Appunti Fisiologia Generale (prof.ssa Piazzesi)

Fisiologia Generale

La Membrana cellulare

È un doppio strato lipidico che separa il citosol dall'esterno, è composto di fosfolipidi, colesterolo,

glicolipidi e proteine. È una barriera selettiva che permette il passaggio solo di alcune sostanze, ad

esempio le concentrazioni di Na, Cl e Ca sono basse all'interno della cellula e quella di K è alta. Il

doppio strato lipidico è ben visibile al TEM (microscopio elettronico a trasmissione) ed ha uno

spessore di 30-70 Å (angstrom).

Esperimento di Gorter e Grendel (1925): misurano la superficie della membrana plasmatica

(sapendo che sono assenti organuli) li fanno scoppiare e mettono i lipidi anfipatici in acqua. Questi

formano uno un monostrato lipidico sul pelo dell'acqua ed inizialmente occupano tutta la superficie

a disposizione, ma comprimendoli si vede che la superficie minima che occupano è doppia rispetto

a quella misurata precedentemente→doppio strato.

Lo spessore di circa 50Å della membrana è stata misurato

anche con misure elettriche. La membrana si può infatti

schematizzare come un circuito formato da un condensatore

(il doppio strato lipidico) con una resistenza in parallelo (i

canali attraverso cui passano gli ioni). Facendo passare

corrente questa fa inizialmente accumulare cariche ai lati del

condensatore e poi inizia a passare dalla resistenza.

Dato che in tutte le cellule la capacità del condensatore è 1

2

µF/cm , si riuscì a calcolare che la distanza tra le due

armature del condensatore era di 50 Å.

I lipidi di membrana sono: glicerofosfolipidi, formati da

glicerolo con due code apolari e fosforo + gruppo polare e gli sfingolipidi formati da sfingosina

con coda apolare e gruppo polare.

I lipidi sono distribuiti asimmetricamente tra i due strati e la presenza di doppi legami influisce sulla

fluidità della membrana. Il colesterolo stabilizza la membrana fluidificandola alle basse temperature

e stabilizzandola alle alte temperature.

Si trovano inoltre proteine che possono avere due tipi di rapporto con la membrana: le proteine

integrali (o intrinseche) inserite nel doppio strato e le proteine periferiche (con una catena

idrofobica nello strato lipidico).

Anche le proteine di membrana sono asimmetriche, un esempio solo i gruppi glucidici portati

esclusivamente all'esterno della membrana. L'esistenza delle proteine integrali è stata dimostrata

con il Freeze-etching.

Esperimento di Frye e Edidin (1970): secondo il modello del mosaico fluido le proteine di

membrana sono in grado di muoversi orizzontalmente nel doppio strato lipidico. Questo fu

dimostrato con questo esperimento.

Prendono una cellula di topo ed una umana, dotate di specifici antigeni. Prendono gli anticorpi

specifici per gli antigeni del topo e li marcano con fluorescenza verde, prendono anticorpi specifici

per gli antigeni umani e li marcano con fluorescenza rossa.

Fanno fondere le due cellule grazie a un virus: si forma una chimera mezza rossa e mezza verde.

Ma dopo 40 minuti di incubazione la fluorescenza si è mischiata→le proteine sono libere di

muoversi.

Esperimento di recupero della fluorescenza dopo photobleaching: serve a dimostrare che

non tutte le proteine di membrana sono mobili, ma che alcune non lo sono (ad esempio quelle

legate al citoscheletro). 1 di 42

Prendono dei mioblasti e marcano in rosso le proteine di membrana e misurano quanto è intensa

la fluorescenza. In seguito una zona della cellula viene colpita con un laser che "rompe" il

marcatore fluorescente in un solo punto; se tutte le proteine fossero mobili dopo qualche minuto la

fluorescenza tornerebbe ad essere omogenea.

La fluorescenza aumenta gradualmente ma si ferma al 55% del valore iniziale→si hanno il 45% di

proteine che non sono in grado di muoversi orizzontalmente.

Trasporti di membrana

Quando si parla di trasporti di membrana è bene ricordarsi che il passaggio di sostanze cambia la

concentrazione all'interno del citosol ma non le concentrazioni dell'ambiente extracellulare. Questo

perché la cellula è infinitamente più piccola dell'ambiente extracellulare.

Trasporti passivi: avvengono spontaneamente, le sostanze si muovono secondo gradiente

chimico o elettrochimico. Sono la diffusione semplice, la migrazione nei canali e la diffusione

facilitata.

