglietti

embrionali.

FORMAZIONE ASSI

lo scudo embrionale è di importanza notevole per poter stabilire l'asse dorso-ventrale. È in grado di

convertire il mesoderma laterale e ventrale in dorsale ed è in grado di indurre l'ectoderma a divenire

neurale invece che epidermico. Questi dati sono stati ottenuti da trapianti dello scudo nelle varie

zone di embrioni. →dimostrazione che esso è l'omologo del labbro dorsale del blastoporo degli

anfibi.

Lo scudo forma la placca precordale e la notocorda e i precursori di questi due sono responsabili

dell'induzione dell'ectoderma neurale. I pesci specificano l'epidermide con proteine morfogenetiche

dell'osso BMP e con alcune Wnt. Come negli anfibi le BMP e certe Wnt prodotte nelle regioni

ventrali e laterali indurrebbero la formazione di epidermide a partire da ectoderma. La notocorda

secerne fattori che bloccano tale induzione e permette così all'ectoderma di divenire neurale. Nei

pesci la proteina BMP2B induce le cellule embrionali a diventare ventrali e laterali e Wnt8 le

induce a divenire laterali, ventrali e posteriori.

Il cordomesoderma poi, produce un fattore paracrino detto Chordino che si lega alla BMP2B e la

inattiva permettendo la formazione del tubo neurale. Se il gene che codifica per esso è mutato il

tubo neurale non si forma correttamente. Inoltre se i suoi omologhi noggin e follistation, sono

inattivati il tubo non si forma proprio.

Esistono poi Fattori FGF che sono prodotti dalle regioni dorsali e che inibiscono l’espressione

genica di BMP, e i Fattori IGF (insulin growth factor) che sono prodotti in tutto l'embrione ma

sono attivati solo nella parte anteriore. Essi aumentano la trascrizione di Chordino e di goosecoid

che sono gli inibitori di BMP. a

I morfolini antisenso di Wnt8 e Wnt3 portano a un'anteriorizzazione che fa pensare che gli inibitori

di Wnt siano coinvolti nella formazione della testa.

Riveste un ruolo importante anche la β-catenina che viene accumulata nei nuclei di quella parte

dello strato sinciziale vitellino che diverranno appunto lo scudo embrionale. Essa contraddistingue

la strato sinciziale dorsale dalle regioni laterali e ventrali. Se infatti la iniettiamo in regioni ventrali

esse diverranno dorsalizzate e si avrà la formazione di un secondo asse. La βcatenina si combina

con altri fattori e agisce come fattore di trascrizione sui geni Squint e Bozozok che sono simili alle

proteine che attuano il mesoderma negli anfibi.

Quindi la parte dorsale della cellula del tuorlo ed i blastomeri marginali dorsali precursori delle

cellule di Kupferr sono considerate il centro di Nieuwkoop dell’embrione dei pesci teleostei,

(analogamente a quanto osservato negli anfibi).

L'asse antero-posteriore si forma grazie a un

gradiente di espressione dell'acido

retinoico che agisce come morfogeno

e che induce alla posterizzazione,

assieme FGF e Wnt. Il suo gradiente

si forma sulla base di regolatori che si

trovano a monte. FGF e Wnt attivano

un gene che codifica per VitA che poi

viene convertito in acido retinoico.

FGF e Wnt hanno poi, anche la

funzione di inibire due diverse vie del segnale. Wnt inibisce l'espressione di geni anteriori e FGF e

l'acido attivano i geni posteriori. Tutto il processo sembra coordinato dall'azione dell'enzima 4

idrossilasi dell'acido retinoico. Il gene che codifica per esso è espresso nella parte anteriore, esso

reprime l'accumulo di AR in tale zona e così blocca l'espressione dei geni posteriori. Al contrario

Wnt e FGF sono espressi posteriormente inibiscono l'espressione di tale gene. L'AR agisce come

morfogeno e regola le proprietà della cellula in base alla sua concentrazione.

→ asse D/S= Zebrafish ha delle asimmetrie che si distinguono nelle aree del cervello e del cuore.

Importante per la differenziazione dell'asse destro-sinistro è la vescicola di Kuppfer un organo

transitorio contenente fluido che deriva da un gruppo di cellule dorsali vicine allo scudo germinale.

Attraverso un movimento ciliare si forma una corrente di ioni Ca che stimola Notch, Nodal e Pitx2

che portano alla specificazione della parte sinistra. La parte destra dell'embrione si sviluppa in

seguito a esposizione al segnale FGF.

Riassumendo:

Wnt inibiti nella parte dorsale

FGF inibiscono dorsalmente le BMP

IGF aumentano la trascrizione di chordino e goosecoid

β-catenina deriva da mRNA materni e si accumula nello strato sinciziale del tuorlo che si trova sotto

alle cellule che formeranno lo scudo.

→ Zebrafish nella ricerca biomedica

approccio forward = uso una molecola che mi provoca una mutazione e poi vado a studiare

➔ la mutazione ottenuta

approccio reverse = so quale gene è coinvolto in quella patologia umana , lo modifico in

➔ zebrafish e vedo cosa succede;

uso il morpholino = è una molecola con sequenze antisenso ad una regione o a un tRNA

➔ oppure blocco lo splicing oppure la traduzione e si osserva cosa accade nell'embrione. È una

modificazione transiente poiché il suo effetto dura un giorno solo.

TALENs e CRISPR/Cas9 inducono mutazioni in punti specifici (delezioni o mutazioni

➔ puntiformi).

Talidomide = è un antidolorifico che, se assunto da donne incinte, con molta probabilità dà

➔ origine a figli senza arti superiori. Nel momento in cui si espongono gli embrioni a tale

composto si ha la formazione di una larva senza pinne laterali.

zebrafish inoltre viene usato come modello di studio in campo oncologico. In esso si può

➔ indurre l'insorgenza spontanea di tumori.

TUNICATI (ascidie)

le ascidie sono invertebrati cordati: nella forma larvale, molto simili a quelle dei vertebrati, hanno la

notocorda ma non hanno vertebre. Gli adulti sono organismi sessili e sono animali filtratori e per

questo hanno un sifone boccale e uno atriale. Dal primo entra l'acqua marina ed essa poi viene

rilasciata dall'altro assieme a tutto ciò che non è utile all'organismo. Hanno una cintura cefalica, una

coda, un tubo neurale, una vescicola celebrale, un organo fotosensibile, cuore, muscoli e otoliti per

l'equilibrio.

