Appunti genetica generale

Genoma

Genoma nucleare

• 1,1% geni che codificano per proteine
• ~4% geni per RNA, sequenze di regolazione
• ~45% ripetizioni di trasposoni
• ~6,5% eterocromatina
• ~44% altre sequenze

Genoma mitocondriale

(~16 kb ricco in CG)

• ~66% geni per proteine
• ~32% geni per RNA, sequenze di regolazione
• <2% altre sequenze

Il genoma mitocondriale contiene 37 geni: 22 per i tRNA, 2 per rRNA e 13 per le proteine della catena respiratoria (la maggior parte vengono codificate dai geni nucleolari).

Il DNA mitocondriale (mtDNA) deriva dalla madre, quindi se due bambini hanno la stessa madre, hanno lo stesso DNA mitocondriale. Di conseguenza, vi è una madre ancestrale da cui tutti gli esseri umani derivano. Questo perché il DNA mitocondriale paterno viene perso durante la fecondazione.

La funzione principale dei mitocondri è produrre ATP attraverso la catena respiratoria, che consiste di una serie di complessi proteici che convertono l'energia ricavata dagli alimenti in ATP.

I mitocondri codificano solo per 13 subunità proteiche, le altre 80 sono codificate dai geni nucleari. Inoltre, questi ultimi codificano anche per tutto ciò che serve per riparare il DNA mitocondriale.

Ciò significa che difetti nei mitocondri possono essere causati sia da mutazioni del DNA mitocondriale che da quello nucleare (nDNA). Quasi tutte le nostre cellule si basano sui mitocondri per un approvvigionamento costante di energia, quindi una malattia mitocondriale può essere una malattia multisistemica che colpisce più di un tipo cellulare, tessuto, organo.

I sintomi non sono gli stessi per tutti perché una persona con una patologia mitocondriale può avere un mix di mitocondri sani e difettivi con una distribuzione unica nel corpo.

Una malattia mitocondriale che causa problemi muscolari è detta miopatia mitocondriale, mentre una patologia mitocondriale che causa sia problemi neurologici che muscolari è detta encefalomiopatia mitocondriale.

Sia mutazioni nel mtDNA che nell’nDNA causano patologie mitocondriali. La maggior parte delle mutazioni dell’nDNA seguono il modello mendeliano, quindi una copia di ciascun gene deriva da ogni genitore. La maggior parte delle patologie mitocondriali sono autosomiche recessive, quindi significa che ci deve essere una mutazione su entrambi i geni per manifestare la malattia.

A differenza dell’nDNA, l’mtDNA deriva solo dalla madre, quindi le patologie mitocondriali causate da mutazioni sull’mtDNA sono uniche. Solo una piccola frazione dei mitocondri presenti nella cellula precursore sopravvive nell’ovulo. Se per esempio, solo 10 sopravvivono e 8 di questi contengono mtDNA anomalo e l’ovulo viene fecondato, i bambini saranno più affetti della madre.

Tipi di geni

Gene: è un'unità funzionale che di solito codifica per una proteina o un RNA la cui eredità può essere seguita sperimentalmente. L’eredità può essere analizzata attraverso incroci genetici.

Gene con prodotto proteico: gene codificante per una proteina.

Cluster di RNA: regione contenente un gruppo di geni per piccoli RNA non codificanti.

RNA non codificanti lunghi: geni che codificano per RNA non codificanti (lncRNA).

Micro RNA: geni che codificano per microRNA (miRNA).

RNA ribosomiale: geni che codificano per rRNA.

Piccoli RNA nucleari: geni che codificano per snRNA.

Piccoli RNA nucleolari: geni che codificano per snoRNA.

Piccoli RNA citoplasmatici: geni che codificano per scRNA.

RNA transfer: geni che codificano per tRNA.

Retrovirus endogeni: elementi retrovirali integrati.

Siti fragili: un locus ereditabile su un cromosoma che tende a danni del DNA.

Famiglie di geni

Pseudogene

È una sequenza non funzionale che assomiglia molto a un gene funzionale conosciuto posto in un altro locus sul genoma. Lo pseudogene non è funzionale in seguito a una mutazione che ne impedisce la trascrizione o la traduzione (o entrambe) se essi provengono da ricombinazione (generalmente lo pseudogene è una duplicazione tandem del suo paralogo normale). Uno pseudogene processato è il risultato di una retrotrascrizione di un trascritto del suo paralogo normale (in questo caso lo pseudogene manca di introni e include code di poliA).

rRNA

La funzione principale del nucleolo è quella di trascrivere nDNA nel precursore 45S dell’rRNA e la sua elaborazione in rRNA 5.8 S, 18S e 28S. La metilazione in 2’ dei nucleotidi può proteggere l’rRNA dalla degradazione idrolitica, aumenta la superficie idrofobica per le interazioni o stabilizza l’asse dell’elica. Le pseudouridine aumentano la flessibilità dei legami glicosilici in C-C e possono aumentare la capacità di formare legami H contribuendo alla struttura terziaria dell’RNA.

