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Appunti esame Fisiologia generale

Appunti di fisiologia generale basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Beltramini dell’università degli Studi di Padova - Unipd, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea in biologia. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Fisiologia generale docente Prof. M. Beltramini

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L’acqua si muove strutturandosi in modo opportuno : il passaggio da una configurazione spaziale all’altra

comporta anche lo spostamento secondo lo spessore di membrana.

Processi di permeabilità strutturale

I processi diffusionali in soluzione possono essere sufficientemente efficienti su scala microscopica, ma sono

inefficienti su scala macroscopica.

Come descriviamo il movimento di un soluto all’interno della soluzione? Attraverso un meccanismo “random

walk” cioè di cammino casuale → per spostarsi da una posizione x a una posizione x il soluto non si muove

1,

attraverso una traiettoria lineare ma attraverso una traiettoria dipendente dalle continue interazioni della

molecola di soluto con le molecole di solvente.

Lo spazio sperimentato dal soluto in una soluzione non è lo spazio vuoto che una molecola di gas ideale può

sperimentare (se guardiamo alle trasformazioni ideali), ma è uno spazio in cui l’acqua occupa la quasi totalità

dello spazio.

Questo implica allora che il movimento di un soluto da una posizione ad un’altra determina continue

interazioni con il solvente.

Esiste però una legge che dice che lo spostamento medio del soluto da una posizione ad un’altra avviene in

un tempo che cresce secondo il χ dello spostamento stesso.

2 2

t = <χ > / 2D

<χ2> = spostamento quadratico medio nel tempo t dall’inizio della diffusione. Il tempo richiesto per

diffondere cresce con il quadrato della distanza. Il tempo richiesto per diffondere cresce con il quadrato della

distanza.

Tutto questo si traduce in un diagramma che mette in relazione lo spostamento quadratico medio di una

sostanza con il tempo.

D = 5 x 10 cm sec

-6 2 -1

Uso il doppio logaritmo per comprimere il grafico e mi accorgo che fin tanto che le dimensioni sono dentro i

micron i tempi sono dell’ordine dei micro o milli secondi (per vedere spostamenti netti dell’ordine dei

micron).

Se uso una scala più macroscopica in cm, i tempi legati ai processi diffusionali crescono nell’ordine del

giorno, se guardiamo al metro i tempi crescono nell’ordine degli anni.

La lentezza con cui avvengono i processi diffusionali semplici imporrebbero dei limiti molto precisi alla

capacità che gli organismi hanno di regolare il turnover delle sostanze.

Perché gli organismi hanno la possibilità di avere turnover di soluti molto efficienti? Perché sostituiscono ai

semplici processi diffusionali dei processi dipendenti dal movimento non solo del soluto ma anche dal

movimento di acqua..

Per ottimizzare i tempi quindi l’acqua viene messa in movimento trascinando con sé il soluto.

Obiettivo : capire i meccanismi attraverso i quali il movimento del solvente possa mettere in movimento

anche il soluto in esso contenuto.

J (flusso di acqua) = - U c dμ/dx con μ che corrisponde al valore dell’acqua.

Utilizziamo l’equazione di Teorell per generare un’equazione differenziale che permetta di predire qual è il J

di questo solvente (che contiene all’interno il soluto, quindi una volta trovato il movimento di solvente posso

anche trovare quello del soluto trascinato dal solvente).

Se guardiamo alla struttura del potenziale dell’acqua lo vediamo dipendere da logc e V° P questo ci fa

pensare che l’acqua può essere messa in movimento da una differenza di concentrazione o una differenza di

pressione idrostatica. Ma dire differenza di concentrazione di acqua significa parlare di gradiente osmotico.

OSMOSI

Quando due soluzioni diversamente concentrate vengono in contatto, non si osserva solo la diffusione delle

molecole del soluto dalla soluzione più concentrata verso quella meno concentrata, ma anche la diffusione

delle molecole d’acqua in direzione opposta. Questo flusso diffusionale dell’acqua prende il nome di osmosi

o flusso osmotico ed avviene perché la presenza delle molecole del soluto, come illustrato in figura, fa

diminuire la concentrazione dell’acqua. Poiché le leggi della diffusione non si applicano solo alle molecole

del soluto, ma anche a quelle dell’acqua, e la concentrazione dell’acqua è tanto maggiore quanto più diluita

è la soluzione, anche le molecole d’acqua diffondono dalle zone dove sono più addensate (quelle dove il

soluto è più diluito) verso quelle dove sono più rarefatte (quelle dove il soluto è più concentrato).

Se aggiungo del soluto il volume aumenta perché nella soluzione non

ci sarà più soltanto il volume contribuito dalle molecole d’acqua ma

anche il volume contribuito dalle molecole di soluto più il covolume

contribuito dalle interazioni soluto – acqua.

Di quanto cresce il volume di questa soluzione rispetto al solvente

puro ? Di quel V° (che troviamo nella scrittura del potenziale chimico

dell’acqua).

Quel V° è il volume molale che indica cioè l’aumento di volume che ha

1 kg di acqua quando in essa è sciolta una mole di soluto.

Aggiungendo n molecole di soluto il volume cresce. Se mettiamo insieme il solvente puro con la soluzione

otteniamo un sistema dove posso definire un’interfaccia che separa il compartimento con l’acqua pura dal

compartimento con la soluzione.

La concentrazione di acqua in 1 è maggiore della concentrazione di acqua in 2 poiché il volume è aumentato.

Esiste un gradiente di potenziale chimico dell’acqua che diminuisce andando da 1 verso 2.

Per scrivere quel valore di J (del flusso normalizzato per unità di superficie) a partire dalla scrittura del

μ = μ (T) + RT ln c + V°p J = - U c

potenziale chimico dell’acqua e dall’equazione di Teorell

a 0 a

dμ/dx J = - (D dc /dx + U c V ° dp/dx)

ricavo : a a a a a

D coefficiente di diffusione dell’acqua, è moltiplicato per il gradiente di concentrazione di acqua : l’acqua si

a ,

muove in base a un gradiente di potenziale chimico dipendente solo dalla concentrazione così come si

muove qualsiasi altro anaelettrolita.

Il movimento di acqua deriva da due componenti : una componente chimica e una componente idrostatica.

π = n c RT

Equazione di Vant Off dove la pressione osmotica vale come RT volte la concentrazione di

s

soluto elettrolitico moltiplicato per il numero di specie dissociate che si producono quando ho una certa

concentrazione c di soluto se esso è elettrolitico.

Come si combina quest’equazione con quella precedente? Questo flusso di acqua deriva dal fatto che l’acqua

tende a muoversi da dove è più concentrata (acqua pura) a dove è meno concentrata (soluzione),

muovendosi tenderà a modificare il volume. Posso pensare di annullare quel movimento di acqua applicando

una certa pressione idrostatica nel compartimento di arrivo di acqua. Il fatto di poter applicare una certa

pressione idrostatica e grazie a questa annullare il flusso di acqua deriva proprio da come è costruito il flusso.

