Appunti Genetica Medica

Genetica medica

Regole del cariotipo

• Dal più grande al più piccolo
• Il braccio corto fa sempre sopra, di conseguenza il braccio lungo va verso il basso
• Utilizzando particolari frecce, si riconoscono determinate bande cromosomiche che ci fanno discriminare i cromosomi fra di loro, dato che sono caratterizzanti di ogni cromosoma.
• Le bande devono essere numerate, dal centromero verso i telomeri.

Nomenclatura delle bande

Il bandeggio ci serve anche a mappare una precisa zona di DNA, oltre che a riconoscere eventuali alterazioni di struttura cromosomica. Per lo stesso tipo di bandeggio, però, è possibile avere risoluzioni diverse. Posso avere 16, 24, 42, 46 bande. Il numero dipende dal grado di spiralizzazione dei cromosomi metafasici. Maggiore è la risoluzione, più cose si possono vedere, tra cui anche piccole modificazioni. In base a questo, possiamo definire:

• Il numero del cromosoma
• Il braccio (q o p)
• La regione telomerica
• Banda
• Sottobanda

Esempio: 14q3.2 dove: 14 = numero cromosoma; q = braccio lungo; 3 = banda; 2 = sottobanda

Terminologia per definire cariotipo

Basta seguire una semplice sequenza:

1. Numero dei cromosomi totali contati
2. Cromosomi sessuali
3. Eventuali anomalie

Esempi:

• 46,XY (maschio ok)
• 46,XX (femmina ok)
• 47,XX, +21 (femmina con trisomia 21)
• 47,XXY (maschio con sindrome di Klinefelter)

Eteromorfismi cromosomici

Sono anomalie del DNA frequenti (>1%). Sono anomalie che non interferiscono con il fenotipo dell'individuo. Sono presenti nei cariotipi normali. Possiamo dividerli in 4 categorie:

• Regioni eterocromatiche pericentromeriche (cr. 1,9,13). Si vanno ad osservare colorando i centromeri con bandeggio C. Questo bandeggio ci identifica regioni eterocromatiniche, come quelle sopracitate. In queste varianti, queste regioni sono più lunghe nell'8% delle persone. Non danno problemi. Nomenclatura: qh+
• Inversione cromosoma 9 (46,XX,inv(9)(p13q13)). È una inversione del cromosoma 9 (pericentromerica) che si rompe nelle regioni sopracitate, che sono eterocromatiniche, quindi non interrompono né geni codificanti né geni di posizione, e quindi non crea conseguenze.
• Braccio lungo cromosoma Y. Si presenta nel 10% degli uomini; può essere o più grande o più piccolo della media, ma non crea problemi, per assenza di geni codificanti.
• Regioni satellite di cr. acrocentrici. Sono regioni eterocromatiche di DNA che stanno nel braccio corto “virtuale” dei cromosomi acrocentrici. Si evidenziano con colorazione Q, hanno molte varianti.

Cariotipo ed età

Il cariotipo, a seconda dell'età in cui si decide di effettuarlo, dipende da molte varianti.

Cariotipo in età prenatale

Non è assolutamente a rischio 0. Lo si fa in caso di sospetto clinico, dato dai seguenti segni:

• Età materna avanzata (>35 anni). Scelto come cut-off perché dall'età di 35 anni la probabilità di danno al cariotipo per malfunzionamento dell'oocita è molto più probabile.
• I primi test di screening prenatali sono risultati positivi. Sono test di valutazione non invasivi, basati su valutazione di alcuni ormoni nel sangue periferico materno.
• Anamnesi presente in famiglia per anomalie cromosomiche.
• Malformazione fetale (grazie ad ecografia).

Senza queste situazioni non si fanno test invasivi, perché il rischio di aborto c'è.

Cosa si analizza?

• Villi coriali (11-13 settimana)
• Amniociti (15-17 settimana)
• Sangue fetale (19-20 settimana)

Cariotipo in età post natale/adulta

Ci devono essere segni clinici evidenti, che ci fanno sospettare un danno a livello cromosomico; devono esserci segni clinici precisi, che devono far pensare ad aberrazione di numero o qualità dei cromosomi, ad esempio:

• Ritardo mentale
• Amenorrea
• Ipogenitalità
• Infertilità, sterilità

Si fanno analisi su sangue periferico.