La larva si allontana e prende contatto con un substrato. L'adulto secerne della cellulosa che va a

ricoprirla formando la tunica.

→ teoria della neotenia = secondo la quale i vertebrati si sono evoluti dai tunicati le cui larve hanno

maturato le gonadi.

Sono particolari rispetto al riccio di mare poiché presentano delle regioni colorate che permettono di

avere una specie di mappa del destino in vivo.

Hanno una segmentazione oloblastica bilaterale (che è tipica della maggior parte dei tunicati). Il

primo piano di segmentazione è meridiano e stabilisce il futuro asse di simmetria dell'embrione

dividendolo nelle sue future parti destra e sinistra. Tutte le divisioni seguenti sono orientate verso

questo asse di simmetria. La seconda divisione è quella che determina la formazione dell'asse

antero-posteriore ed essa non passa perfettamente dai poli e fa in modo che si creino quindi due

cellule anteriori leggermente più grandi delle due posteriori. Il terzo piano è equatoriale e genera 4

blastomeri nella parte animale e altri 4 nella vegetale. Gli embrioni dei tunicati hanno

specificazione autonoma in quanto ogni cellula acquisisce un tipo specifico di citoplasma che

determinerà il suo destino.

La parte animale dà origine all'ectoderma mentre la metà vegetativa dà origine all'endoderma, al

mesoderma e alla muscolatura.

Le diverse colorazioni che si possono osservare derivano da pigmenti che si trovano localizzati nel

citoplasma o nel nucleoplasma: giallo esterno circolare, grigio interno. Al momento della meiosi si

ha il primo movimento di queste zone colorate con il nucleoplasma che si sposta nel citoplasma,

mentre alla fecondazione dopo che il pro-nucleo maschile è entrato nell'emisfero vegetativo il

citoplasma giallo e quello chiaro derivato dalla disgregazione del nucleo si retraggono verso questo

polo in direzione dello spermatozoo. Lo spermatozoo poi si sposta verso regioni animali, viene

seguito dal citoplasma chiaro e da quello giallo. La posizione finale del citoplasma giallo, semiluna

gialla, indica dove si formeranno i muscoli della coda e che marcano precocemente il lato

posteriore-dorsale.

Allo stadio di 64 cellule si forma un piccolo blastocele e inizia la gastrulazione. A partire dal polo

vegetativo. Nei tunicati in particolare la gastrulazione è la medesima dei deuterostomi nei quali alla

fine il blastoporo diverrà l'ano. Nei tunicati si ha l'invaginazione dell'endoderma, l'embolia del

mesoderma (o involuzione, che è una specie di giro di boa) e l'epibolia dell'ectoderma con la quale

si va a ricoprire l'embrione e le labbra del blastoporo vanno a avvicinarsi sempre di più.

Si osservano in questo

caso:

→ specificazione

autonoma =

nell'endoderma

dell'intestino, nel

mesoderma muscolare,

nell'ectoderma cutaneo e

nel cordone nervoso;

→specificazione

condizionata per

induzione = cervelllo,

notocorda, cellule

mesenchimali.

Con l'impiego di tecniche

di ibridazione di RNA

Nishida e Sawada

trovarono che certi

mRNA sono presenti in

quantità elevate nell'emisfero vegetativo di un tunicato. Uno di questi messaggi codifica per il

fattore di trascrizione a dita di Zn macho-1. Se si elimina con mRNA antisenso gli embrioni che si

avranno saranno prive dei muscoli discendenti dai blastomeri. Inoltre i due studiosi si accorsero che

se iniettavano tale mRNA in ellule che non formavano muscoli si ottenevano cellule muscolari.

Nei tunicati è importante anche l'azione della β catenina che specifica i blastomeri vegetativi a

divenire endoderma.

→ ESPERIMENTI: ricorda hanno uno sviluppo prevalente di tipo a mosaico.

La regione più visibile dell'embrione è la semiluna gialla che darà origine ai muscoli. In particolare

all'interno di questa zona abbiamo un gene che si chiama macho-1 e lo troviamo espresso sempre

nelle cellule che contengono la semiluna. Gli studiosi si sono chiesti se fosse proprio tale gene il

responsabile della formazione del tessuto muscolare. Furono allora fatti degli esperimenti di sovra

espressione del gene o di espressione ectopica o di sua inattivazione. In particolare l'inattivazione è

stata fatta facendo legare al mRNA di macho-1 un mRNA antisenso in modo da impedirne la

traduzione. Osservando le larve si notò che esse non avevano la maggior parte della muscolatura e

che avevano le code molto piccole.

Nel caso di iniezioni di macho-1 in zone ectopiche si è osservata la trasformazione di cellule

ectodermiche in muscolari. L'insieme di questi risultati ha confermato il ruolo fondamentale di

questo gene.

È stato visto inoltre che in questa zona è fondamentale anche l'azione di un'altra serie di geni che si

occupano di reprimere lo sviluppo della notocorda. In particolare c'è un gene che si occupa di

attivare un gene di nome snail, il quale poi reprime il gene che appunto si occupa della formazione

della notocorda.

Un ulteriore gene importante è la β catenina che è espressa nelle regioni con destino endodermico.

Se la sua produzione viene bloccata le cellule che avrebbero un destino endodermico divengono

ectodermiche mentre se viene effettuato un guadagno e la β catenina viene espressa ectopicamente i

blastomeri cambiano il loro destino e invece di formare l'epidermide formano l'endoderma.

XENOPUS

la femmina è più grande del maschio, la fecondazione è esterna.

→vantaggi e svantaggi dell'uso di Xenopus come organismo modello

prole tutto l'anno e numerosa grazie all'inoculazione di un ormone. Le uova sono molto

• grandi e gli embrioni sono tra i più grandi in natura (1-1,2 mm). C'è facilità di

micromanipolazione, resistenza degli adulti e degli embrioni alle infezioni ed è facile la

coltivazione di espianti.

Non si possono fare esperimenti di tipo genetico perché la fase di metamorfosi è molto

• lunga e lenta, come il raggiungimento della maturità sessuale. C'è difficoltà nell'ottenere

animali transgenici e il genoma non è completamente conosciuto.