Trasporti attivi: sono trasporti contro gradiente, che portano la sostanza da una zona a

concentrazione bassa ad una zona a concentrazione alta consumando energia. Sono il trasporto

attivo primario ed il trasporto attivo secondario.

Trasporti in forma libera: diffusione semplice.

Trasporti tramite proteina transmembrana: la diffusione nei canali è l'unico trasporto non

mediato. Diffusione facilitata, trasporto attivo primario e secondario sono tutti trasporti mediati.

Diffusione semplice

La diffusione semplice è un tipo di trasporto che non necessita di nessun sistema proteico.

Le molecole apolari come gli ormoni steroidei sono capaci di diffondere facilmente attraverso il

doppio strato lipidico. Queste passano facilmente perché la zona interna della membrana è

costituita de catene idrocarburiche. Anche piccole molecole polari come l'acqua, l'urea, il glicerolo

e l'etanolo e l'indolo riescono a passare pur con una certa difficoltà.

È causata dall'agitazione termica delle particelle in soluzione, che tendono ad occupare il massimo

spazio possibile. Se la soluzione è divisa da una membrana permeabile al soluto e dalle due parti

ci sono concentrazioni diverse le particelle di soluto si muoveranno attraverso la membrana. Le

particelle si muoveranno sia dalla zona a concentrazione alta (1) a quella a concentrazione bassa

(2) e viceversa, ma la probabilità che una molecola che urta la membrana passi dalla zona 1 alla

zona 2 è più alta rispetto ala probabilità che accada il contrario.

Si hanno quindi due flussi che sommati algebricamente danno un flusso netto (ds/dt) che va dalla

zona 1 alla zona 2. Il flusso netto è calcolato tramite la legge di Fick:

ds= sostanza

dt= tempo

A= area su cui avviene la diffusione

dc/dx= concentrazione in funzione della distanza

D= coefficiente di diffusione, rappresenta la facilità con cui la sostanza passa attraverso la

membrana.

Nella membrana dc/dx è dato da: 2 di 42

dove β è il coefficiente di ripartizione olio-acqua, cioè la ripartizione della sostanza dopo averla

centrifugata con olio e acqua. X è lo spessore di membrana e ΔC è la differenza di conc.

L’equazione di Fick diventa:

dove P è il coefficiente di permeabilità, che "ingloba" D, β e X P= (D*β/x) = cm/s. P rappresenta la

facilità con cui una determinata sostanza passa attraverso la membrana.

È bene ricordare che:

• La diffusione semplice non mostra saturazione con l'aumentare del gradiente di

concentrazione.

• Sostanze diverse non competono tra di loro.

• Le dimensioni della molecola influenzano poco la diffusione (β è il fattore determinante).

• Solitamente i gas passano per diffusione semplice.

Osmosi

L'osmosi è la diffusione dell'acqua, da una soluzione più diluita (dove c'è più acqua) a una

soluzione più concentrata (dove c'è meno acqua), questo avviene nel caso in cui le due soluzioni

siano separate da una membrana semipermeabile che non lascia passare il soluto.

La pressione osmotica dipende solo dal numero di particelle in soluzione e non dalla loro natura (è

infatti una proprietà colligativa).

Osmolarità: equivale al numero di particelle nell'unità di volume, ad esempio una soluzione 2

molare di NaCl sarà 4 osmolare, perché ci sono 2 moli di Na e 2 moli di Cl: 4 moli di particelle.

Facendo riferimento a una cellula e alla soluzione in cui essa è immersa si trovano 3 casi:

• Isoosmolarità: la soluzione ha la stessa concentrazione osmotica.

• Ipoosmolarità: la concentrazione osmolare della soluzione è inferiore a quella nella cellula.

• Iperosmolarità: la concentrazione osmolare della soluzione è superiore a quella nella

cellula.

Questi concetti non sono però applicabili in biologia, in quanto non tengono conto delle

caratteristiche della membrana cellulare (a quali ioni è permeabile o meno), si parla invece di

tonicità:

• Soluzione isotonica: il volume cellulare non cambia.

• Soluzione ipotonica: il volume cellulare aumenta.

• Soluzione ipertonica: il volume cellulare diminuisce.

Le due cose potrebbero sembrare simili, ma non lo sono→ osmolarità = tonicità solo sei soluti non

passano attraverso la membrana. I soluti permeabili infatti entrano nella cellula e festa finita.