Non sempre le grandezze scritte nell’equazione del flusso sono concordi, possono essere anche discordi e il

fatto di annullare il flusso deriva proprio dal fatto che applico una pressione idrostatica in un compartimento

che è discorde rispetto alla differenza di concentrazione di acqua. Quando quelle due forze, quella chimica e

quella idrostatica sono uguali e contrarie, il flusso si annulla.

Quando applico una pressione idrostatica in D tale per cui annullo la componente del flusso dipendente dalla

differenza di concentrazione, cioè annullo la componente del flusso dipendente dalla forza chimica, quella

pressione è detta pressione osmotica = è la pressione idrostatica che è necessario applicare nel

compartimento di arrivo di acqua per annullare completamente il flusso (per definire questa grandezza si

utilizza uno strumento osmometro).

Come possiamo descrivere la forza che genera il movimento di acqua?

Il movimento d’acqua dipende da:

• Una forza “esterna” (forza idrostatica) alla soluzione legata alla esistenza di una differenza di

pressione idrostatica fra due elementi di volume.

• Una forza “interna” alla soluzione legata alla esistenza di una differenza di concentrazione d’acqua

fra due elementi di volume.

! Queste due componenti non necessariamente sono sempre concordi, possono essere anche discordi ed è

in base a questa discordanza tra le due forze definisco la pressione osmotica.

L’ integrazione dell’equazione differenziale che descrive il flusso di acqua in funzione delle forze coniugate di

J = -D dc /dx - U c V ° dp/dx

tipo chimico ed osmotico : da questa equazione ricavo questa che

a a a a a

J = P (σΔπ + Δp)

descrive il flusso volumetrico di acqua : quel J è espresso in volume di acqua

v osm teor v

(cm ) per unità di tempo per unità di superficie.

3

P : coefficiente di permeabilità osmotica lega due grandezze che sono di fatto quelle già presenti

osm Δπ

nell’equazione differenziale cioè una differenza di pressione osmotica ( ) e una differenza di pressione

Δp

idrostatica ( ).

Il pedice teor è perchè la pressione osmotica che considero è quella teorica cioè calcolata in base

all’equazione di Vant Off.

In relazione al tipo di membrana che ho a disposizione : se la membrana è semipermeabile ideale allora ci

troviamo nelle condizioni di avere una pressione osmotica che coincide con quella teorica, ma se la

membrana che ho a disposizione è una membrana che è in qualche misura permeabile non solo all’acqua ma

anche al soluto quella pressione osmotica teorica dovrà essere corretta.

La pressione osmotica teorica può valere anche 0 se la membrana è permeabile al soluto tanto quanto lo è

all’acqua, quella differenza di pressione osmotica vale quindi 0.

Questo non significa che i flussi di acqua non ci possono essere, ci saranno sulla base di una forza di natura

idrostatica.

σ .

Il termine prende il nome di coefficiente di riflessione

È un coefficiente che dice quanto la membrana è semipermeabile ideale o si discosta dall’idealità.

σ = π / π π

cioè pressione osmotica osservata ( ) fratto la pressione osmotica teorica secondo

obs teor obs

l’equazione di Vant’ Off.

σ è adimensionale e compreso tra 0 e 1 perché nel caso di idealità la pressione osmotica osservata coincide

con quella teorica, quindi quel rapporto vale 1. Nel caso in cui la membrana non sia semipermeabile ideale

ma completamente permeabile al soluto, la pressione osmotica osservata vale 0.

σ = 1

Se il flusso dipendere anche dalla differenza di pressione osmotica tra le due parti del sistema ma se

σ = 0 l’acqua si muoverà soltanto sulla base di una differenza di pressione idrostatica.

Quindi l’acqua può essere messa in movimento da una combinazione di forze, può distribuirsi attraverso il

doppio strato lipidico e in questo caso mi aspetterei che la posizione sulla scala di permeabilità rispetto al

coefficiente di ripartizione sia verificato anche per l’acqua.

Ma il valore di permeabilità all’acqua è molto maggiore per le membrane naturali rispetto alle membrane

artificiali e ai semplici doppi strati lipidici quindi i flussi di acqua li descriviamo sempre in base a una

combinazione della forza interna con la forza esterna legate tra loro in modo algebrico e con questo

coefficiente di permeabilità .

Nel caso siano presenti proteine che forniscano un poro di permeazione allora cambia il coefficiente di

permeabilità che viene detto coefficiente di permeabilità idraulica → i flussi in presenza di acquaporine

sono molto più intensi di quelli che si avrebbero in assenza di acquaporine.

Il coefficiente di permeabilità idraulica è un coefficiente che racchiude dentro di sé varie costanti .

È definito per una modalità molto particolare di flusso d’acqua che non necessariamente è sempre quella

verificata : si definisce così quando il movimento di acqua è laminare o quasi laminare.

Se il movimento di acqua avviene secondo una modalità di tipo turbolento i coefficienti sono diversi.

Il coefficiente di permeabilità idraulica vale secondo n (dove n è il numero totale di pori presente sulla

membrana) moltiplicato la superficie geometrica di ogni singolo poro. Quindi moltiplicare il numero di

pori per la superficie di ogni singolo poro significa determinare quanto grande è la superficie complessiva

fornita dai pori al movimento dell’acqua. Confronto questo valore quindi fratto l’area totale di membrana.

Se i pori sono 0 il coefficiente di permeabilità idraulica varrà 0 e quindi l’acqua si muoverà secondo il

coefficiente di permeabilità osmotica.

Quindi il coefficiente di permeabilità idraulica diventerà sempre più importante rispetto al coefficiente di

permeabilità osmotica o perché cambia n o perché i pori hanno sezione maggiore.

I sistemi biologici possono modulare la loro permeabilità all’acqua in relazione o variazioni di n o variazioni

di A con P.

Le acquaporine sono espresse sulla membrana plasmatica, i livelli di acquaporine sono sotto il controllo di

espressione genica.

R2 è la sezione del poro elevata al quadrato / 8 eta (viscosità dell’acqua) Dx spessore dell’interfaccia

coinvolta.

Così come è modulabile n cioè come può variare il numero di pori per unità di superfice così possiamo

renderci conto di pori di natura diversa i quali in

relazione al raggio r definiscono coefficienti di

permeabilità idraulica di valori diversi.

Possiamo osservare un epitelio dotato di microvilli. Attraverso le acquaporine presenti nei microvilli, si genera

un flusso di acqua per via transcellulare cioè l’acqua entra dalla membrana apicale e lascia la cellula dal lato

serosale/vasolaterale.

Oltre questi pori dovuti ad acquaporine sono presenti anche pori associati a giunzioni comunicanti. Questi

pori di fatto non sono pori di membrana ma pori giunzionali che rappresentano una via di permeazione

all’acqua per via paracellulare.

Pori di dimensioni maggiore li osserviamo nei capillari fenestrati dove le fenestrature sono pori dell’ordine di

500 fino a 1000 A° e si formano tra cellule endoteliali vicine.