Uovo degli anfibi

mesolecitiche = chiara pigmentazione al polo vegetativo e una più scura al polo animale. La

fecondazione avviene nella zone della calotta animale dove ci sono dei recettori specifici. Subito al

di sotto della membrana plasmatica si ha uno strato di citoplasma diverso, meno denso, chiamato

citoplasma corticale.

Il centriolo che si porta dietro lo spermatozoo è importante per la riorganizzazione e il movimento

del citoscheletro. Alla fecondazione si ha una rotazione del citoplasma corticale di circa 30° in

senso antiorario mentre il citoplasma interno rimane fermo. Tramite un esperimento che impedisce

la polimerizzazione dei microtubuli si è capito che la rotazione è proprio dovuta a questi ultimi. Tale

rotazione porta è ad avere una regione, dove prima c'era citoplasma scuro, che ora è occupata da

quello chiaro. In trasparenza così abbiamo una zona grigia che prende il nome di semiluna grigia.

La rotazione è fondamentale per la formazione dell'asse dorso ventrale e la semiluna si forma

proprio dalla parte (polo dorsale) opposta rispetto al punto di ingresso dello spermatozoo (polo

ventrale).

Nella maggior parte delle uova di salamandra e di rana la segmentazione è oloblastica con

simmetria radiale (come nel riccio di mare). A tale processo si oppone il vitello che è concentrato

nell'emisfero vegetativo.

La prima divisione inizia al polo animale e procede lentamente verso il polo opposto. Il secondo

piano di divisione è perpendicolare al primo ed è anch'esso meridiano. Il terzo piano è invece

equatoriale leggermente spostato verso il polo animale sempre per via della presenza del vitello. A

questo punto si hanno 4 piccoli blastomeri chiamati micromeri al polo animale e 4 più grandi

chiamati macromeri al polo vegetativo. I micromeri si divideranno più rapidamente rispetto ai

macromeri. Il ciclo cellulare dei primi blastomeri è regolato dal livello di un fattore promotore della

mitosi MPF nel citoplasma.

Un embrione di anfibio da 16-64 cellule è comunemente chiamato morula.

Alla 12° divisione si ha la mid blastula transition, le cellule attivano il genoma zigotico e iniziano a

muoversi.

A 128 cellule è evidente il blastocele e l'embrione è una blastula. Ci sono delle regioni all'interno

delle quali vengono pompati ioni e secrete proteine, l'acqua perciò viene richiamata all'interno. La

cavità si rigonfia ed è eccentrica e spostata verso la parte animale. Il blastocele qui assolve a due

importanti funzioni: permette la migrazione delle cellule durante la gastrulazione ed impedisce che

le cellule sottostanti ad esso interagiscano precocemente con quello localizzate al di sopra di esso.

Il mesoderma si forma normalmente dalle cellule animali che sono adiacenti ai precursori vegetativi

dell'endoderma dato che, questi ultimi, inducono appunto la formazione del mesoderma.

L'ectoderma si forma dalla calotta animale.

GASTRULAZIONE

negli anfibi la gastrulazione ha inizio nel futuro lato dorsale. Le cellule qui si invaginano formando

il blastoporo. Esse in particolare assumono una forma a bottiglia o a fiasco e innescano il

movimento di invaginazione. Mentre si muovono delimitano l'archenteron.

La fase successiva comporta l'embolia delle cellule della zona marginale mentre le cellule animali

vanno incontro a epibolia e convergono nel blastoporo. Quando le cellule marginali migrano

raggiungono il labbro dorsale del blastoporo, girano verso l'interno e si spostano lungo la faccia

interna delle cellule dell'emisfero animale. In questo modo le cellule che formano il labbro

cambiano di continuo e quello che lo formano per prime sono le cellula fiasco.

L'endoderma faringeo si viene a trovare così al di sotto dell'ectoderma ed in posizione più animale

rispetto al mesoderma che poi avrà movimenti di involuzione. Una volta che tali cllule passano

all'interno dell'embrione si invaginano per formare la placca precordale. Quelle che si invaginano

subito dopo formano il cordomesoderma che poi poi darà origine alla notocorda.

Il blastocele, in seguito a questi movimenti si viene a spostare sul lato opposto a quello del labbro

del blastoporo e quest'ultimo si estende ventralmente e lateralmente. Intorno al blastoporo

continuano i processi di invaginazione che lo portano ad originare labbri laterali e un labbro

ventrale. Si forma così il tappo vitellino ovvero l'insieme delle cellule endodermiche voluminose

disposte ad anello che sono state formate dal blastoporo.

Alla fine anche esso verrà portato all'interno in modo che tutto l'endoderma sarà così all'interno,

l'ectoderma fuori e il mesoderma si troverà tra gli altri due.

→è stato visto che se si rimuovono le cellule a fiasco, in Xenopus, l'embolia e la formazione del

blastoporo continuano. Inoltre lo spostamento del mesoderma e dell'endoderma all'interno

dell'embrione sono dovuti ad un movimento iniziale chiamato rotazione vegetativa. Questo

movimento comincia 2 ore prima della formazione delle cellule a fiasco ed è dato da movimenti

delle cellule interne che spingono le cellule della parte dorsale del pavimento del blastocele verso la

calotta animale. In questo caso si è visto che se si rimuovono le cellule della zona marginale (IMZ)

che attua l'embolia l'archenteron non si forma.

→movimenti nel dettaglio:

invaginazione= effettuata dalle cellule a bottiglia, entrano in gioco dei filamenti di actina

• che si contraggono e deformano la cellula;

involuzione= mesoderma ed endoderma. Non è grazie alla proliferazione che queste cellule

• si dispongono. Se sono le une accanto alle altre si intercalano tra di loro e formano un'unica

fila che appare come se in realtà fossero aumentate in numero.

estensione convergente= le cellule sono inizialmente molto tondeggianti e disposte su di una

• superficie piatta, poi divengono lamellipodi e si intercalano medio-lateralmente.

Epibolia= intercalazione cellulare radiale. Fatto dalle cellule ectodermiche in modo che

• possano coprire una superficie maggiore. In particolare si ha un pochino di proliferazione e

poi un movimento di epibolia. Le cellule in seguito si riarrangiano e passano da una

disposizione su molti strati a meno strati.