RNA nucleari piccoli (snoRNA)

Sono piccoli RNA da 60-300 nucleotidi che si trovano maggiormente nel nucleo. La loro localizzazione fornisce una diretta connessione con la loro funzione: la maggior parte degli snoRNA funzionano come RNA guida per le modificazioni post-trascrizionali dei rRNA e alcuni RNA spliceosomiali, e con altri sono coinvolti nei processi nucleolitici dei trascritti originali di tRNA.

Le due classi principali di snoRNA sono coinvolte in due diversi tipi di modificazioni post-trascrizionali: i C/D snoRNA definiscono il sito target per la metilazione dell’O sul 2’ del ribosio, mentre gli H/ACA snoRNA definiscono i siti target per la pseudouridinazione. I C/D snoRNA sono associati con alcune proteine, inclusa la fibrillarina che è strutturalmente simile alla metil transferasi che è coinvolta nella metilazione dell’O in 2’ di particolari ribonucleotidi. Gli H/ACA snoRNA si associano con proteine come le pseudouridine sintasi (discherina).

Negli uomini e negli altri mammiferi, la maggior parte degli snoRNA sono codificati negli introni dei geni codificanti proteine e nei geni non codificanti proteine.

Trasposoni

Gli elementi trasponibili sono elementi genetici mobili diffusi, presenti sia nelle cellule eucariotiche sia procariotiche. Ci sono diverse classi di trasposoni:

• Classe I: usano un intermedio a RNA per spostarsi nel genoma. Il retrotrasposone si replica in un filamento di RNA (mediante trascrizione), si sposta e quando deve integrarsi in una nuova posizione del genoma viene copiato in un filamento a DNA (mediante retrotrascrizione). Di questi retrotrasposoni si distinguono due sottoclassi: i retrotrasposoni LTR (alle estremità presentano le LTR) e i retrotrasposoni non-LTR (non presentano le LTR alle estremità). Quest’ultimi sono ancora suddivisi in due sottotipi: LINE (lunghe sequenze intersperse) e SINE (corte sequenze intersperse).
• Classe II: si spostano nel genoma grazie a un enzima chiamato trasposasi che riconosce specifiche sequenze consenso. Questo enzima taglia il DNA e lo integra da un’altra parte. Questo è un esempio di ricombinazione non omologa perché l’integrazione non avviene per riconoscimento di sequenze omologhe (a differenza del crossing-over).

I trasposoni contengono i geni per l’integrazione e l’escissione al centro, mentre alle estremità si trovano delle sequenze ripetute invertite e una singola ORF che codifica per l’enzima trasposasi o per le proteine richieste per la retrotrasposizione.

piRNA (PIWI associate a RNA)

I piRNA sono piccoli RNA di circa 24-32 bp che si associano con le proteine PIWI (sottofamiglia delle proteine argonaute). Hanno la funzione di inibire la trasposizione bloccando la trascrizione dei trasposoni o degradando gli RNA trascritti da questi. Le proteine PIWI associate all’RNA possono riconoscere l’eucromatina o l’eterocromatina e apportare modificazioni istoniche che bloccano la trascrizione in partenza o dopo che è stata trascritta una piccola porzione di RNA. Tale modificazione consiste nella metilazione della lisina 9 su H3.

Piccoli RNA nucleari (snRNA)

Sono piccoli RNA che funzionano in una varietà di processi nucleari compreso lo splicing del pre-mRNA.

MicroRNA e siRNA

I microRNA (o miRNA) sono piccole molecole di RNA non codificante a singolo filamento codificati dal DNA nucleare principalmente attivi nella regolazione dell’espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale negli eucarioti. Vengono inglobati nel complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) e inducono il silenziamento genico.