Prendendo in considerazione il sistema circolatorio consideriamo movimenti di acqua tra il compartimento

all’interno dell’endotelio che è il sangue e l’esterno che è il liquido extracellulare che bagna le cellule di

ogni tessuto.

I pori di membrana, tipicamente le acqua porine hanno sezioni inferiori a 2 Å (r < 2 Å) selezionano soluti con

pesi molecolari dell’ordine di 100-200 Da.

Viceversa i pori giunzionali hanno sezioni che vanno dai 2 ai 20 Å ( 2 < r < 20 Å ) e selezionano soluti con

pesi molecolari dell’ordine di 350-5000 Da.

! Se prendiamo una molecola come un disaccaride di 300 Da questo soluto sarà un soluto che viene riflesso

dall’acquaporina, viceversa potrebbe non essere riflesso dal poro giunzionale e muoversi attraverso

un’interfaccia fornita da un epitelio.

Quindi i coefficienti di riflessione dei soluti vanno definiti di volta in volta in relazione all’interfaccia che

stiamo guardando → i soluti che sono permeabili per certe interfacce potrebbero non esserlo per altre.

Diamo una definizione diversa di coefficiente di riflessione dal momento che abbiamo introdotto il concetto

di area del poro : pori a sezione molto grande potrebbero permettere il movimento di soluto e quindi in

questo caso i fenomeni osmotici potrebbero essere completamente annullati per effetto di coefficiente di

riflessione pari a 0.

Un soluto la cui sezione geometrica sia piccola rispetto alla sezione del poro è un soluto che permea

• il poro → non mi aspetto nessun fenomeno osmotico. Quindi il soluto ha un coefficiente di

riflessione pari a 0; la pressione osmotica osservata vale 0 mentre quella teorica posso definirla in

base alle concentrazioni di soluto.

Se guardo ad un soluto di dimensioni diverse, ha una sezione coincidente o addirittura superiore a

• quella del poro → mi aspetto un fenomeno osmotico. Il coefficiente di riflessione vale 1 : la pressione

osmotica teorica coinciderà con la pressione osmotica reale.

Definisco il coefficiente di riflessione guardando alle aree geometriche del soluto e del poro :

σ = 1 – (A / A )

us uw

L’area del poro utile (l’area geometrica che è utilizzabile dal soluto per muoversi attraverso il poro) per il

passaggio del soluto / l’area utile (l’area geometrica del poro utilizzabile per il movimento di acqua) al

passaggio dell’acqua.

Supponiamo che il soluto abbia dimensioni molecolari vicine a quelle dell’acqua : l’area utile del poro nei

confronti del movimento dell’acqua e l’area utile del poro nei confronti del movimento del soluto sarà uguale

e quel rapporto varrà 1 e il coefficiente di riflessione varrà 0. L’area utile del poro nei confronti del

movimento del soluto varrà 0, mentre l’area utile del poro per il movimento dell’acqua avrà un valore diverso

da 0 → il rapporto vale 0, 1-0 = 1 quindi il coefficiente di riflessione di questo soluto vale 1.

σ = 1 – (A / A )

Questa definizione fa quindi riferimento al tipo di soluto che ho a disposizione e al

us uw

tipo di poro che ho a disposizione.

Il movimento di

elettroliti possono

dipendere

dall’interazione con

soluti.

Si trovano associate ai doppi strati lipidici delle cellule delle strutture proteiche, acquaporine , che mediano

anche movimenti di ioni.

Altre strutture proteiche sono canali ionici, proteine che permettono il movimento nel doppio strato lipidico

dello ione legato all’interno del poro di permeazione.

Canali ionici possono avere strutture diverse : rappresentazioni assiali di canali ionici di natura diversa formati

da 4, 5, 6 subunità man mano che aumenta il numero di subunità aumenta il diametro della sezione

geometrica che diventa sempre maggiore.

Rapporti di scambio di soluti tra le cellule si possono realizzare tipicamente attraverso strutture come i

connessoni che mettono in collegamento i citoplasmi di due cellule adiacenti.

Sono formati da 6 subunità espressi sulla membrana della cellula, che interagiscono con le 6 subunità

disposte sulla membrana della cellula adiacente → c’è quindi una continuità di solvente.

Per quanto riguarda il poro giunzionale si genera per interazione di proteine ed è utile per movimento di

acqua e per soluti che hanno coefficiente di riflessione pari a 0 .

Influenza della componente idrostatica ed osmotica nei flussi d’acqua a livello

capillare

I capillari sono semplici strutture caratterizzate da un’unica cellula piatta che

si struttura a formare una superficie cilindrica.

Queste strutture presentano pori a sezione maggiore, che prendono il nome

di fenestrature.

Il mezzo acquoso, il sangue, rappresenta la matrice liquida di un tessuto

connettivo : i tessuti connettivi mettono in connessione strutture diverse.

Essendo il sangue un tessuto connettivo di tipo acquoso, scorrerà attraverso

un sistema di vasi.

Il sangue connette regioni della superficie corporea specializzate

all’assorbimento (per esempio l’epitelio polmonare o intestinale) con le

regioni dove le sostanze assorbite vengono poi utilizzate ed eliminate le

sostanze di rifiuto.

Questo tessuto connettivo funziona perché è in grado di scambiare in

maniera efficiente soluti (quelli che sostentano il metabolismo cellulare).

Questi soluti si devono muovere attraverso scale dimensionali che sono

dell’ordine dei micron quindi con tempi associati ai processi diffusionali

semplici che non sono disastrosamente lunghi.

È possibile osservare una sezione trasversale di capillare perché sono

interessato a vedere se le grandezze coinvolte in questo processo cambiano

rispetto a una certa dimensione, a una certa coordinata geometrica.

Fra il capillare e le cellule del tessuto è compreso lo spazio extracellulare

riempito di liquido extracellulare o liquido interstiziale.

Abbiamo un mezzo acquoso, il liquido extracellulare e un altro mezzo

acquoso il sangue. Sono visibili cellule endoteliali e le separazioni

rappresentano le fenestrature.

Equazione del flusso volumetrico di acqua :

J = Lp (σΔπ + Δp) equazione senza il coefficiente di proporzionalità.

v teor

Lp coefficiente di permeabilità idraulica lo definiamo in condizioni di flusso laminare, se il flusso è turbolento

utilizziamo un coefficiente diverso (coefficiente di filtrazione Kf).

Ci troviamo quindi in una condizione di movimento di acqua attraverso fenestrature quindi con volumi per

unità di tempo per unità di superficie, molto maggiori rispetto a quelli che ci aspetteremmo in base a una

diffusione semplice.

Inoltre le fenestrature hanno anche il vantaggio di mettere in movimento acqua in continuità con acqua

quindi una via paracellulare piuttosto che endocellulare.

Kf è minore di Lp

Influenza della componente idrostatica ed osmotica nei flussi d’acqua a livello capillare

J = K [(P -P ) – σ(π -π )] Il l’ho scritto in relazione alle diverse pressioni idrostatiche che sono in

D

v f c i c i

gioco in questo caso o meglio l’ho riferito ai diversi compartimenti che ci sono: con c ho identificato il valore

di p o di che attiene al capillare mentre con i ho identificato il valore di p o di che attiene al liquido

p p

interstiziale.