L'asse anteroposteriore è definibile solo a fine gastrulazione.

Alla fine della gastrulazione si hanno i 3

foglietti embrionali.

→Dall'ectoderma si origina: epidermide,

sistema nervoso e cresta neurale.

→Dal mesoderma notocorda, muscoli, rene,

sangue, osso.

→Dall'endoderma si origina il tubo

digerente, fegato, pancreas, tiroide ed

epitelio polmonare.

Archenteron = corrisponderà al lume del

canale digerente.

Mappa del destino di Xenopus

sono presenti anche dei sottoterritori presuntivi:

-ectoderma da' origine all'epidermide

-sistema nervoso si forma nella parte dorsale dell'ectoderma

-epidermide parte ventrale dell'ectoderma

-mesoderma dalla parte intermedia e marginale di cui il più dorsale forma la notocorda. Dalla parte

intermedia si forma anche il cuore, dai somiti le vertebre e dal mesoderma derivano il sangue e il

rene.

Si evince che tutto l'ectoderma allo stadio di blastula tardiva è specificato per diventare epidermide,

mentre nella zona circa equatoriale si notano delle differenze tra la mappa del destino e quella di

specificazione. Il sistema nervoso e il mesoderma intermedio si formano per interazioni con territori

vicini.

NEURULAZIONE

una parte dell'ectoderma dorsale è specificato a divenire ectoderma neurale e le sue cellule si

riconoscono perché sono colonnari. Questa regione dell'embrione viene chiamata placca neurale e la

neurulazione è il processo con cui tale zona forma il tubo neurale. Esso a sua volta formerà

anteriormente l'encefalo e il midollo spinale posteriormente.

Esistono due meccanismi con i quali si può avere questo processo di trasformazione della placca in

tubo neurale:

→ neurulazione primaria= le cellule circostanti la placca neurale istruiscono le cellule della placca a

proliferare, invaginarsi e staccarsi dalla superficie formando un tubo cavo.

→ neurulazione secondaria= il tubo si origina per saldatura di cellule mesenchimali (sono cellule

staminali) che formano un cordone solido che successivamente si cavita per apoptosi.

Nella rana si ha un tipo di neurulazione che è primaria. In particolare si ha l'appiattimento

dell'ectoderma dorsale e l'internalizzazione di questa parte. Tale processo inizia quando il

mesoderma dorsale sottostante comunica alle cellule ectodermiche che devono accrescersi e

assumere una forma colonnare. Si forma così quella che è chiamata piastra o placca neurale che

assume la sua forma per movimenti estrinseci della regione dell'epidermide e della placca neurale

stessa.

Successivamente, i bordi della piastra neurale si incurvano e formano una specie di piega che

cominciano piano piano a sollevarsi. Si formano così una doccia neurale al centro e dei punti

cardine laddove prende contatto con i tessuti vicini che sono chiamati: MHP e DLHP. Le cellule

della linea mediana sono dette cellule del punto cardine mediale ed esse si ancorano alla notocorda

(che si trova al di sotto e attorno alla quale il mesoderma parassiale comincia a formare diverse

strutture) e formano un cardine, il quale forma un solco sulla linea mediana dorsale. In particolare la

notocorda gli fa assumere una forma a cuneo riducendo la loro altezza. Successivamente altre due

regioni divengono “cardini”, le DLHP, esse sono i punti cardine dorsolaterali e sono ancorate

all'ectoderma superficiale delle pieghe neurali. Queste cellule aumentano la loro altezza e diventano

cuneiformi grazie ai microtubuli e ai microfilamenti. In questo processo si hanno anche altre forze

estrinseche come l'ancoraggio della placca neurale al

mesoderma.

Alla fine le cellule si incontrano e si fondono tra di

loro formando il tubo neurale. Le cellule vicine al

punto di giunzione sono quelle della cresta neurale

(negli uccelli si staccano una volta avvenuta la

fusione mentre nei mammiferi si staccano poco

prima che avvenga).

La neurulazione secondaria invece, prevede che

all'inizio si abbia un cumulo di cellule che si addensa

e che formano una specie di cordone di ectoderma.

In seguito si ha la morte programmata di alcune

cellule e si inizia così a formare una cavità centrale

nel cordone dalla quale si ottiene il tubo neurale.

verde = cresta neurale

blu = epidermide

viola = piastra neurale

giallo = notocorda

si può vedere la formazione delle creste neurali e della doccia neurale a forma di U che divide i

futuri lati destro e sinistro dell'embrione.

Il tubo neurale si chiude quando le pieghe neurali appiattite si uniscono al livello della linea

mediana dorsale e in alcune specie le cellule di giunzione formeranno la cresta neurale.

Il tubo poi si differenzia nelle varie parti del sistema nervoso centrale e tale differenziamento

avviene simultaneamente e in 3 diversi modi:

1. livello anatomico macroscopico = il tubo e il suo lume hanno restrizioni che formano le parti

dell'encefalo e del midollo spinale.

2. livello tessutale =Le popolazioni cellulari della parete del tubo si organizzano per formare

encefalo e midollo spinale.

3. livello cellulare = le cellule del neuroepitelio formano neuroni e glia.

Negli anfibi si ha del tessuto nervoso derivante dal tubo neurale anche nella coda ed esso deriva da

una neurulazione secondaria.

Le cellule delle creste neurali sopra citate possono essere considerate come un quarto foglietto

embrionale e possono formare diversi tessuti ed organi.

→Nell'uomo: Il tubo neurale nell'uomo, ma come in tutti i vertebrati, inizialmente è una struttura

rettilinea e prima ancora che si sia formata la sua parte posteriore quella anteriore subisce molte

modificazioni. Essa si dilata nelle tre vescicole primarie che origineranno proencefalo, mesencefalo

e romboencefalo. Quando si chiude la porzione posteriore dal proencefalo si sono espanse le due

vescicole ottiche. Esso poi si divide anteriormente in telencefalo e diencefalo posteriormente. Il

mesencefalo invece non si suddividerà al contrario del romboencefalo che formerà mielencefalo

posteriormente (midollo allungato) e metencefalo anteriormente (formerà il cervelletto).

