Appunti Genetica Medica

RNA.

Lo scopo delle metodiche che servono per l’estrazione degli acidi nucleici è quello di ottenere

materiale in condizioni ottimali quindi il più integro possibile ed il più puro possibile per evitare

potenziali interferenze; la metodica che viene usata deve avere come requisiti

-non danneggiare l’acido nucleico

-concentrare quindi averne a disposizione una quantità sufficiente da sottoporlo ai successivi

esperimenti

-eliminare tutte quelle sostanze che possono funzionare da inibitori della PCR o delle reazioni che

io poi andrò a realizzare

-stabilizzare cioè dal momento che io lo conservo in frigorifero o in freezer non vada incontro

-DNA all’azione di DNAsi

-RNA all’azione di RNAsi che lo degradano

I metodi che vengono usati oggi sono tanti, solitamente sono automatizzati quindi ci può essere un

estrattore di DNA, come un robot che fa tutte le fasi oppure la stessa estrazione può essere fatta

manualmente utilizzando cartucce che servono a tutte le funzioni elencate prima. Sicuramente per

RNA abbiamo di fronte un problema maggiore, per questo non si lavora mai in prima battuta con

RNA, dato dall’azione delle RNAsi: enzimi ubiquitari che hanno la pecularietà di degradare RNA

cioè spezzettarlo quindi la strumentazione e i materiali che vengono usati per l’estrazione di RNA

dalle cellule devono essere trattati in modo particolare, ci vuole un occhio di riguardo maggiore

rispetto all’estrazione di DNA. Fino a qualche tempo fa l’estrazione doveva essere fatta in tempo

reale soprattutto dal sangue cioè arrivava il prelievo in laboratorio e dovevano essere fatti buffy

coat su linfociti ed estratto subito dopo o quanto meno messo insiemee a reagenti che

stabilizzavano RNA con i limiti che questo comporta cioè un laboratorio non è detto che sia attivo

se tu fai prelievo alle 17.30 del pomeriggio. Oggi è stato superato dal fatto che molte ditte hanno

prodotto degli stabilizzanti quindi il prelievo al paziente viene fatto direttamente utilizzando degli

specifici vacutainer, cioè dei ? (non si capisce), per la successiva estrazione di RNA che contengono

materiale stabilizzante che inibisce RNAsi; stessa cosa vale per il prelievo da tessuto che altrimenti

dovrà essere congelato istantaneamente.

Quando si estrae RNA a noi cosa interessa? Ci interessa mRNA, si deve ricercare il trascritto che è

la minima parte di RNA dentro le cellule, è circa 1-2%; quando estraggo RNA totale da una cellula o

da un tessuto e lo corro su gel quello che io osservo è questo (VEDI SLIDES), queste due bande

intervallate da una strisciata che può essere più o meno ?(non si capisce). Cosa sono le due bande?

Sono la 5 maggiore di RNA che io ritrovo cioè rRNA, precisamente -28S -18S.

Gli mRNA che ci interessano e che vengono trattati dopo aver sottoposto RNA a retro trascrizione

stanno da un punto di vista teorico in quelle srisciate nel mezzo o anche sotto (si farà lezione in cui

vi spiegherò com fare a capire se una mutazione intronica o esonica può essere patogenetica

andando a studiare alterazioni dello splicing quindi come si scelgono i primer e via dicendo).

Oggi si comincia con ANALISI DEL DNA GENOMICO estraibile da ogni tipo di cellula e i tipi di

diagnosi che possono essere fatte sono di due tipi

1) diagnosi DIRETTA

2) diagnosi INDIRETTA

DIAGNOSI DIRETTA:

fatta più frequentemente e consiste nel ricercare la mutazione che è la causa della malattia nel

soggetto affetto e poi l’analisi può essere estesa ai familiari se io identifico la mutazione. Si chiama

“diretta” poiché io vado a studiare direttamente il gene responsabile di quella malattia nel paziente

affetto.

DIAGNOSI INDIRETTA:

o analisi del linkage. Non va a studiare direttamente il gene malattia ma si studia la segregazione di

marcatori molecolari che sono associati al gene malattia e si studia all’interno della famiglia quindi

io rispetto all’analisi diretta vuol dire che devo avere a disposizione una famiglia intera mentre in

analisi diretta posso studiare il singolo individuo.

Quando si adotta? Si adotta quando il difetto molecolare non è noto cioè vuol dire che io so quale

è la localizzazione cromosomica del gene malattia ma non so esattamente quale sia il gene

malattia oppure non so quale è la mutazione responsabile della malattia in quella famiglia e magari

ho a che fare con un gene molto grosso per cui non è possibile avere la diagnosi in tempi

sufficientemente brevi. Devo dire ora si usa sempre meno poiché le tecniche di silenziamento di

nuova generazione ti garantiscono ?(non si capisce) notevole però immaginate qualche anno fa

una paziente affetta da malattia genetica monogenica, che non ha mai fatto analisi molecolari, che

si trova in sede di diagnosi prenatale e vi chiede che rischio ha di avere un bambino con un difetto

per la stessa malattia; te non lo puoi sapere, non puoi fare diagnosi prenatale se non trovi prima la

mutazione nella mamma. Se il gene era troppo grosso da studiare e non ci si faceva in tempi

ragionevoli poteva essere fatta un’analisi di tipo indiretto e quindi si studiavano marcatori associati

al gene malattia; in questo caso si studia la segregazione, all’interno di una famiglia in cui segrega

quella malattia, di un marcatore molecolare che mappa vicino al locus di malattia.