Inoltre in quest’equazione ho scritto come positive quelle pressioni che tenderebbero a spostare l’acqua dal

capillare verso il LEC e negative quelle pressioni che per definizione tenderebbero a spostare l’acqua dal LEC

verso il capillare; scritte con il loro segno di fatto le ho combinate vettorialmente, cioè come risultante di

quattro forze due idrostatiche due osmotiche, combinate tra loro con il loro segno. Assumendo come

positiva quella forza che sposta l’acqua dal capillare verso il LEC e negativa quella forza che sposta l’acqua

dal LEC verso il capillare.

La pressione idrostatica del sangue dentro il capillare spinge il sangue da 0 a ed è per questo che il

Dx

sangue fluisce, ma questa pressione idrostatica può spingere l’acqua del sangue dal capillare verso il LEC.

Il LEC può avere una sua pressione idrostatica dovuta al turgore del tessuto, questa pressione idrostatica del

LEC tenderebbe a spostare l’acqua dal LEC verso il capillare.

Per quanto riguarda la pressione osmotica (cioè quella dovuta alla minore concentrazione di acqua) del

sangue tende a spostare l’acqua dal LEC verso il sangue quindi la prendo con segno meno.

La pressione osmotica del liquido interstiziale tenderà a spostare l’acqua dal sangue al LEC quindi avrà segno

+ .

La pressione osmotica del capillare richiama acqua verso il capillare quindi avrà segno meno, la pressione

osmotica del liquido interstiziale richiama acqua dal sangue al LEC quindi avrà segno +.

La componente idrostatica e la componente osmotica sono discordi. Quindi dipenderà dal bilancio che c’è

tra quest’oggetto rispetto a quest’oggetto il fatto che quella combinazione vettoriale abbia un segno

positivo e quindi l’acqua si sposta dal sangue verso il LEC o abbia un segno negativo e quindi l’acqua si

sposterà dal LEC verso il sangue in modo netto. Ho preso quindi in considerazione le forze di ogni possibile

flusso unidirezionale le ho combinate insieme con il loro segno per calcolare il flusso netto Jv (è il flusso

netto dato dalla combinazione di quattro flussi unidirezionali presi con i loro segni).

deve essere fattore moltiplicativo di questa componente osmotica perché abbiamo una soluzione molto

s

eterogenea di soluti e devo vedere classe per soluto per classe per soluto se essi conferiscono o no una

pressione osmotica per un determinato liquido ma lo fanno se quel soluto ha un coefficiente di riflessione

pari a 1 nei confronti della fenestratura. Tutti quei soluti che hanno coefficienti di riflessione pari a 0 sono

inefficaci.

Tra tutti i soluti possibili conosco una classe, le proteine che hanno coefficiente di riflessione pari a 1, questi

sono soluti osmoticamente attivi. Uso il termine pressione oncotica (detta anche colloidosmotica) per definire

la pressione osmotica di un sistema che dipenda soltanto da proteine.

Oltre a predire quali sono i valori di pressione oncotica, in base alla concentrazione di proteine misurate nel

sangue e nel LEC, devo misurare se i valori di pressione sono costanti in o se in cambiano. Se in i

Dx Dx Dx

valori cambiano il bilancio di forze a sua volta cambierà e quindi il Jv a sua volta ugualmente cambierà.

La pressione idrostatica tra 0 e cambia perché il sangue scorre in questa direzione.

Dx

Questa è la combinazione delle forze di Starling → la pressione idrostatica e la pressione osmotica, le due

J = certo coefficiente (σΔπ

pressioni che ritroviamo nella scrittura del flusso volumetrico di acqua v teor

+ Δp) . Quel coefficiente sarà P se abbiamo un doppio strato lipidico o L se consideriamo un poro con

osm p

modalità di flusso laminare o quasi laminare, un coefficiente di filtrazione (K ) nel caso il flusso sia turbolento.

f

Studiamo composizione vettoriale di quelle forze dove ogni componente è definito per la sua intensità, per la

sua direzione e per il suo verso. Per determinare il sistema di riferimento in cui esprimere questi vettori,

riteniamo positive quelle forze che spostano l’acqua dal sangue verso il LEC mentre negative quelle forze che

tendono a spostare l’acqua dal LEC verso il sangue.

Il sangue scorre nel capillare poiché esso connette un arteriola (quel ramo del sistema vascolare più vicino

alla camera ventricolare) con una venula (disposta verso la camera atriale).

Il lavoro cardiaco è strutturato in modo tale che quando il ventricolo si contrae l’atrio è in condizione di

riposo.

Tra inizio e fine capillare esiste una differenza di pressione idrostatica e grazie a questa il sangue ha proprio

quella direzione di flusso.

Questa pressione idrostatica agisce nella direzione di propagazione del sangue ma anche

perpendicolarmente rispetto alla propagazione del sangue. Quindi questa pressione idrostatica tenderebbe a

richiamare acqua verso l’esterno quindi è una pressione che ha segno positivo. Un’altra pressione che ha

segno positivo è quella del liquido interstiziale in quanto in base a questa pressione osmotica l’acqua

tenderebbe a muovesi dal sangue verso il LEC.

Le pressioni negative sono la pressione idrostatica interstiziale che tenderebbe a spostare l’acqua dal LEC

verso il sangue e la pressione osmotica del sangue.

Combinando le due pressioni idrostatiche con le due pressioni osmotiche ottengo e

Dp Dp.

I soluti attraverso la parete del capillare devono essere impermeabili.

In x = 0 la pressione idrostatica P = 37 mmHg la pressione del liquido interstiziale (P ) = 2 mmHg perché il

c i

liquido che costituisce il LEC è compresso dalla presenza delle cellule tutte intorno.

= +37 -2 = + 35 mmHg

DP sangue/LEC

In x = P = 17 mmHg P = 2 mmHg = +17 -2 = + 15 mmHg .

Dx DP

c i sangue/LEC

Cosa troviamo nel sangue ? Elettroliti (potassio e calcio sono in concentrazione di qualche molarità, i più

rappresentati sodio e cloruro sono dell’ordine dei 50 millimolare). Questi soluti sono rappresentati in

concentrazioni significative ma lo sono sia nel sangue che nel LEC → il sodio cloruro ha un per tanto si

s = 0

ripartisce in modo uguale nel sangue e nel LEC ed è pertanto inefficace.

Nel sangue troviamo nutrienti, zuccheri, amminoacidi, questi soluti non sono osmoticamente attivi in quanto

con le fenestrature sono tutti ugualmente ripartiti poiché il loro coefficiente di riflessione vale 0.

Nel sangue troviamo un’altra frazione di soluti, le proteine in particolare quelle che hanno pesi molecolari

sopra i 64 kDa hanno dimensioni così alte per cui non permeano la parete dei capillari attraverso le

fenestrature.