→ Anatomia

dell'embrione allo

stadio di bottone

caudale = è

l'abbozzo della coda,

questo stadio dura

poco più di 24 ore

alla temperatura di 18 °C. Abbiamo la testa, le vescicole ottiche che formano la coppa ottica mentre

la bocca non si è ancora formata e si hanno le strutture metameriche che si trovano accanto alla

notocorda e che prendono il nome di somiti. Il resto del mesoderma non è metamerico.

Abbiamo anche una cavità interna che in alcuni può anche permanere nello stadio di adulto.

La struttura dell'embrione a questo stadio permette di individuare i seguenti somiti:

miotomo= è la regione più interna che guarda la notocorda e darà origine alla muscolatura

• striata.

dermatomo= è in posizione più esterna e darà origine al derma.

• Mesomero= è una strozzatura che resta poi in connessione con le lamine laterali e formano il

• sistema uro-genitale.

sclerotomo= è la parte interna del miotomo che inizia ad allungarsi e dà origine alle vertebre

• e alle loro cartilagini.

somatopleura= lamina laterale più esterna, che dà origine alla muscolatura viscerale della

• testa e al pericardio.

splacnopleura= lamina laterale più interna, che dà origine alla muscolatura liscia, miocardio,

• endocardio ed endotelio.

Le lamine laterali in uno stadio più avanzato vanno a prendere contatto tra di loro ma non si

uniscono e formano così il mesentere ventrale.

A questo stadio inoltre il tubo neurale e l'intestino sono in continuità e solo successivamente si

separeranno.

ESPERIMENTI SUGLI ANFIBI

come si è capito che il punto in cui lo spermatozoo entra nella cellula uovo, fa avvenire la

• ROTAZIONE CORTICALE che a sua volta è fondamentale per determinare l'asse dorso-

ventrale = si è capito bloccando la rotazione che avviene ad opera dei microtubuli.

Utilizzando i raggi UV per impedire la loro polimerizzazione si sono ottenuti dei girini che

mancavano delle strutture dorsali e di alcune ventrali, dato che sono parti tra di loro

collegate. In particolare si può avere un blocco parziale della rotazione ed osservare cosa si

ottiene.

Se si irraggia con UV dalla parte vegetativa solo per pochi minuti si ottiene una rotazione di

18° e un embrione con quasi tutte le strutture dorsali. Se invece si irradia

per alcuni minuti la

rotazione è di 10° e si

ha lo sviluppo di parti

ventrali e alcune

laterali e il

mesoderma

parassiale.

Se invece il tempo di

irradiamento è di

circa 30 minuti si

formano solo le

strutture ventrali, la

rotazione è

completamente

bloccata e si ottiene

una struttura informe.

L'embrione tende ad

essere ventralizzato e

quindi si può dedurre

che l'ectoderma che

dà origine

all'epidermide è tutto dorsale, mentre del mesoderma e dell'endoderma si formano solo le

parti ventrali.

Modo per RECUPERARE UN EMBRIONE VENTRALIZZATO (Esperimento di rescue)=

• dato che a questo tipo di embrione manca qualcosa gli scienziati hanno provato a cercare

cosa mancasse trapiantando diversi blastomeri di un embrione normale. Hanno visto così

che c'è un

blastomero in

particolare che, se

trapiantato, può

far tornare

l'embrione

normale: è un

blastomero

vegetativo più

grande di quelli

animali e che si

trova nella parte

dorsale.

1) Esperimento

per studiare tale blastomero = sono state prese due cellule uovo normali e allo stadio di

embrione a uno dei due è stato prelevato tale blastomero. All'altro è stato tolto il blastomero

vegetativo ventrale e al suo posto è stato messo quello prelevato (vegetativo dorsale).

Osservando lo sviluppo fino allo stadio di girino si è visto che già alla gastrulazione esso

presentava due labbra dorsali del blastoporo. Nella nerulazione si osserva una forma ad Y

dovuta alla formazione di un secondo asse corporeo. Si ha quindi una specie di gemelli

siamesi: da una parte in poi del tronco si ha una perfetta duplicazione del corpo mentre la

coda è in comune.

2) Esperimento per studiare tale blastomero= è stato preso il citoplasma corticale del

blastomero vegetativo dorsale ed è stato iniettato nel blastomero ventrale. Si è avuto lo

stesso fenomeno. Hanno potuto dedurre che è necessario il citoplasma di questo blastomero

per avere la formazione dell'asse. Evidentemente contiene sostanze responsabili dello

sviluppo. Solo quello corticale ha queste capacità quello più profondo non le ha.

Peculiarità del labbro dorsale =

• A) sono state fatte delle legature per capire se esso aveva una funzione nello sviluppo

dell'embrione. Allo stadio di gastrula precoce è stata fatta una legatura in modo da dividerlo

in due metà, in ognuna delle quali era presente mezzo labbro dorsale. Ogni metà ha dato

origine a un embrione completo grande la metà di un embrione “normale”.

B) la legatura è stata fatta in modo che una metà abbia il labbro dorsale e l'altra no. La prima

metà si sviluppa in un embrione normale mentre l'altra sviluppa una parte vegetativa che

non si differenzia.

Dal primo esperimento sembra che il labbro abbia un ruolo regolativo nello sviluppo mentre

nel secondo abbiamo una risposta mista e sembra rientrare meglio in uno sviluppo del tipo a

mosaico. È una prova che questi due modelli dello sviluppo sono molto approssimativi e che

il labbro dorsale è una struttura importante.

Sviluppo regolativo o a mosaico =

• A) prelevare allo stadio di gastrula precoce l'ectoderma dorsale (il neurale presuntivo) e

trapiantarlo in posizione ectopica in una porzione di ectoderma ventrale dopo averlo

colorato. Per seguire lo sviluppo le cellule sono state colorate. L'embrione viene fatto

sviluppare fino allo stadio di neurula precoce e si osserva che il frammento è divenuto

epidermide. Ciò ci fa capire che le cellule che lo compongono non erano ancora state

specificate. Si può considerare un esempio di sviluppo regolativo.

B) si ripete l'esperimento ma le cellule prelevate sono allo stadio di gastrula tardiva e

vengono trapiantate in una gastrula tardiva (omocronico). Viene messo al posto

dell'epidermide presuntiva che è stata eliminata. Si lascia arrivare fino allo stadio di neurula

precoce e si osserva la formazione di una parte di una piastra neurale. In questo secondo

caso sembra uno sviluppo a mosaico.

