Appunti esame laboratorio di biologia

Equazione di Henderson-Hasselbalch

La formula dell'equazione di Henderson-Hasselbalch è:

pH = -log(K) - log(a) - [A-]/[HA]

Questa equazione permette di calcolare il pH di una soluzione tampone conoscendo le concentrazioni dell'acido debole e della sua base coniugata, e la costante di dissociazione acida (pK). In modo simile, il pK di una base è il logaritmo decimale negativo della costante di dissociazione basica (Kb).

Quando l'acido debole e il suo sale sono presenti in una soluzione tampone alla stessa concentrazione, l'equazione di Henderson-Hasselbalch diventa:

pH = pK - log(1)

pH = pK

Possiamo definire il pK di un acido come il valore di pH al quale l'acido è dissociato al 50%, e lo stesso vale per il pKb come valore di pH al quale la base è dissociata al 50%. Gli acidi e le basi forti hanno valori di pK e pKb molto bassi (le specie più forti hanno valori ancora più bassi).

valori negativi); i valori di pK e pK divengono progressivamente più grandi ala bdiminuire della forza dell’acido o della base. Una soluzione in cui l’acido debole e il suo sale sono presenti in concentrazioni uguali ha il massimo potere tampone perché le 2 specie sono in grado di neutralizzare uguali quantità di acidi e basi forti. Abbiamo perciò il massimo potere tampone di una soluzione quando un valore di pH è pari al pK adell’acido debole. Una soluzione tampone può svolgere la sua funzione tampone anche se l’acido debole è presente in concentrazioni maggiori rispetto al suo sale o viceversa purché i rapporti delle 2 specie rimangano all’interno di un intervallo compreso tra 10:1 e 1:10. Una soluzione tampone funziona come tale nell’intervallo di pH compreso tra il valore di pK -1 e pK +1. La scelta di una soluzione tampone dipende sempre dal valore di pH a desiderato e che deve essere mantenuto costante.

Se voglio mantenere un pH intorno a 5 seleziono una specie tampone con un pK tra 4 e 6. Il tampone biologico ideale dovrà avere le seguenti caratteristiche:

• deve tamponare a pH vicino alla neutralità (approssimativamente il pK del tampone dovrebbe essere compreso tra 6 ed 8);
• deve essere altamente solubile;
• non deve penetrare attraverso le membrane (se si studiano organelli);
• deve essere stabile chimicamente ed enzimaticamente;
• non deve assorbire luce nelle regioni dello spettro UV-visibile (per non interferire con la determinazione spettrofotometrica delle proteine);
• non deve essere tossico;
• deve costare poco.

Come si misura il pH non matematicamente? In laboratorio si utilizzano la cartina tornasole e il pH-metro con elettrodo a vetro. Il pH-metro con elettrodo a vetro è così chiamato perché la sua estremità inferiore è costituita da vetro permeabile agli ioni H contenuti nel liquido in esame, che entrano in contatto.con la soluzione e i cavi metallici all'interno dell'elettrodo stesso, permettendo così una misura di differenza di potenziale in mV, poi trasformata sul display del pH-metro direttamente in unità di pH. Il pH-metro misura il voltaggio tra 2 elettrodi immersi in una soluzione (uno di lavoro e uno di riferimento). L'elettrodo di lavoro contiene una soluzione di HCl 0,1 M (e non solo) e presenta una membrana di vetro. L'elettrodo di riferimento serve per stabilire la differenza di potenziale, che si crea grazie alla differenza di concentrazione di H tra la parete interna ed esterna della membrana di vetro. Se la soluzione è acida si avrà accumulo di ioni H sullo strato superficiale della membrana; se invece la soluzione è basica si avrà un impoverimento di ioni H sullo strato superficiale della membrana. Il potenziale elettrico registrato dall'elettrodo di riferimento è dovuto a questo squilibrio tra ioni H.presenti sugli strati superficiali+interno ed esterno della membrana, perciò occorre fare attenzione a non romperla. Essendo molto sottile, essa non va mai lasciata asciugare: per questo motivo l’elettrodo deve essere sempre conservato all’interno di un piccolo contenitore di plastica contenente una soluzione di elettrolita forte, in genere KCl 3 M. Il pH-metro è uno strumento che deve essere tarato. La taratura richiede l’utilizzo di 2 soluzioni a pH diverso. Di norma si effettua prima la taratura con un tampone a pH 7 e poi con uno a pH 4 oppure a pH 9. Dopo la taratura, l’elettrodo viene sciacquato e immerso nella soluzione in esame e fornirà una misura rapida ed accurata del pH. Spesso, associata alla sonda che contiene gli elettrodi, esiste anche una sonda di temperatura, il cui compito è correggere la lettura dell’elettrodo in funzione dell’effettiva temperatura del campione. Omogeneizzazione e tecniche di centrifugazione Perconsiste in diverse fasi: 1. Rottura delle membrane o pareti cellulari: questo passaggio è fondamentale per rilasciare tutti i componenti intracellulari. A seconda del tipo di materiale di partenza, possono essere utilizzati diversi metodi di rottura, come l'omogenizzazione meccanica, l'omogenizzazione a ultrasuoni o l'omogenizzazione chimica. 2. Preparazione dei tamponi di omogeneizzazione: i tamponi di omogeneizzazione sono soluzioni che contengono sostanze chimiche specifiche per mantenere l'integrità delle molecole biologiche durante il processo di omogeneizzazione. Le proprietà chimico-fisiche di questi tamponi devono essere adattate alle caratteristiche del materiale di partenza e alle analisi che si intendono effettuare. 3. Selezione delle frazioni cellulari: a seconda degli obiettivi dell'analisi, è possibile isolare specifiche frazioni cellulari, come mitocondri, nuclei o lisosomi. Questo può essere fatto utilizzando metodi di centrifugazione differenziale o altri metodi di separazione cellulare. Una volta completato il processo di omogeneizzazione, è possibile procedere con le analisi desiderate sui componenti intracellulari ottenuti.