Come ci arrivano le proteine nel LEC ? Potrebbero essere proteine diverse in quanto l’effetto osmotico non

dipende dalla natura del soluto ma dalla sua presenza e dal peso molecolare per cui nel LEC possono essere

presenti proteine che derivano dalla secrezione di cellule, dall’apoptosi, dalla morte cellulare accidentale.

Il sangue è costituito da una varietà molto ampia di proteine le quali dal punto di vista osmotico contano

come soluti. Può essere considerato una soluzione di 7.3 gr% di proteine che conferisce alla soluzione una

pressione osmotica = 19 mmHg, in realtà questo valore va corretto e aumentato a 28 mmHg per un

p c

effetto chiamato Gibbs – Donnan dal nome dei due autori che l’hanno descritto (è un effetto di non

equiripartizione di un soluto diffusibile per effetti elettrostatici).

Nel LEC la concentrazione di proteine è più bassa 1,8 gr% che corrisponde a una pressione osmotica, che

tiene conto dell’effetto Gibbs – Donnan, = 4 mmHg. La componente osmotica (o oncotica perché dipende

p i

solo dalle proteine) vale = 28 – 4 = 24 mmHg → -24 perché è la pressione netta che tenderebbe a

Dp sangue/LEC

spostare l’acqua dal LEC verso il sangue.

In x = 0 trovo una forza netta positiva pari a +35 – 24 = +11 mmHg la risultante è positiva quindi l’acqua si

sposta dal sangue verso il LEC. Man mano che mi sposto verso la pressione idrostatica diminuisce.

Dx

Assumo che la pressione idrostatica diminuisce in modo lineare rispetto a → man mano che mi sposto

Dx

vedo pressioni idrostatiche che diminuiscono in modo proporzionale tanto più mi sposto addirittura posso

immaginare che ci sia un punto nel capillare dove la pressione idrostatica è scesa così tanto da essere uguale

e contraria alla pressione oncotica (la risultante delle forze = 0). superato questo punto di equivalenza la

combinazione di forze inverte il segno → le forze diventeranno negative, la risultante sarà negativa e che

cresce proporzionalmente sempre di più man mano che mi sposto verso perché diventa sempre più

Dx Di

piccola fino al punto in cui la combinazione di forze vale +15 (componente idrostatica) + (-24) che è la

componente oncotica = 9mmHg → l’acqua che è uscita rientra. Questo è un ciclo utile a scambiare sostanze

perché l’acqua che passa dal capillare verso il LEC trascina tutti i soluti che hanno coefficiente di riflessione

pari a 0, l’acqua rientra trascinando con sé tutti quei soluti che hanno coefficiente di riflessione pari a 0 cioè

le sostanze di rifiuto (i cataboliti) che vengono completamente drenate.

La scala dei rapporti dimensionali tra capillare e tessuti è una scala di micron però decine e forse centinaia di

micron. I tempi ai quali si avrebbe la diffusione semplice attraverso J del soluto = P sono tempi che

Dc

potrebbero diventare significativamente alti rispetto al turnover cellulare → per cui questi processi basati su

movimenti di acqua (out e in) sono processi che migliorano l’efficienza degli scambi di soluto. Sono scambi

di soluto che avvengono attraverso una corrente di acqua.

Sembrerebbe come se ogni volta che un volume di sangue passa attraverso il capillare venga ultrafiltrata un

po’ più di acqua di quanta non ne venga riassorbita.

L’eccesso di acqua dai tessuti viene drenato dal sistema linfatico che funziona grazie a un sistema di vasi

linfatici che funzionano fin tanto che sono funzionalmente strutturati in modo corretto. Non necessariamente

questo succede : in certi casi dei parassiti si localizzano all’interno del vaso linfatico (per esempio la filaria);

oppure il sistema linfatico si può danneggiare causando un ristagno di acqua e quindi una condizione di

edema.

Data questa combinazione di forze possiamo pensare che esistano dei vasi o tratti vascolari interessati

esclusivamente da processi ultrafiltrazione ? Un esempio è il glomerulo del Malpighi : il sangue che entra con

nel glomerulo entra con una pressione idrostatica che rimane elevata in tutto il decorso del sangue

all’interno del ciuffo di capillari definito come glomerulo del Malpighi la combinazione di forze rimane

sempre positiva.

Un altro esempio di capillare associato al processo di riassorbimento è il villo intestinale oppure il circuito

capillare attorno agli alveoli polmonari. L’alveolo polmonare ha una sua forma perché è rivestito di un velo di

liquido nel quale è disciolto il surfattante che favorisce lo scambio di gas : è in funzione dello spessore di

questo velo di liquido che avvengono delle scale dimensionali diverse per quanto riguarda i processi diffusivi

di ossigeno che dall’area alveolare passa in soluzione e dalla soluzione attraversa la parete dell’alveolo, entra

nel LEC, entra nel capillare dove si lega all’emoglobina e viene trasferito nel circolo sanguigno.

Ci troviamo su scale dimensionali dell’ordine dei micron, compatibilmente alla presenza di surfattante e di

mantenere una saturazione di vapore acqueo dell’area alveolare per impedire la disidratazione.

Il circuito capillare è un circuito a basse pressioni di esercizio : le pressioni idrostatiche nel circolo sanguigno

sono basse.

Per quanto riguarda il nefrone, quindi da 180 litri di filtrato se ne riassorbono 178 circa nelle 24h grazie a

processi di trasferimento di acqua che sono in parte basati anche su una caduta di pressione idrostatica del

sistema vascolare a valle della capsula di Bowmann.

Nei vasi a valle del glomerulo del Malpighi tutto intorno all’ansa di Henle nel dotto collettore la pressione

idrostatica diminuisce, cos’è quindi che permette il riassorbimento di acqua ? Dobbiamo considerare un

valore aggiuntivo cioè la costruzione di un gradiente osmotico dovuto al selettivo trasferimento, attraverso

delle interfacce, di sostanze osmoticamente attive come gli elettroliti.

J = L (Dp + sDp)

Al flusso di acqua sarà coniugato un flusso di soluto per “effetto trascinamento” che

w p J = Pdc + J (1-s) <c >

descrivo secondo la formula s w s

J è il flusso del soluto che si potrebbe muovere per una differenza di concentrazione infatti compare il

s

termine permeabilità quindi di fatto questa è l’equazione della permeabilità diffusionale semplice. In più se

c’è un flusso d’acqua questo è utile a trascinare un soluto a concentrazione media (cs) e che abbia coefficienti

di riflessione pari a 0. Come faccio in modo che questo flusso diventi non importante se i coefficienti di

riflessione non sono 0 ? se il coefficiente di riflessione vale 0 il flusso di acqua ha il suo valore e moltiplica la

concentrazione media di soluto e questo termine si somma al termine dipendente dalla semplice diffusione.

Se il soluto ha un coefficiente di riflessione pari a 1 …

Se la differenza di concentrazione sarebbe tale da portare quel soluto in una certa direzione ma se il flusso di

acqua si oppone il soluto passa nella direzione opposta.