I miRNA hanno solo una parziale similarità di sequenza con il trascritto bersaglio negli animali e il silenziamento dell’espressione genica avviene per inibizione della sintesi proteica attraverso meccanismi:

• Inibizione della formazione del cap
• Inibizione dell’unione della subunità 60S con 40S
• Inibizione dell’allungamento della sequenza
• Terminazione prematura della traduzione
• Degradazione proteica in fase di traduzione
• Sequestro nei P-bodies
• Destabilizzazione dell’mRNA bersaglio
• Taglio dell’mRNA bersaglio
• Inibizione della trascrizione mediante rimodellamento della cromatina

Un siRNA (RNA interferente breve) è una breve molecola di RNA coinvolto nel pathway dell’RNAi, che conduce all’inibizione dell’espressione dei singoli geni. Hanno un ruolo importante anche in altri processi legati all’RNAi (come il rimodellamento della cromatina).

Nomenclatura

Locus: punto specifico del genoma identificato da un marcatore (es variante fenotipica o differenza di un nucleotide su una sequenza). Un gene può avere diversi loci ognuno contenente un marcatore diverso; essi possono essere separati con esperimenti di mappatura genetica o fisica.

Le mappe genetiche per linkage sono mappe costruite mediante associazione genetica, determinando la frequenza con cui due marcatori sintetici (ossia associati e quindi localizzati sullo stesso cromosoma) sono ereditati insieme. Nelle mappe genetiche non è necessario conoscere la localizzazione sul cromosoma dei markers studiati, in quanto nella costruzione di queste mappe si cerca di svelare l'associazione tra due o più locus. Locus che sono molto vicini sul cromosoma hanno una probabilità maggiore di essere ereditati insieme rispetto a loci distanti. Maggiore è la distanza tra due loci genici, maggiore è la possibilità che vengano separati da crossing-over.

Affinché un marker possa essere usato per costruire mappe genetiche, esso deve essere polimorfico. Qualsiasi caratteristica fisica o molecolare ereditata nella progenie e che differisce tra gli individui di una popolazione e che abbia una frequenza superiore all'1%, è un potenziale marker genetico. I markers possono essere o regioni di DNA esprimibili o segmenti di DNA anonimi dei quali non si conosce niente, tranne che sono polimorfici.

I numerosi alleli per molecole MHC di classe I e II, gli antigeni del gruppo sanguigno ABO (un individuo può essere di gruppo sanguigno A, B, AB, o 0), la presenza di varianti enzimatiche (es. forma A e B di G-6Pi-DH, distinguibili su gel di poliacrilamide per diverso peso molecolare e mobilità elettroforetica), sono esempi di polimorfismo per sequenze di DNA codificante, il cui pattern ereditario può essere facilmente seguito.

Altri markers invece sono in grado di definire un polimorfismo neutrale, ossia variazioni all'interno di DNA non associate a effetti fenotipici tra gli individui di una popolazione, poiché spesso le mutazioni cadono all'interno di introni o sono mutazioni silenti. Esempi di quest'ultima categoria di markers sono i VNTR basati sugli RFLPs. I VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) sono sequenze nucleotidiche note ripetute in tandem un numero variabile di volte, precedute e seguite da sequenze di DNA a singola copia. Digerendo il DNA genomico di diversi individui con enzimi di restrizione che tagliano all'interno delle sequenze uniche che fiancheggiano un locus VNTR, si evidenzieranno dopo corsa elettroforetica del prodotto di digestione, frammenti di lunghezza diversa a seconda del numero di ripetizioni.

Polimorfismi di lunghezza degli enzimi di restrizione, che sono alla base degli RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), possono essere dovuti anche alla presenza/assenza nel genoma di un individuo di siti di taglio per enzimi di restrizione. Mutazioni puntiformi all'interno della sequenza riconosciuta da un enzima di restrizione hanno spesso come unico effetto la mancata digestione del DNA da parte di quell'enzima (evidenziabile dalla diversa dimensione dei frammenti dopo corsa elettroforetica). In ogni caso queste variazioni tra gli individui possono essere usate come marcatori per costruire mappe genetiche di linkage.

Le mappe fisiche descrivono l'ordine e la distanza tra due marcatori misurata in numero di nucleotidi (bp). La distanza della mappa genetica per le 3000 Mb del genoma umano è di circa 3000 cM e pertanto 1 cM corrisponde approssimativamente a una distanza di mappa fisica di 0.8 Mb. In realtà il rapporto delle distanze di mappa genetica e fisica sui segmenti cromosomici spesso deviano da questo valore medio a causa della localizzazione non casuale dei chiasmi. I segmenti cromosomici contenenti gli "hot spots" di ricombinazione mostrano una più alta frequenza di ricombinazione e per tanto markers localizzati in questa zona sembrano più distanti del reale. In generale c'è una frequenza di crossing-over più alta in corrispondenza delle regioni subtelomeriche rispetto a quelle centromeriche.