Trapianto del labbro dorsale =

• A) viene prelevato il labbro dorsale da una gastrula precoce e viene trapiantato in posizione

ventrale ad un'altra gastrula precoce. Si osserva (utilizzando un organismo wild type e uno

albino o con colorazioni) la formazione di due labbra e quando si lascia sviluppare

l'organismo si può osservare di nuovo la formazione di gemelli siamesi fusi per la parte

ventrale. Uno dei due è più grosso dell'altro e le cellule pigmentate si trovano nell'asse del

più piccolo. Inoltre è stato visto che non tutte le cellule del più piccolo erano segmentate,

avevano utilizzato anche cellule dell'embrione e quindi il labbro dorsale era stato in grado di

reclutarle e riprogrammarle. È stato visto anche che la notocorda derivava dal labbro dorsale

trapiantato. Il tubo neurale e i somiti derivavano invece dall'ospite. Da ciò si evince che il

labbro dorsale è l'unico ad avere un destino già determinato. Inoltre viene chiamato

ORGANIZZATORE proprio perché riesce a reclutare le altre cellule.

B) È stato fatto anche un altro esperimento in cui, dato che la gastrula precoce ha un

blastocele abbastanza ampio, si pratica un piccolo taglio al livello del polo animale e vi si

inserisce un labbro dorsale. In particolare una volta venne inserito un labbro dorsale precoce

e poi uno tardivo. La ferita viene saldata e quindi la gastrula ha al suo interno il labbro.

Seguendo gli spostamenti del blastocele esso finirà in posizione ventrale. Si osserva lo

sviluppo fino allo stadio di girino e si osserva che si forma, nel caso del labbro precoce, un

asse secondario e le strutture della testa mentre, nel caso del labbro tardivo si osserva l'asse

primario con sotto il secondario indotto che è costituito dal solo tronco e coda e mancano le

strutture della testa. (organizzatore testa = labbro precoce, organizzatore coda e tronco =

labbro tardivo). Ciò si spiega perché i due labbri sono costituiti da cellule diverse in quanto

che sono il punto di boa attorno al quale girano le cellule: le prime che vi passano sono

quelle con destino anteriore mentre le altre hanno destino posteriore.

In conclusione si può dedurre che il labbro dorsale o organizzatore può:

→guidare i movimenti della gastrulazione tramite l'induzione neurale,

→rendere neurale l'ectoderma,

→dorsalizzare il mesoderma. Il labbro dorsale manda dei segnali che servono per formare il

tessuto nervoso.

L'organizzatore è sufficiente o no per indurre il NEUROECTODERMA= si fanno degli

• espianti di organizzatore e tessuto ectodermico e si mettono a contatto tra di loro in piastra.

Si può osservare la formazione di tessuto nervoso. Per capire poi, se il contatto tra i due

fosse davvero necessario è stato riproposto lo stesso esperimento ma tra i due è stato posto

un filtro che ha dei pori per il solo passaggio delle sostanze. Anche in questo caso si ha la

formazione del tessuto nervoso. Quindi l'induzione avviene per mezzo di segnali diffusibili.

Labbro→ involuzione → mesoderma sotto ectoderma → induzione con segnali verticali,

sono molecole rilasciate dal mesoderma e che raggiungono l'ectoderma.

Prima dell'involuzione →organizzatore → segnali planari, rilascia molecole → raggiungono

ectoderma che è in continuità con quello che diverrà il labbro dorsale del blastoporo.

Ciò è stato verificato tagliando via due tasselli da due gastrule precoci diverse ma allo stesso

stadio che presentassero nella parte più vegetativa il mesoderma dorsale e in quella più

animale l'ectoderma. Vengono posti l'uno accanto all'altro (sandwich) e poi posti in piastra di

Petri con fisiologica. In seguito sono stati schiacciati. Tutto ciò serve per impedire i

movimenti di involuzione e per vedere se l'induzione è dovuta a segnali verticali o planari.

Si osserva che l'ectoderma è divenuto tessuto nervoso e quindi si può dire che ciò è dovuto a

segnali planari.

Come si forma l'organizzatore (induzione del mesoderma)= la calotta polare dà origine

• all'ectoderma poi c'è una fascia marginale che darà origine al mesoderma ed infine c'è la

calotta vegetativa che dà origine all'endoderma.

Nieuwkoop pensò di separare questi tre strati e di posizionarli in coltura: l'ectoderma originò

l'epidermide, mentre l'endoderma originò diverse strutture endodermiche.

Se invece si pone l'ectoderma a contatto con la massa vegetativa o endoderma presuntivo si

ha la riprogrammazione di quest'ultimo in mesoderma. La massa vegetativa quindi invia dei

segnali induttivi. È da ricordare che le parti in questione non sono così ben definite ed infatti

una parte dell'ectoderma tende a ricoprire la parte vegetativa e origina mesoderma da una

zona di confine tra ectoderma ed endoderma. Per capire quindi quale dei due ha originato il

mesoderma si colorano le cellule che si vogliono seguire e si mettono a contatto con la

massa vegetativa non colorata: se si colorerà sarà dato dall'ectoderma altrimenti

dall'endoderma.

Come si formano i vari tipi di mesoderma = Dale e Slack hanno ripreso l'esperimento

• precedente e sono partiti da uno stadio a 32 cellule che è temporalmente indietro rispetto a

quello usato nel precedente esperimento. Hanno preso la calotta animale, dove adesso le

cellule sono più distanti dalla parte vegetativa, e l'hanno messa di volta in volta a contatto

con blastomeri vegetativi diversi. Prima l'ectoderma è a contatto con il blastomero D1, poi

D2, poi D3 ed infine con D4. Lasciandoli sviluppare in vitro si osserva le strutture che si

formano:

D1= 77% dei casi dà origine a mesoderma dorsale;

D2= 11% è di tipo dorsale, 61% di tipo intermedio e 28% di tipo ventrale ecc.

si può dire che i blastomeri vegetativi dorsali danno origine al mesoderma dorsale, quelli

intermedi al mesoderma intermedio e quelli ventrali al mesoderma ventrale.

La regione dell’endoderma che ha la capacità di indurre l’organizzatore è definita centro di

Nieuwkoop. Il trapianto dei blastomeri di questa zona induce un organizzatore secondario

che porta alla formazione di un asse secondario e quindi di due labbra del blastoporo.