Il soluto permeabile può però causare effetti osmotici transitori:

se metto la cellula in una soluzione con la stessa concentrazione di sali, ma con una più alta

concentrazione di glicerolo (permeabile), inizialmente la cellula perde acqua, ma successivamente

il glicerolo vi entra e la cellula riacquista anche l'acqua.

Migrazione nei canali

È un trasporto passivo in forma mediata, in cui gli ioni diffondono secondo il proprio gradiente

elettrochimico. Alcuni canali sono sempre aperti, ma la maggior parte è regolata; questi canali

vengono classificati a seconda del meccanismo di apertura: 3 di 42

• Canali voltaggio dipendenti: si aprono quando il potenziale di membrana cambia, sono

selettivi.

• Canali controllati da ligando: hanno uno o più siti a cui si può legare un ligando, che può

arrivare dall'interno o dall'esterno della membrana. I ligandi esterni sono neurotrasmettitori

o ormoni, quelli interni sono solitamente cAMP o cGMP. Questi canali sono solitamente

meno specifici, fanno passare o anioni o cationi.

• Canali controllati da stimolo meccanico: si trovano ad esempio in cellule sensoriali

sensibili alla pressione, il canale è legato al citoscheletro in modo che quando la cellula è

deformata il canale si apra.

• Canali controllati dalla fosforilazione: la fosforilazione non controlla l'apertura del canale

ma ne modula l'attività, rendendolo più o meno sensibile a un altro tipo di controllo.

+

I canali voltaggio dipendenti sono del potassio (K ) sono costituiti da 4 subunità, ciascuna con 6

domini transmembrana (α-elica). Si trovano delle anse che uniscono i domini, l'ansa P unisce le

due α-eliche più vicine all'estremità C terminale della proteina ed è rivolta all'interno del canale.

Le 4 anse P del canale completo riproducono la disposizione sterica delle molecole di H O che

2

+

solvatano K in soluzione. La posizione delle anse P va bene per sostituire le molecole d'acqua di

K ma non quelle di Na.

Diffusione facilitata

La diffusione facilitata è un trasporto passivo in forma mediata, va secondo gradiente.

È una forma di trasporto mediata da proteine carrier (trasportatrici), queste sono ancorate alla

membrana e non si muovono, il trasporto avviene nel modo seguente: la proteina ha un sito di

legame verso l'esterno, vi si lega il ligando che induce un cambio di conformazione, la proteina lo

rilascia quindi all'interno della cellula.

Il processo avviene in entrambe le direzioni, con la velocità che dipende dalle concentrazioni.

Se aumentiamo la concentrazione del soluto extracellulare si nota che inizialmente la velocità di

trasporto aumenta, poi lentamente si adagia su u valore massimo. Infatti a un certo punto tutti i

carrier contenuti nella membrana sono occupati e la velocità di trasporto non può più aumentare.

Si nota facilmente che questa cinetica è molto simile alla cinetica

enzimatica, descritta dall'equazione di Michaelis - Menten.

V rappresenta la velocità massima, e K rappresenta la concentrazione

MAX M

di substrato a cui si raggiunge V /2 (la metà di V ). più piccola è K più

MAX MAX M

grande è l'affinità tra substrato e proteina carrier.

L'affinità del carrier per il substrato può cambiare a seconda del tipo cellulare; ad esempio il

glucosio è trasportato con K differente nei neuroni e nelle cellule β. I neuroni hanno infatti un

M

bisogno costante di glucosio ed infatti i loro carrier hanno K bassa, in modo che anche quando la

M 4 di 42

glicemia è bassa il trasporto è sempre vicino al massimo. I carrier delle cellule β hanno invece K M

alta, le cellule β secernono infatti secernono insulina ed hanno bisogno di sapere a che livello è la

glicemia nel sangue; la K alta fa in modo che il trasporto a velocità massima ci sia solo quando la

M

glicemia è altissima.

La diffusione facilitata è un trasporto specifico, in cui sostanze simili sono in competizione per lo

stesso carrier. Un esempio sono gli zuccheri, che si inibiscono a vicenda a seconda della loro

affinità.

Trasporto attivo primario

• È un trasporto mediato.

• Le proteine agiscono come pompe che trasportano i soluti contro gradiente, dalla soluzione

meno concentrata alla più concentrata.

• Utilizza energia cellulare, di solito sotto forma di ATP. 2+

Esempi notevoli sono la pompa sodio-potassio, la pompa calcio (porta Ca all'esterno o dentro il

+ +

REL) e l'idrogeno - ATP-asi che porta un K nella cellula e un H fuori.