I marcatori molecolari sono rappresentati da

-RFLP

-minisatelliti

-microsatelliti

-SNP

e hanno caratteristiche:

1)devono essere stabili nel tempo e nelle generazioni

2)devono essere polimorfici, devono esserci almeno 2 alleli

-A grande a piccolo se è un SNP

-numero di ripetizioni variabile se è un micro satellite

3)deve essere presente in qualsiasi tessuto facilmente identificabile

4)deve segregare secondo le leggi di Mendel

Come si fa a studiare?

Io utilizzo un marcatore, un SNP ad esempio associato al locus malattia e analizzando tanti membri

della famiglia io vedo quale marcatore è associato alla presenza della malattia; se quegli individui

malati sono A grande vuol dire che la presenza di a piccolo o di una mutazione o di un numero di

ripetizioni diverso è associato alla malattia in quella famiglia e quindi si segue la segregazione fino

ad arrivare all’assetto per stimare il rischio di aver ereditato il cromosoma che porta alla

mutazione. Ovviamente non si fa con un marcatore solo, si fa con una serie di marcatori che

mappano intorno al gene malattia.

Quello di cui si parla per 2/3 lezioni è la DIAGNOSI MOLECOLARE DIRETTA cioè quando si va a

ricercare la mutazione responsabile della malattia nell’affetto e successivamente nei familiari, si

possono usare una serie di tecniche diverse che sono qui riportate (VEDI SLIDES) a seconda di che

cosa mi aspetto di trovare quindi una mutazione puntiforme oppure una delezione di un singolo

esone; a seconda di cosa devo cercare utilizzerò tecniche diverse anche a seconda di come queste

mutazioni sono disposte all’interno della sequenza genica. Cosa vuol dire?

Esistono malattie genetiche in cui magari una sola mutazione è responsabile dell’alterazione

genetica quindi basta che si ricerchi quella mutazione li oppure malattie genetiche in cui poche

mutazioni sono responsabili dei diversi fenotipi e quindi basterà che io ricerchi quelle 20/30/40

mutazioni che riescono a coprirmi il 90-95% dei casi affetti ed in prima battuta analizzerò i più

frequenti per le mutazioni; per la situazione più sfigata ho un gene con 50 esoni e le mutazioni

possono essere disperse lungo tutta la lunghezza del gene quindi io ho all’interno della sequenza di

quel gene degli hot-spot mutazionali, delle sequenze che sono colpite più di altre. Si dice quindi

che le mutazioni sono spesso “private” cioè caratteristiche di ogni famiglia che porta una malattia.

E’ ovvio che a seconda della patogenesi molecolare del gene con cui mi trovo a lavorare affronterò

la cosa con metodiche diverse: se una malattia è causata nella quasi totalità dei casi da una o

poche mutazioni che colpiscono sempre gli stessi nucleotidi è inutile che io vada a sequenziale il

gene perché saranno quelle le mutazioni più frequenti! Il gene lo sequenzio esclusivamente se non

trovo la mutazione, se rientra il quel 5% di pazienti che hanno mutazioni di colori diversi allora sì

ma in prima battuta si utilizzano metodi che non vanno ad identificare mutazioni nuove. Questi

metodi sono sotanzialmente 4 e almeno due di questi sono stati sviluppati dall’industria con

sistemi di kit per malattie frequenti:

1) ANALISI DI RESTRIZIONE non sempre applicabile, quando?

Quando io so che una malattia è dovuta ad una mutazione nella sequenza del DNA che mi altera

un sito di restrizione cioè che la sostituzione nucleotidica mi elimina, mi cambia la sequenza di

DNA, quel sito di restrizione non viene più riconosciuto come tale e quindi quell’enzima non taglia

più. Viceversa una mutazione può anche inserire un sito di restrizione in una sequenza di DNA in

cui non era presente.

Siccome le mutazioni sono sempre le stesse quelle che io vado a ricercare lo so a priori, prima di

iniziare, che tipo di sostituzione nucleotidica vado a cercare; in questo caso (VEDI SLIDES) ad

esempio la sostituzione nucleotidica mi abolisce il sito di restrizione per EcoR1 perché la

sostituzione nucleotidica fa sì che cambi citosina con timina e di conseguenza non sarà più

riconosciuto come tale. Da un punto di vista metodologico so cosa devo cercare, amplifico quindi

con PCR il mio frammento di DNA estratto utilizzando primer posizionati a monte e a valle del sito

di restrizione; successivamente all’amplificazione in PCR digerisco l’amplificato con l’enzima di

restrizione specifico e dopo elettroforesi su gel di agarosio o poliacrilammide e a seconda delle

dimensioni delle bande che io otterrò vado a vedere il pattern di frammenti che io ottengo.

Se la mutazione mi abolisce un sito di restrizione quindi me lo elimina ad esempio (VEDI SLIDES) in

questo caso amplifico con primer un frammento da 200bp ed il sito di restrizione cade nella

sequenza di DNA per cui dopo la digestione otterrò due frammenti, uno da 110bp e l’altro da 90bp.

Si osserva

-in soggetto wildtype 2 bande, una di 110pb e una di 90bp

-in soggetto omozigote per la mutazione siccome avrà entrambi gli alleli che portano la mutazione

per cui l’enzima non taglierà nessuno dei due e avrò un unico frammento di 200bp

-in soggetto eterozigote siccome ci sono 1 allele wt e 1 allele mutato si distinguerà per la presenza

di due bande: una di 200bp corrispondente all’allele non tagliato per la presenza della mutazione e

un’altra tagliata

Succede l’opposto se la mutazione mi inseris