Se consideriamo globalmente i processi di trasferimento di soluto l’equazione di Fick integrata dà sempre

l’equazione della permeabilità diffusionale sempre ma a questa si somma l’effetto dovuto al trascinamento di

acqua che si annulla per quelle sostanze che hanno coefficiente di riflessione pari a 1, trascinamento in

corrente di acqua per quelle sostanze che hanno coefficiente di riflessione pari 0 .

Questo flusso di acqua lo moltiplico per una concentrazione media di soluto proprio per mantenere la

grandezza di concentrazione. Questo si chiama flusso di soluto in corrente di solvente.

MECCANISMO DELL’ULTRAFILTRAZIONE

P indica la pressione idrostatica del sangue glomerulare (sangue che

glom

entra). Il pedice caps definisce il liquido capsulare.

55 sono i millimetri di mercurio, tenendo conto dell’effetto Donnan, del

sangue che si impegna nel glomerulo del Malpighi. La pressione

idrostatica scende a 15. Ma queste differenze rimangono sempre

positive → + 10 mHg che è detta pressione netta di filtrazione.

Dettagli anatomia ….

L’ultrafiltrato muovendosi lungo il nefrone subisce diversi processi : per esempio riassorbimento isosmotico,

processi di modulazione di concentrazione di soluti e secrezioni (composizione diversa rispetto

all’ultrafiltrato d’origine).

Esistono altri distretti dove flussi massivi di acqua sono associati al trasferimento di soluti i quali permeano

un interfaccia attraverso processi particolari.

Non si parla più di interfacce, dove le fenestrature hanno sezioni così elevate da permettere il passaggio di

una grande varietà di soluti (ad eccezione delle proteine con pesi molecolari sopra i 64 kDa).

Consideriamo interfacce i cui pori sono tali da rappresentare una barriera piuttosto che una via selettiva di

permeazione.

Consideriamo i movimenti di soluti associati a flussi un po’ lenti intrinseci delle membrane plasmatiche delle

singole cellule o degli epiteli.

Vediamo movimenti di anaelettroliti ed elettroliti.

Di anaelettroliti avevamo già parlato considerando i flussi diffusionali semplici attraverso l’integrazione

dell’equazione di Fick che ha permesso di ricavare la legge generale della permeabilità secondo la quale il

flusso è direttamente proporzionale alla differenza di concentrazione.

Il tutto era partito da una definizione termodinamica tale per cui il sistema aumenta di entropia nella misura

in cui un soluto si ripartisce in tutto il volume di solvente a disposizione (andavano però considerati gli

ostacoli che potevano essere causati dall’interfaccia).

Quanto un elevato coefficiente di ripartizione (che rientrava nella definizione di energia libera di

Gibbs) è alto, tanto più rende lenta una reazione di trasferimento.

Trasporti attraverso le membrane: Diffusione facilitata o trasporto mediato da carrier

La diffusione facilitata è un trasporto mediato passivo che consente alle cellule di tutti i tessuti di attingere

le molecole necessarie alla loro sopravvivenza dal mezzo extracellulare e di riversarvi i loro metaboliti.

Tutte queste molecole sono perciò trasportate nella direzione del loro gradiente di concentrazione (cioè nella

stessa direzione della loro diffusione libera), sia che questa punti dall’ambiente extracellulare a quello

intracellulare che viceversa.

L’importanza funzionale della diffusione facilitata è cruciale, perché consente il trasporto attraverso la

membrana delle più importanti molecole organiche di interesse vitale che altrimenti non potrebbero

attraversarla con la velocità richiesta.

Si tratta di trasporti che non avvengono per la ripartizione del soluto tra fase acquosa e fase di membrana

ma ripartizione del soluto tra fase acquosa e fase fornita da un trasportatore specifico di membrana associato

al doppio strato lipidico.

Secondo la termodinamica i trasporti vanno nella direzione di far diminuire la concentrazione di soluto ma

dal punto di vista energetico dobbiamo considerare la perdita di interazione con l’acqua e il guadagno di

interazione con un trasportatore specifico.

I trasporti facilitati o mediati da carrier sono definiti così perché è il carrier che media il movimento di soluto

nello spazio di membrana.

Si definiscono diverse proprietà per un trasporto mediato da carrier :

• Un trasporto mediato da carrier è un trasporto veloce rispetto alla modalità diffusionale semplice.

• Un trasporto mediato da carrier è saturabile.

Se riportiamo in un grafico la velocità di trasporto del soluto (per esempio glucosio) in relazione alla

concentrazione esterna di glucosio (alla cellula per esempio) → all’aumentare della concentrazione di

glucosio la velocità aumenta tendendo ad un valore asintotico secondo un andamento iperbolico.

Questa velocità di trasporto del glucosio la misuriamo in moli di glucosio per unità di tempo per unità di

superficie (la concentrazione di glucosio in questo grafico è milli molare).

Riportando in grafico la velocità di trasferimento contro la concentrazione, nel caso di un processo

diffusionale semplice e nel caso di una diffusione facilitata : a parità di concentrazione di glucosio esterna il

flusso che si avrebbe per diffusione semplice ha una velocità minore di quello a diffusione facilitata.

Il flusso diffusionale delle particelle nella componente lipidica della membrana plasmatica può essere

descritto dall’equazione di Fick : F = P (C -C ) . Si noti che si tratta dell’equazione di una retta

i i 1 2

(proporzionalità diretta) e che P (coefficiente di permeabilità) è il suo coefficiente angolare; ne viene che, al

i

crescere del gradiente di concentrazione di una sostanza che si muove nella membrana per diffusione libera,

la velocità di transito aumenta linearmente senza presentare saturazione.

Nel caso di un processo diffusionale facilitato non posso definire un coefficiente di permeabilità : ma

costruire un’equazione che abbia la forma di un iperbole.

La direzione verso cui avviene la trasformazione è indicata dalla termodinamica : C (maggiore) → C ; tra C e

i f i

C c’è DG*.

f

Il trasporto facilitato è veloce perché il soluto perde interazione con l’acqua e guadagna interazione con i

gruppi amminoacidici del trasportatore (→ non si ha una destabilizzazione dal punto di vista energetico).

Interazione specifica tra soluto e trasportatore. Pensare ad un trasportatore come una molecola

• proteica che lega specificatamente il soluto da trasportare (che possiede gruppi amminoacidici che

interagiscono con gruppi carichi del soluto) spiega il concetto della specificità : viene riconosciuto

l’isomero D rispetto all’isomero L .

La velocità con cui vengono trasportati i due stereoisomeri è molto diversa perché in relazione alla

stereospecificità, in relazione alla serie enantiomerica del soluto si ha una maggiore probabilità di

interazione di questo soluto con il trasportatore.

ESEMPIO se prendiamo una membrana dove è espresso il trasportatore del glucosio osserviamo che

il flusso del glucosio è 10 mila volte maggiore del flusso che otterremmo con la stessa differenza di

concentrazione interna ed esterna con un isomero del glucosio (→ il mannosio). Glucosio e

mannosio hanno lo stesso peso molecolare ma sono due isomeri.