Allele

Le due copie di un gene autosomico o di un locus sul cromosoma materno e paterno sono alleli. Se i due alleli sono identici, cioè entrambi dominanti o entrambi recessivi, l’organismo è omozigote su quel locus. Se, invece, i due alleli sono diversi (uno dominante e uno recessivo), l’organismo è eterozigote su quel locus. Un transgene inserito in modo casuale nel genoma non è un allele del locus endogeno; se esso è presente solo in uno dei due set di cromosomi parentali questa condizione viene detta emizigosi.

Varianti alleliche

Sono differenze tra alleli distinguibili mediante un'analisi. Per esempio, differenze in una sequenza di DNA possono essere percepibili come SSLp, sequenze polimorfiche caratterizzate dalle ripetizioni di un pattern definito (come ad es. specifici di- o trinucleotidi), o come SNP, polimorfismi caratterizzati dalla mutazione di singoli nucleotidi. Altri tipi di varianti includono le differenze in un gene che si traducono in un differente PM o carica della proteina, differenze di attività di un enzima o differenze nella conformazione di un singolo filamento (SScP).

Polimorfismo

Si verifica quando due o più fenotipi sono presenti contemporaneamente nella stessa popolazione. Come per esempio il dimorfismo sessuale (maschio e femmina), mimetismo nelle farfalle, l’Hb umana e i gruppi sanguigni. Il termine è anche usato per descrivere le mutazioni puntiformi nel genotipo (polimorfismo genetico). Si parla di polimorfismo genetico quando una variazione allelica ha una frequenza maggiore dell’1% in una popolazione. Può essere determinato da sostituzioni, delezioni o inserzioni di basi nel DNA e può riguardare regioni codificanti e non. Se la variante allelica ha una frequenza minore dell’1%, non si hanno differenze nel fenotipo.

Aplotipo

Combinazioni di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento cromosomico contenente loci strettamente associati tra loro. Vengono ereditati insieme, ciò avviene quando un cromosoma si ricombina col suo omologo.

Omologo

Due geni sono omologhi quando si può riconoscere che si sono evoluti da un ancestrale comune. Hanno la stessa funzione, ma sono diversi. Ad esempio, tutti i geni della globina e mioglobina sono omologhi, anche se alcuni sono più connessi tra loro rispetto ad altri. Per stabilire questa connessione viene usata la percentuale di identità (ovvero quanto sono uguali due geni).

Ortologo

Geni di specie diverse sono ortologhi se si sono evoluti dallo stesso gene ancestrale comune (stesso gene in due organismi diversi). Ad esempio, il gene per l’Hb del topo è ortologo al gene per l’Hb umana.

Paralogo

Due geni sono paraloghi se hanno la stessa origine evolutiva, ma non la stessa funzione. Per esempio, il gene dell’α-globina del topo è paralogo al gene della β-globina.

Simboli dei geni

Ogni gene ha un nome e un simbolo. Esso deve essere:

• Unico all’interno di una specie e non deve essere uguale al simbolo di un gene di un’altra specie a meno che non siano omologhi.
• Corto, di solito non più di 3-5 caratteri, ma comunque non più di 10.
• Si usano lettere e numeri arabi.
• Si inizia con una lettera maiuscola seguita da una lettera minuscola o un numero. Nei batteri i geni si scrivono con lettere minuscole.
• Non include informazioni sul PM o sulla specificità tissutale.

Con qualche eccezione, si scrivono in minuscolo. I simboli di alcuni esempi sono:

• rpoA: α subunità dell’RNA poli
• rpoB: β subunità dell’RNA poli
• Amp: resistenza all’ampicillina

Gli alleli vengono indicati con un esponente, ad esempio leuA+ e leuA-:

• TSleuA: temperatura sensibile
• CSleuA: sensibile al freddo
• AΔleu: delezione
• leuA::Tn: inserzione

Le proteine hanno lo stesso simbolo dei geni, ma si scrivono in maiuscolo e non in corsivo (oppure in minuscolo e non in corsivo a seconda della specie). Nell’uomo i simboli dei geni vengono scritti in maiuscolo corsivo e sono costituiti da lettere e numeri. Le proteine vengono indicate nello stesso modo, ma non in corsivo.

Esempio di simbolo nome proteina:

• HBA1: Emoglobina α-1

Gli alleli si scrivono in corsivo e il wild-type ha come esponente un segno ⁺, ad esempio Kit è il wild-type del locus Kit. Le mutazioni vengono indicate con una lettera all’esponente.