viene effettuato a bassa temperatura (camera fredda a 4 °C e soluzioni raffreddate in ghiaccio). Il tessuto o le cellule vengono sospese in opportuni volumi di tampone (tampone o buffer di omogeneizzazione). I buffer devono mantenere il più possibile l'integrità degli organelli e delle macromolecole presenti nella cellula. La formulazione di queste soluzioni è basata sulle caratteristiche chimico-fisiche dei fluidi biologici. In particolare, sarà importante che queste soluzioni mantengano un pH simile a quello fisiologico e che siano isotoniche rispetto alle cellule e agli organelli.

Il buffer può contenere alcuni componenti che preservano l'integrità biologica dei componenti. Tra questi i più comuni sono:

• il Tris-HCl o fosfato mantiene il pH a valori fisiologici per evitare la denaturazione delle proteine;
• i tamponi zwitteronici (HEPES, MES, MOPS);
• i sali KCl e NaCl hanno sempre un effetto stabilizzante;
• il saccarosio.

Serve a prevenire la lisi osmotica di organuli intracellulari e a ridurre la polarità del mezzo acquoso;

gli ioni Mg aiutano a preservare l'integrità dei sistemi di membrana controbilanciando le cariche negative dei fosfolipidi di membrana.

Il buffer può contenere alcuni componenti che servono ad evitare la degradazione dei componenti. Tra questi i più comuni sono:

• l'EDTA (acido etilendiaminotetracetico) è in grado di "chelare" alcuni metalli che possono legarsi ai gruppi SH delle proteine inattivandole. L'EDTA rimuove anche il Ca che aiuta l'attivazione di enzimi come proteasi, nucleasi e lipasi (enzimi litici) presenti nell'omogenato. In alternativa si può usare anche l'EGTA che non chela il Mg (ione che spesso viene usato per la purificazione di proteine);
• gli inibitori di proteasi. Se le proteasi lisosomiali non vengono inibite allora queste digeriscono i lisozimi e portando ad una

acidificazione del citoplasma (PMSFantiossidante);

gli inibitori delle nucleasi per gli acidi nucleici;

i detergenti non ionici come il TRITON X-100 che, utilizzato a basse concentrazioni, previene il processo di aggregazione delle proteine;

gli agenti riducenti vengono utilizzati per preservare le proteine dall'ossidazione.

I metodi di rottura delle cellule dipendono dal tipo di cellula, dal suo grado di resistenza (membrane o pareti cellulari) e dalla finalità dell'esperimento. Esistono sia metodi meccanici sia metodi non meccanici.

I metodi meccanici sono:

• frullatori a lama o a sferette. Sono utilizzati per tessuti vegetali o animali e non possono essere utilizzati per microrganismi. Il tessuto viene sminuzzato per azione delle lame o delle sferette;
• omogeneizzatori tipo potter. Il tessuto viene messo in una provetta all'interno della quale agisce un pestello azionato a mano o mantenuto in rotazione grazie a un motore elettrico. Il tessuto è

omogeneizzatore tagliano e frantumano il materiale biologico. Questo metodo è particolarmente efficace per tessuti animali e cellule, ma può danneggiare le cellule vegetali a causa della loro parete cellulare resistente; sonicatori ad ultrasuoni. Questi dispositivi utilizzano onde sonore ad alta frequenza per rompere le cellule e omogeneizzare il materiale biologico. Sono molto efficaci per cellule e microrganismi, ma possono danneggiare i tessuti animali a causa del calore generato durante il processo; omogeneizzatori a pressione. Questi dispositivi utilizzano una pressione elevata per forzare il materiale biologico attraverso piccoli fori, rompendo le cellule e omogeneizzando il campione. Sono adatti per tutti i tipi di materiale biologico, ma possono richiedere attrezzature speciali e sono più costosi rispetto agli altri metodi. In conclusione, esistono diversi metodi per omogeneizzare il materiale biologico, ognuno con i suoi vantaggi e limitazioni. La scelta del metodo dipende dal tipo di campione e dall'obiettivo dell'omogeneizzazione.

rotore vengono fatteruotare ad alta velocità. Anche questa procedura genera calore, quindi sarà sempre opportuno lavorare in camera fredda o comunque mantenendo le soluzioni inghiaccio;

french press. La sospensione di cellule è inserita in una camera di compressione di acciaio inox, dotata di pistone e chiusa da una valvola a spillo. Si rimuove tutta l'aria dalla camera e mediante il pistone vengono applicate sulle cellule pressioni idrauliche elevatissime (fino a 1000 atm). Le cellule subiscono una compressione notevole. Poi si apre lentamente la valvola a spillo, in questo modo le cellule possono fuoriuscire dalla valvola stessa. A causa del brusco sbalzo di pressione cui sono sottoposte uscendo dalla valvola, le cellule esplodono e si frantumano. Il metodo funziona bene per volumi medi di materiale e per i microrganismi;

sonicazione. Nell