! In un processo diffusionale semplice non ci aspetteremmo una differenza del coefficiente di

permeabilità in base all’isomeria.

Anche stereospecificità : la stereoisomeria ci dà un differente flusso: per esempio il flusso del D-

glucosio (enantiomero che appartiene alla serie D : destrogira) è più alto dell’L-glucosio.

Lo stereoisomero naturale è il D quindi basta che la configurazione spaziale dei gruppi ossidrilici sia

diversa a far calare il flusso di mille volte.

Nessuna di queste specificità sarebbe riconducibile a degli effetti legati al coefficiente di ripartizione,

ma sono spiegabili in termini di posizione di equilibrio chimico tra soluto e trasportatore.

Inibizione I carriers come gli enzimi possono essere soggetti ad inibizione competitiva : inibizione

• vuol dire che in presenza di un inibitore il trasporto viene influenzato.

Per esempio il caso del trasportatore outside in conformazione flip che dà un equilibrio chimico con

il substrato, in presenza di inibitore ci sarà una competizione del legame tra il substrato naturale e

l’inibitore perché adesso la variazione conformazionale da flip verso flop servirà a portare dentro la

cellula l’inibitore piuttosto che il soluto.

L’inibitore è una sostanza che si lega nello stesso sito attivo del substrato naturale e compete per il

legame con il substrato naturale.

Ricordiamo che Km (costante di dissociazione) è quel valore di concentrazione del substrato al quale

il flusso è la metà di quello massimo. Km è inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il

substrato.

Quindi Km in presenza di inibitore diventa più alta. Le Vmax (Jmax) restano uguali (come negli

enzimi).

Due sono le grandezze caratteristiche di questo trasporto.

1. Il flusso massimo cioè il valore asintotico al quale l’iperbole, che descrive il flusso in funzione della

concentrazione di soluto, tende.

Cioè quando la concentrazione di soluto viene fatta crescere all’infinito e la velocità raggiunge la velocità

max e all’aumentare ancora della concentrazione di soluto non si ha un aumento di velocità.

2. Una grandezza che ha le dimensioni di una concentrazione : la costante di Michaelis o costante di

dissociazione (Km)del flusso. Questa rappresenta la concentrazione di substrato che deve essere usata per

avere metà del flusso massimo.

Flusso massimo e Km definiscono quanto la curva sia ripida o piatta.

È un flusso che riguarda soluti idrofilici a P.M. relativamente elevato.

Dal punto di vista termodinamico è passivo (perché avviene spontaneamente) ed equilibrante cioè tende a

generare una condizione di equilibrio quando la concentrazione all’interno e all’esterno della cellula o dal

lato serosale e muscosale è diventata uguale. In quel caso il flusso si annulla perché i due flussi unidirezionali

sono tra loro uguali e contrari di direzione.

All’equilibrio il soluto continua a muoversi da 1 verso 2 e da 2 verso 1 questi due flussi sono unidirezionali

uguali.

La saturabilità, la specificità, l’inibizione e la velocità sono proprietà. La descrizione del meccanismo di

reazione deve essere compatibile con tali proprietà.

La molecola di trasportatore è inserita come proteina integrale di membrana nel doppio strato lipidico.

I sistemi di trasporto esistono generalmente in due stati conformazionali (E1 e E2, o “flip e flop”), uno con i

siti leganti rivolti all’esterno della cellula e l’altro con i siti leganti rivolti all’interno.

Il sito legante non è mai accessibile simultaneamente da ambo i lati.

La variazione conformazionale diviene quindi il “rate limiting step”.

La conformazione flip del trasportatore è detta così perchè ha il sito di legame per il substrato accessibile dal

lato esterno : il substrato si può legare dal lato extracellulare.

La conformazione flop ha al contrario il sito di legame per il substrato accessibile dal lato intracellulare : il

substrato si lega dal lato intracellulare.

Cos’è che definisce il passaggio conformazionale da flip a flop e da flop a flip ? l a dinamica molecolare.

• P trasportatore accessibile da outside

O

• P trasportatore accessibile da inside

I

La variazione conformazionale dipende dalla dinamica molecolare e avviene sia che sia legato il substrato sia

che non lo sia.

Quale sarà la discriminante che dirà che il trasportatore è vuoto o carico di soluto ? la concentrazione di

soluto perché il rapporto di interazione tra trasportatore e soluto è in equilibrio chimico che dipende dalla

concentrazione dei reagenti. Se abbiamo una certa concentrazione di soluto l’equilibrio sarà spostata verso

destra quanto più alta sarà la concentrazione di soluto.

Per quelle molecole che hanno il soluto legato, la variazione da flip a flop sarà utile a trasferire il soluto nel

doppio strato lipidico portandolo in una condizione dove esso interagisce con un sito di interazione

accessibile dal lato intracellulare.

La variazione da flip a flop con il substrato legato è competente a portare il substrato, sempre legato al

trasportatore, in una condizione dove lo scambio può avvenire dal lato intracellulare mentre prima avveniva

dal lato extracellulare.

L’equilibrio chimico riguarda sia il trasportatore legato con il soluto sia il trasportatore libero ma la

posizione di questo equilibrio dipenderà dalla concentrazione del soluto inside.

Siccome inside la concentrazione è inferiore avremo più probabilità di rilascio del soluto (la forma legata sarà

inferiore rispetto alla forma libera) perché il soluto si dissocia.

Immaginiamo che la regione dove la concentrazione di soluto è più alta sia la regione intracellulare più

prossima a quella extracellulare : facciamo lo stesso ragionamento per spiegare che il soluto invece da

andare da fuori verso dentro andrà da fuori verso dentro. La direzione del flusso dipende sempre dalla

differenza di concentrazione, il flusso tenderà ad andare nella direzione delle concentrazioni di soluto

decrescenti.

Quando la concentrazione interna ed esterna di soluto sono uguali ci sarà un equilibrio tale per cui quanto

soluto entra tanto soluto esce.

Questo meccanismo è compatibile con la proprietà che riguarda il fatto che il flusso è passivo → perché

avviene sempre nella direzione di concentrazioni decrescenti.

Importante la specificità → se metto glucosio o mannosio ho dei flussi diversi 10 mila volte.

Questo meccanismo è compatibile con la specificità del trasporto? SI perché il sito di legame riconosce solo

un soluto o pochi soluti.

È compatibile con il fatto che sia un trasporto passivo? Si.

È compatibile con il fatto che sia un trasporto equilibrante? Si.

È compatibile con il fatto che sia un trasporto saturabile ? Si perché se la concentrazione di soluto è così

elevata da spostare l’intero equilibrio verso destra, aumentando di più la concentrazione di soluto la velocità

non aumenterebbe perché il trasportatore è tutto saturo, è tutto spostato verso destra (spiegata la

saturabilità).

Esiste un equilibrio tra soluto e trasportatore nella conformazione flip, tra soluto e trasportatore nella

conformazione flop, equilibrio filp flop con trasportare legato, equilibrio flip flop con trasportatore libero.