Limiti citogenetica classica

Ovviamente questi test hanno limiti enormi. Il più importante è che queste tecniche vanno ad individuare riarrangiamenti più grandi di 5 Mb, che non sono assolutamente una percentuale alta del totale dei possibili riarrangiamenti di nostro interesse. Inoltre, richiede un gran numero di cellule in replicazione, che da un prelievo di sangue periferico non risulta essere un problema, ma da un cord-blood o da una analisi di villi coriali può esserlo. Per questo, esiste un ramo della citogenetica che ci permette valutazioni più sottili, la citogenetica molecolare.

Citogenetica molecolare

Accomuna analisi del DNA della biologia molecolare (con ottima qualità) ad analisi dei cromosomi e dei suoi riarrangiamenti. La citogenetica molecolare utilizza sonde.

Sonda: è una porzione di DNA (solitamente ottenuta da sorting o microdissezionamento), che è denaturata e adibita a riconoscere una determinata porzione del DNA che noi stiamo analizzando, grazie al principio dell'ibridazione tra acidi nucleici. Possiamo effettuare 2 tipi di analisi:

• Analisi targeted
• Analisi genome wide

Analisi targeted: FISH

Fish: Fluorescence In Situ Hybridization. È una tecnica che permette una analisi mirata di una regione (o anche di più) cromosomica. Prevede la fissazione del DNA su supporto solido (vetrino). Il DNA può essere metafasico, oppure possiamo usare spesso anche nuclei in interfase. Le sue fasi sono:

• Estrazione del DNA (da cellule nucleate provenienti da prelievo o da biopsia)
• Fissazione del DNA sul vetrino
• Scelta della sonda (a seconda delle nostre esigenze)
• Marcatura della sonda
• Ibridazione
• Lavaggio
• Osservazione grazie a MO a fluorescenza

Ovviamente le sonde che non si sono ibridate non rimarranno legate dopo il lavaggio.

Marcatura della sonda

La marcatura della molecola di DNA che dovremo andare ad utilizzare come sonda può avvenire in due modi.

Nick translation: è una tecnica che prevede l'utilizzo di una endonucleasi, che va a creare sulla sonda un nick (in un filamento quindi). A questo punto, una polimerasi (solitamente il frammento di Klenow) andrà a creare un piccolo gap andando a usare la sua attività esonucleasica dal 5' del nick generato. A questo punto, andrà a ripolimerizzare la piccola regione usando i nucleotidi presenti nella mix, che saranno marcati.

Random priming: aggiunta di corte molecole di nucleotidi (solitamente esameri, che fungono da primer) che legano il DNA della sonda (denaturato). Questi esameri serviranno da inneschi per la polimerasi, che usa anche questa volta nucleotidi marcati presenti nella mix.

Come si marcano i nucleotidi?

• Direttamente, attaccando il fluorocromo sul nucleotide. Si usa per i traccianti radioattivi. Non è più in utilizzo.
• Indirettamente, inserendo sul nucleotide una molecola adattatrice (solitamente la biotina) che fa da ponte al fluorocromo; il complesso sarà nucleotide – biotina – streptavidina (molecola fluo).

Scelta della sonda

Possiamo scegliere tra 3 tipi di sonde:

• Chromosome painting, che sono sonde la cui colorazione va a coinvolgere o tutto il cromosoma o solo uno dei due bracci.
• Per sequenze ripetute, che possono dividersi in centromeriche o telomeriche.
• Locus specifiche

Chromosome paintings

Sono sonde che possono essere o WcPs (Whole Chromosome Painting) o PcPs (partial Chromosome Painting). Queste sonde sono composte da molte sequenze di DNA (dovendo legare sequenze molto grandi). Sarà un insieme di sonde, in pratica. Si ottengono da cromosomi SORTATI o MICRODISSEZIONATI; si otterranno frammenti di DNA, che verranno amplificati con PCR non stringente.

Quando e dove si usano?

Su nuclei in METAFASE! Se li usassi in interfase, vedrei un effetto a macchia dispersiva.

Sonde contenenti sequenze ripetute

Centromeriche, ovvero sonde specifiche per i centromeri. Hanno grossi vantaggi. Innanzitutto, possono essere usate sia in interfase che in metafase. Inoltre, sono cromosoma-specifiche. Ogni centromero ha una sequenza discriminante per ogni cromosoma. Queste sonde sono molto utilizzate per fare analisi prenatali per fare uno screening delle principali trisomie (13,18,21). È molto importante, dato che questa analisi è estremamente rapida e nella fase prenatale il tempo è denaro. Un altro utilizzo che posso fare di queste sonde è l'identificazione del sesso per malattie X Linked. Infine, non ho necessità di cellule in attiva crescita.