Pompa sodio potassio: Il rapporto di scambio 3:2 della pompa Na/K è stato mostrato in globuli

rossi umani.

Prima degli esperimenti le cellule sono state mantenute per lungo tempo a 2 °C in modo da inibire

l’attività della pompa e farle equilibrare con la soluzione extracellulare.

Le cellule venivano poi perfuse con un mezzo a 37 °C.

Il contenuto intracellulare di Na+ e K+ veniva misurato a tempi diversi dall’inizio perfusione.

Se nel mezzo era presente K+, la concentrazione intracellulare di Na+ diminuiva ad una velocità

1.5 volte più grande della velocità con cui la concentrazione intracellulare di K+ aumentava.

Inizialmente ha un sito verso l'interno della cellula, vi si legano 3 ioni sodio.

- La proteina diventa in grado di legare un ATP, un fosfato (dell'ATP) viene messo (dalla

- proteina stessa) su una catena laterale (interno alla cellula).

La proteina cambia conformazione, portando all'esterno i 3 Na, si forma un sito rivolo verso

- l'esterno con alta affinità per due ioni potassio.

+

I due K si legano, inducendo la formazione di un sito fosfatasico che stacca il fosfato dalla

- +

catena laterale→la proteina torna alla conformazione iniziale e porta dentro i due K .

Il trasporto di sodio è stato studiato sull'assone di calamaro, si è visto che:

• è contro il gradiente elettrochimico.

• è sensibile ai veleni metabolici e quindi dipende dall’ATP.

• + +

dipende dal K esterno (infatti la pompa ha bisogno dei 2 K per defosforilarsi).

• è fortemente dipendente dalla temperatura.

• è inibito dall’ouabaina.

Trasporto attivo secondario

È un trasporto accoppiato, infatti l'energia che serve a trasportare uno ione contro gradiente è

fornita dal movimento secondo gradiente di un'altra sostanza (in genere Na).

È un trasporto mediato, in cui l'energia non è fornita direttamente dall'ATP (che però ha comunque

portato fuori Na…) ed avviene contro gradiente.

Si parla di simporto quando le due sostanze vengono trasportate nella stessa direzione e di

antiporto quando vengono trasportate in direzioni opposte. 5 di 42

+

L’ingresso di alanina (come di altri AA) dipende dalla concentrazione extracellulare di Na .

+

In assenza di Na il trasporto di alanina avviene per diffusione facilitata: la massima [alanina]i è

uguale a quella extracellulare, ma questa è poca ed il trasporto è troppo lento.

+

In presenza di Na invece il trasporto di alanina nella cellula è un trasporto attivo secondario:

l’alanina viene accumulata dentro il citosol in cui raggiunge concentrazioni molto maggiori di quella

extracellulare. + 2+

Scambiatore sodio-calcio: vengono portati dentro 3 Na ed esce un Ca . Questo antiporto è

favorito dall'iperpolarizzazione della cellula, perché nel complesso entra una carica positiva (e

l'interno della cellula è negativo).

Giunzioni intercellulari

Ci interessano per i trasporti attraverso gli epiteli. Si distinguono tre tipi di giunzioni:

Tight junctions (giunzioni serrate): le membrane delle due cellule sono praticamente fuse. Sono

tipicamente presenti nei tessuti epiteliali di rivestimento di organi cavi (rene e tratto

gastrointestinale) che svolgono funzioni di assorbimento e secrezione di ioni e molecole.

Costituiscono una barriera impermeabile alle sostanze polari tra lato luminale (appunto verso il

lume) e lato sierosale (verso i vasi) dell’epitelio.

Giunzioni aderenti: Giunzioni filamentose tra due cellule formate da una placca di glicoproteine

all’interno e da filamenti proteici che si estendono verso l’esterno (caderine). Conferiscono stabilità

meccanica alle giunzioni, sono quindi presenti nei tessuti soggetti a stress meccanico: cuore, utero

e cute.

Giunzioni comunicanti (gap junction): non si ha fusione di membrana ma si trovano i pori

(formati da proteine) che mettono in comunicazione i citoplasmi i pori possono essere chiusi o

aperti. Lasciano passare molecole o ioni di piccole dimensioni.

Trasporto transepiteliale

Struttura dell’epitelio

• la membrana apicale dell’epitelio è rivolta verso il lume della cavità corporea.

• la membrana basolaterale è in contatto con il liquido interstiziale, che scambia sostanze

con il sangue.

• le cellule adiacenti sono unite principalmente da giunzioni serrate, che limitano il passaggio

di sostanze: i due liquidi sui due lati del