Esperimenti di legatura di Spemann (1903)

egli studiava le salamandre e si era chiesto se all'inizio dello sviluppo embrionale le cellule fossero

tutte uguali tra di loro e quando iniziasse il loro differenziamento.

Egli prese un embrione allo stadio di 8 cellule e creò una strozzatura su di esso, in modo tale avere

da una parte solo il citoplasma e dall'altra tutte le cellule con i nuclei. Successivamente allo stadio

di 16 cellule un nucleo venne fatto passare nella parte ricca di citoplasma e la strozzatura venne resa

ancora più stretta in modo che non ne potessero passare altri. Le due parti dell'embrione hanno dato

origine a due larve non proprio identiche: erano a due stadi diversi. Infatti uno era partito da uno

stadio iniziale di una cellula e l'altro invece da uno stadio a 15 cellule.

Esperimenti Kings e Briggs (1956)

problema dell'equivalenza nucleare.

Questi due studiosi hanno preso una cellula uovo e l'hanno privata del suo nucleo aploide con

l'utilizzo di un ago. Poi hanno prelevato il nucleo diploide di un embrione e lo hanno posto in questa

cellula uovo. L'ovocita si è comportato poi come uno zigote qualunque.

È stato anche osservato che l'efficienza del trapianto nucleare scende drasticamente con il procedere

dello sviluppo dell'embrione.

Clonazione da tessuti adulti- Gurdon (1962)

problema dell'equivalenza nucleare.

Studio delle rane albine ottenute da trapianto nucleare partendo da un girino.

Dall'accoppiamento di due rane albine si ottenne un girino albino dal quale furono prelevati dei

nuclei di cellule che vennero impiantati nelle uova enucleate di una femmina wild-type. Tale

processo, che fu il primo di clonazione, dà origine a rane tutte albine.

La pecora Dolly-Wilmut (1997)

problema dell'equivalenza nucleare

Esperimento in cui sono state utilizzate delle cellule uovo prelevate da una pecora adulta e cellule

già differenziate della linea somatica. La cellula uovo è stata privata del suo nucleo e al posto di

quest'ultimo è stato introdotto il nucleo di una cellula somatica dell'adulto (dalla ghiandola

mammaria di un particolare ceppo di pecore). In particolare, sono state messe a contatto la cellula

uovo enucleata e quella della ghiandola mammaria ed è stata applicata loro una corrente. Essa

genera continuità tra le membrane e farà si che il nucleo transiti dall'una all'altra. L'embrione è stato

poi mantenuto in vitro per un certo periodo di tempo e poi impiantato nell'utero di una pecora

gravida. Da essa è nato un agnello che era della stessa specie da cui era stato prelevato il nucleo

cellulare. Con tale esperimento si è capito che le cellule della linea somatica possono essere

riprogrammate nel citoplasma di una cellula uovo e sostenere così lo sviluppo di un nuovo

individuo.

Nobel 2012: Gurdon e Yamanaka. Esperimenti che riguardano la possibile riprogrammazione di

fibroblasti per farli tornare allo stadio di cellule totipotenti e che indicano che il loro stadio

sviluppato può anche essere fatto regredire.

Sappiamo che negli anfibi il centro di Niewkoop induce la formazione dell'organizzatore. Le

molecole che inducono tale formazione devono essere espresse nell'endoderma, allo stadio di

blastula precoce e devono agire come induttori mesodermici ovvero devono mimare l'effetto di un

trapianto di cellule endodermiche.

→saggio di induzione mesodermica= viene prelevata una calotta animale e viene posta a contatto

con una molecola che si pensa possa essere una di quelle che induce un cambiamento nel destino

della calotta.

→xenopus= in questo organismo ci sono due classi di fattori importanti e sono: o di origine

materna, quindi sono già presenti nell'oocita, oppure derivano dal genoma zigotico.

Materni:

Vg-1 è un fattore secreto espresso nella parte vegetativa che è quella che darà origine

• all'endoderma

Veg-T è espresso anch'esso nella parte vegetativa che darà origine all'endoderma ed è un

• fattore di

trascrizione.

Zigotici:

sono tutti fattori

• secreti appartenenti

alla famiglia TFG-

β: essi formano dei

dimeri che vengono

legati da specifici

recettori di

membrana e

attivano dei

componenti della

famiglia dei fattori

di trascrizione

smad. Essi

interagiscono con un recettore di tipo II e lo rendono in grado di interagire con un recettore

di tipo I. Una volta che i due recettori sono in stretto contatto il recettore II fosforila un

residuo di serina o treonina in quello di tipo I e lo attiva. Il recettore I ora può fosforilare le

proteine smad. In particolare smad1 e smad5 sono attivate dalla famiglia BMP mentre

smad2 e smad3 sono attivate dai fattori TFG-β e dall'activina. Le proteine attivate possono

così legare smad4 che una volta transitato nel nucleo promuove la trascrizione di alcuni

geni.

Per quanto riguarda i due fattori Vg-1 e Veg-t, sono secreti dalle cellule endodermiche e vanno ad

attivare il gene Xbra (xenopus brachyury). In particolare la proteina Nodal related Derrière è indotta

da VegT e può indurre anche a distanza la trasformazione di cellule della calotta animale in

mesodermiche.

Una volta che Xbra è espressa agisce come fattore di trascrizione inducendo l'eFGF, è un fattore

paracrino (agisce a lunga distanza), che mantiene l'espressione stessa di Xbra. Inoltre Xbra attiva la

trascrizione di proteine che servono per la formazione del mesoderma.

Solo le cellule vegetative più dorsali invece possono istruire le cellule marginali soprastanti a

divenire l'organizzatore. In particolare la proteina adatta a tale scopo sembra essere la β-catenina

che è una proteina multifunzionale: può servire da ancoraggio alle caderine o agire come fattore di

trascrizione nucleare. Essa negli embrioni di Xenopus si accumula nella regione dorsale dell'uovo

durante i movimenti del citoplasma che avvengono in seguito alla fecondazione. Questa zona di

accumulo della β-catenina comprende inizialmente sia la regione del centro di Nieuwkoop che

quella dell'organizzatore, mentre successivamente, si trova solo dove si deve formare il centro di

Nieuwkoop. Essa ha un ruolo importante nella formazione dell'asse dorsale e ciò è stato visto

inserendo trascritti antisenso che ne inibiscono l'azione. Si sono ottenuti embrioni in cui erano

assenti le strutture dorsali. Inoltre se viene iniettata nell'asse ventrale induce la formazione di un

secondo asse.