Telomeriche non sono cromosoma specifiche. Posso usarle sia in metafase che in interfase. Servono per analisi successiva a sospetto diagnostico di malattie date da riarrangiamenti subtelomerici. Questi riarrangiamenti sono veramente importanti e spesso coinvolti in ritardo mentale.

Sonde locus specifiche

Sonde che comprendono regioni di DNA più piccole ma più specifiche. Vanno su geni in maniera oculata. La sonda può essere usata sia in METAFASE che in INTERFASE. Esempio: sonda per regioni sub-telomeriche di cromosoma 5. Qual è la differenza con le sonde precedenti (telomeriche)? Che queste sono specifiche per una determinata regione (in questo caso subtelomerica) in uno specifico cromosoma. Quelle telomeriche in generale vanno a colorare i telomeri di tutti i cromosomi. Quelle locus specifiche sono quasi sempre usate in associazione a centromeriche, per avere una relazione quantitativa tra sonda che si è ibridata a centromero e al locus di interesse.

Vantaggi FISH

• È una tecnica rapida
• Mi permette di identificare microdelezioni e riarrangiamenti complessi
• Diagnosi su nucleo (interfase e metafase (non sempre entrambi))

Svantaggi FISH

Analisi non completa. Non si può dire che sia esauriente. Spesso è necessario un cariotipo in aggiunta per evitare di perdersi qualcosa. Si può notare come la sonda centromerica (verde) nella FISH in basso sia di pari numero rispetto alla locus specifica (rossa) mentre in quella in alto no. In quel caso, ci sarà stata perdita di quella regione genetica.

Analisi genome wide: SKY

Subito dopo l'invenzione della FISH, fu ideata la SKY (Spektral Karyotyping). Viene anche chiamata “Multiplex Fish”. Con questo tipo di esame possiamo ottenere una colorazione di tutti i cromosomi. È una sorta di painting “tutto insieme”; non ebbe troppo successo, per il semplice motivo che è estremamente costoso. Il motivo del costo alto è che è necessario usare 24 sonde marcate in fluorescenza (22 autosomi + cromosoma X + cr. Y). Non è usata in diagnostica. È un po' utilizzata in ricerca, per caratterizzare le neoplasie. Il fatto che sia utilizzata nelle neoplasie è spiegato dalla sua maggiore utilità: il riuscire a individuare riarrangiamenti multipli (tra più di 2 cromosomi) strutturali. Il succo della tecnica è assegnare un colore diverso ad ogni cromosoma. Si utilizzano sempre sonde chromosome painting. Devono essere utilizzati particolari microscopi; questi devono essere in grado di distinguere lunghezze d'onda simili, perché è quasi impossibile ottenere 24 marcatori fluorescenti con 24 lunghezze d'onda estremamente distanti e discriminabili facilmente. Di seguito un esempio di riarrangiamento multiplo.

CGH e CGH Array

CGH = Comparative Genomic Hybridization. CGH fu usato a fine anni '90. Campo tumorale per la maggior parte. Ora è in disuso. CGH array è ancora utilizzato molto. Questo test mi fa valutare alterazioni quantitative come delezioni o duplicazioni.

Meccanismo di funzionamento

Avremo 3 componenti:

• Un vetrino su cui sono schierati cromosomi di DNA normale, denaturati.
• Vado ad ibridarci un DNA caso, marcato (per esempio) in verde e
• Un DNA controllo, marcato (per esempio) in rosso.

Andando a denaturare e mettere tutto insieme, i 2 DNA (controllo e caso) competeranno per legarsi ai cromosomi sul vetrino. Il principio è la competizione fra i due DNA. La denaturazione è ottenuta o con temperatura alta, o con formaldeide o formammide. Si va ad osservare i risultati (con MO a fluo) e potremo osservare 3 possibili risultati:

• Fluorescenza caso > Fluorescenza controllo; significherà un eccesso di legame del DNA caso (patologico quindi), la porzione del cromosoma dove vediamo solo il colore con cui è marcato il DNA caso avrà una presenza di anomalia cromosomica, in questo caso, una duplicazione.
• Fluorescenza caso < Fluorescenza controllo; il contrario, quindi ci sarà delezione nel DNA caso.
• Fluorescenza caso = Fluorescenza controllo; vedremo un colore giallo. Le acquisizioni dei colori si sovrappongono, non abbiamo alterazioni. Soggetto (probabilmente) sano.

Il DNA tumorale, marcato di verde, e il DNA normale, marcato di rosso, competeranno per legarsi ai cromosomi in metafase. Quindi la visualizzazione che ottengo è una sorta di colore giallo, un mix dei due. Viceversa, se è presente una regione che è presente in più copie (duplicata o triplicata), quindi presente in più quantità rispetto al DNA normale, ovviamente si legherà preferenzialmente, essendo presente in quantità maggiore è più probabile che si leghi la visualizzerò come un eccesso di colore verde. Viceversa se il mio cromosoma ha perso ad es. la porzione terminale del braccio lungo, sarà presente in meno quantità, si legherà in preferenza il DNA normale rispetto all'altro.

Con questo sistema si riescono a visualizzare i cromosomi e assegnarli l'anomalia cromosomica, se presente. Giallo = quando si legano sia DNA normale che tumorale. Eccesso verde = se il mio DNA tumorale è marcato di verde, indica una duplicazione del DNA tumorale per la regione che identifico (es. regione del braccio lungo). Eccesso rosso = delezione del braccio corto del cromosoma (in questo caso) per il DNA tumorale. I cromosomi che utilizzo sul vetrino mi servono esclusivamente come indicatori. Accanto ad ogni immagine ricostruita di un cromosoma c'è l'ideogramma del cromosoma (alternanza di bande chiare e scure) e accanto ci sono due barrette blu con al centro la stanghetta verde, indicano se il cromosoma è più o meno allineato al verde la trasposizione della fluorescenza in valore numerico è intorno al verde, il cromosoma è normale, non ha perso né guadagnato niente; qualsiasi spostamento verso destra o verso sinistra mi indica l'acquisizione o la perdita di materiale genetico.

Le acquisizioni possono essere fatte separatamente e poi sovrapporle. La stragrande maggioranza saranno gialli, ma il mio DNA verde di controllo mi delineerà anche perdita o acquisto di materiale genetico da parte del cromosoma, in particolare del 10 e del 4. Tecnica che è stata molto usata per lo studio dei tumori: non ha però avuto un grande riscontro in genetica perché le acquisizioni che io riesco a ottenere sono abbastanza grossolane. La visione che ottengo di un cromosoma in termini di perdita o acquisto di materiale genetico di DNA che sto testando sono ampie, è difficile che siano compatibili con la sopravvivenza dell'individuo. Ci sono anche tecniche di altro tipo.

Quello che viene molto utilizzato in genetica è il CGH-array, epoca post-natale ma anche pre-natale se devo analizzare riarrangiamenti piccoli. Il ciclo è lo stesso: ibridazione del genoma comparativa, avviene non su un vetrino ma su un array. Un array è un vetrino che contiene un insieme ordinato di sequenze genomiche, hanno mappatura nota, so cosa è riportato sul vetrino e a quale regione del cromosoma corrisponde. Queste sequenze genomiche sono riportate sul vetrino secondo uno schema ricostruibile: so quelle migliaia di spot a cosa corrispondono, posso ottenere una trasposizione numerica. sono tipi di array. L'utilizzo di questa tecnica mi permette di fare un'analisi genome-wide, se dispongo sul vetrino che mi mappano su tutti i cromosomi posso fare un'analisi di questo tipo. Però siccome la distanza tra sonda e sonda (termine di risoluzione) può essere decisa dall'operatore, posso anche andare a studiare in maniera più fine una regione specifica, costruendo delle sonde che mappano una regione più specifica. Le sonde possono essere di tutti i tipi: cDNA, prodotti di PCR, oligonucleotidi; la risoluzione è diversa. La risoluzione dipende dalla lunghezza delle sequenze (più lunghe sono più mi garantiscono una ibridazione buona) e dal numero degli spot. La risoluzione a parità di regione è maggiore quanti più spot ci sono.

Il principio è sempre quello della competizione per l'ibridazione: DNA del paziente che viene marcato di rosso, DNA del controllo che viene marcato di verde. Ibridizzo un vetrino su cui sono spottati dei cloni di sequenze. Il risultato è lo stesso della tecnica prima, perdita o acquisto. Viene visualizzato in termini di spot: verdi: delezione; rossi: duplicazione. Ci vogliono degli strumenti che siano in grado di trasformare questa immagine in ideogramma del cromosoma. L'ibridazione è di tipo competitivo: il DNA del campione e il DNA di controllo (mescolati insieme e...