La β-catenina fa parte della via di trasduzione

del segnale Wnt ed è soggetta ad un controllo

negativo da parte della GSK-3

(glicogenosintetasi chinasi 3). Quest'ultima

reprime la formazione di un asse dorsale e

quindi agisce contro la β-catenina.

Queste due agiscono in questo modo: la β-

catenina è inizialmente presente i tutto

l'embrione e viene poi degradata, attraverso

fosforilazione, da parte della GSK-3 nelle

cellule ventrali. L'evento critico per la

determinazione dell'asse può essere lo

spostamento di un inibitore di GSK-3,

Disheveled, nel punto opposto a dove entra lo

spermatozoo. Esso è un normale repressore di

GSK-3 nella via Wnt e viene trasferito dai

microtubuli, al momento della fecondazione,

nel lato dorsale.

Disheveled Dorsale → no GSK-3→ si

βcatenina → formazione asse dorsale

La β catenina può associarsi a Tcf3 che è un

fattore di trascrizione ubiquitario e tale

complesso si lega ai promotori di parecchi geni

che hanno notevole importanza nella

formazione dell'asse, o meglio si pensa che la

Tfc3 sia legata ai promotori e agisca come repressore, mentre, quando si ha il legame con la β-

catenina si ha la sua rimozione e l'attivazione del gene. Nel caso in cui quest'ultimo sia mutante per

la parte che lega tale proteina si formano embrioni che sono privi della parte dorsale.

Uno dei geni che viene attivato è il gene siamois che codifica un fattore di trascrizione a

omeodominio che viene espresso nel centro di Nieuwkoop subito dopo la MBT. Se tale gene viene

espresso ectopicamente nelle cellule vegetative ventrali si ha la formazione di un secondo asse.

Inoltre se si impedisce la rotazione corticale il gene siamois non viene espresso.

La proteina di quest'ultimo gene agisce come fattore di trascrizione di numerosi geni tra cui quelli

per i fattori Goosecoid e Xlim1 e i fattori paracrini Cerberus e Frzb. Gooseoid è di importanza

fondamentale per l'utilizzo di numerosi geni dell'organizzatore

(β-catenina → siamois → goosecoid → organizzatore).

Siamois da solo però non è sufficiente per dare origine all'organizzatore e quindi risulta importante

anche la partecipazione di un segnale TFG-β a espressione vegetativa. La rotazione corticale può

indurre la produzione di βcatenine e di siamois nella regione dorsale dell'embrione. Nella parte

ventrale invece, la traduzione di fattori paracrini TGF-β può produrre una proteina che stimola la

massima produzione di goosecoid. Le proteine che potrebbero svolgere tale ruolo sono la stessa

Vg1 e le proteine Nodal-related, entrambe prodotte dall'endoderma. Con degli esperimenti in cui le

proteine Nodal venivano rese inattive non si aveva l'induzione da parte delle cellule vegetative:

segnale che erano proprio esse le responsabili del processo sopra citato. Inoltre è stato visto che in

stadi di blastula avanzata diverse di queste proteine, come Xnr1, Xnr2 e Xnr4, sono espresse

secondo un gradiente dorso-ventrale. Tale gradiente è dovuto all'attivazione del gene nodal-related

dovuta all'azione di Vg1, VegT e β-catenina. La prima è localizzata dorsalmente mentre Vg1 si

trova in sede vegetativa e la loro azione determina un gradiente. In questo modo:

dove ci sono poche nodal-related si ha induzione del mesoderma ventrale,

• dove ce se sono un pò di più si ha la formazione di mesoderma laterale,

• dove si ha la massima concentrazione si ha la formazione dell'organizzatore.

→goosecoid = l'mRNA di questo gene è localizzata al territorio dell'organizzatore. Esso codifica

per una proteina che :

1. attiva l'embolia e l'estensione convergente delle cellule del labbro dorsale del blastoporo

2. determina in modo autonomo il destino mesodermico delle cellule che la esprimono

3. consente alle cellule che esprimono il gene di reclutare nell'asse dorsale cellule vicine.

Essa agisce nel nucleo e deve attivare geni che codificano per proteine solubili e che sono implicate

nella formazione dell'asse antero-posteriore e dorso-ventrale. Una prova iniziale della presenza di

tali proteine solubili è stata data da esperimenti in cui embrioni di anfibio erano posti in soluzioni ad

elevata concentrazione salina. Il mesoderma si evaginava invece che invaginarsi e non si poneva

sotto l'ectoderma. L'ectoderma a sua volta non aveva al di sotto la notocorda e non si formano

strutture neurali.

Studi recenti sull'induzione da parte dell'organizzatore hanno portato a capire che l'ectoderma

diviene epidermide grazie alle proteine morfogenetiche dell'osso BMP mentre, dove esse non

agiscono l'ectoderma diviene sistema nervoso. Una di queste è BMP4 che si trova nel mesoderma

ventro-laterale e che è un fattore ventralizzante. La sua azione è stata scoperta sovraesprimendo e

inibendo la sua azione: nel primo caso non si forma la notocorda e il tubo neurale mentre nel

secondo caso si ha un embrione tutto dorsalizzato.

Le proteine che inibiscono l'azione di BMP4 sono Noggin, cordina e follistatina.

→saggio del filtro = esperimento nel quale l'organizzatore e l'ectoderma sono posti vicini ma

separati da un filtro. Ciò è stato fatto per vedere se i segnali dell'organizzatore erano molecole

diffusibili ovvero che venivano rilasciate e andavano ad agire altrove. È stato visto che è così.

→saggio degli animal caps = serve per vedere se una molecola funziona come induttore. Le calotte

animali prelevate e poste in vitro da sole originavano epidermide mentre se poste con degli mRNA

di interesse potevano differenziare, se erano gli mRNA giusti, in tessuto nervoso. È stato anche


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DETTAGLI
Corso di laurea: corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Pisa - Unipi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher giulylencio.95 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia dello sviluppo e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pisa - Unipi o del prof Andreazzoli Massimiliano.

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