Di questi quattro step, il fattore limitante è la variazione conformazionale : cioè in presenza di soluto la

velocità con cui il soluto si lega è molto maggiore della velocità con cui il trasportatore passa da flip a flop.

Quindi lo step che è limitante della velocità dell’intero trasporto è la variazione conformazionale (da flip a

flop).

Jmax dipende dalle condizioni in cui il sistema si trova. È un valore asintotico che viene raggiunto quando gli

equilibri tra trasportatore libero e trasportatore legato sono spostati completamente verso il trasportatore

legato in relazione all’elevata concentrazione di substrato e Km.

Cosa può aumentare il flusso massimo? Quantità di trasportatore.

Abbiamo un sistema che agisce in base alla presenza di n molecole di trasportatore per unità di superficie di

membrana.

Se il sistema è inducibile quel numero di molecole di trasportatore per unità di superficie di membrana

tenderà ad aumentare e questo farà si che il flusso massimo cresca proporzionalmente e Km non cambierà.

Quindi il flusso max è proporzionale alla concentrazione del trasportatore totale.

La concentrazione totale di trasportatore dipenderà dai valori di espressione genica che dipenderanno dal

turnover di queste proteine (→ dalla neosintesi di trasportatore e dall’equilibrio dinamico).

Quando si stimola un processo di trascrizione che porti a una iperregolazione di una certa proteina, questo

processo prende luogo in una scala temporale di ore.

Gli effetti legati a segnali chimici sono molto veloci sulla scala temporale dei secondi o dei minuti.

L’effetto è molto veloce perché le proteine di membrana, tipicamente i trasportatori, sono legati a un equilibrio

di posizione.

Equazione generale del trasporto facilitato

Flusso da 1 → 2 J = J S /(K +S )

• 1-2 max 1 m 1

Flusso da 2→ 1 J = J S /(K +S )

• 2-1 max 2 m 2

Equazione generale del flusso netto (è la combinazione dei due flussi unidirezionali che avvengono

ciascuno in direzione opposta rispetto all’altro : flusso unidirezionale 1 → 2 sottratto al flusso 2→1)

J= J [S /(K +S ) - S /(K +S )]

max 1 m 1 2 m 2

La velocità la spieghiamo in base all’energia libera di Gibbs perché il soluto è stabilizzato da interazioni non

covalenti. Diffusione facilitata del glucosio

La proteina responsabile del trasporto transmembranario del glucosio, nota come glucosio permeasi è

ubiquitaria. È il sistema di trasporto facilitato più conosciuto : ne sono state isolate molte isoforme, ciascuna

espressa specificamente in ogni tipo cellulare.

La GLUT1 (Glucose Transporter-1) espressa nella membrana dei globuli rossi, è stata la prima glucosio

permeasi oggetto di studio, principalmente per la facilità con cui le cellule da cui estrarre e purificare questa

proteina possono essere isolate in grande quantità.

La GLUT1 è composta da 12 segmenti idrofobici transmembranari disposti in cerchio; l’ansa che congiunge i

segmenti 1 e 2 è glicosilata ed è rivolta al lato extracellulare della membrana, mentre quella che congiunge i

segmenti 6 e 7 è molto ampia ed è rivolta al lato citoplasmatico.

Isoforme che sono anche tessuto specifiche

• GLUT1 quello cristallizzato risolto ai raggi X, è ubiquitario, lo troviamo in tutte le cellule; e costitutivo

cioè la sua espressione è costante.

Km 5 mM se guardiamo il glucosio, 5 M se guardiamo il fruttosio (la concentrazione di fruttosio che

dà metà del flusso massimo è 5 molare mentre la concentrazione di glucosio che dà metà del flusso

massimo è 5 millimolare).

• GLUT2 è un pochino meno specifico in quanto le Km variano di 10 volte tra glucosio e fruttosio

(quindi è meno specifico) ed è legato a tessuti come fegato, epiteli assorbenti (intestino e rene) e

pancreas.

• GLUT3 ha una attività (Km = 1,8 mM) ridottissima ed è una forma neuronale cioè espressa dalle

cellule nervose.

• GLUT4 ha Km = 4,6 mM quindi è come Glut1 : non è costitutivo ma inducibile è l’enzima il cui livello

dipende dalla presenza di substrato.

L’insulina è quell’ormone che serve ad assorbire il glucosio nelle cellule per convertirlo in glicogeno oppure

in grassi. Per esempio nel tessuto adiposo l’insulina favorisce la formazione dei trigliceridi.

L’espressione o meglio l’effetto di assorbimento di glucosio, dipendente dall’insulina, è legato al fatto che

in presenza di insulina aumenta il livello di espressione di GLUT4 quindi il flusso massimo in presenza di

regolazione positiva tenderà essere più alto : il sistema si satura.

Questo è il meccanismo per massimizzare l’effetto di assorbimento del glucosio.

Alla domanda se possono passare altre molecole è vero ma utilizzando altre isoforme.

Per quanto riguarda la differenza di affinità si tratta di una proprietà selezionata positivamente.

Riporto nello stesso grafico, utilizzando dei flussi arbitrari (normalizzati su 100%), l’andamento dei flussi che

avremmo per i trasportatori GLUT2 o GLUT3.

GLUT2 è quello di fegato epiteli assorbenti e pancreas; GLUT3 è quello neuronale.

È vantaggioso o svantaggioso per un neurone che deve continuamente consumare energia per generare

segnali elettrici, presentare un trasportatore saturo o non saturo in condizioni normali di glicemia ?

Se il trasportatore neuronale è saturo a condizioni glicemiche normali è vantaggioso.

Se il trasportatore del glucosio nel pancreas non è saturo.

Quindi non necessariamente la saturazione è una condizione vantaggiosa : la saturazione è svantaggiosa per

quelle cellule che devono segnalare la concentrazione di glucosio ; la saturazione è vantaggiosa per le cellule

che devono utilizzare il glucosio per il loro metabolismo energetico.

La variazione indicata in rosa è una variazione di glicemia in ambito fisiologico : nelle 24 h abbiamo effetti di

glicemie che possono aumentare o diminuire in modo transitorio a seconda che siamo vicini o lontani dal

pasto.

Si noti che, rispetto alle ipotetiche variazioni della glicemia (ambito rosa), la velocità di trasporto è

praticamente saturata nelle cellule neuronali (GLUT3), mentre subisce variazioni significative nelle cellule b

(GLUT2)

Km più piccole vogliono dire un sistema che si satura subito mentre Km più grandi vogliono dire un sistema che

si satura a concentrazioni maggiori. Quindi la Km è inversamente legata all’affinità.

Uniporti e cotrasporti

Il trasporto transmembranario di particelle di un solo tipo è denominato uniporto (quindi trasportatori di

membrana che legano un solo tipo di soluto e lo trasportano); questo è più raro del trasporto accoppiato (o

cotrasporto), in cui la proteina trasportatrice è capace di trasferire contemporaneamente molecole di specie

diverse.

Esistono due tipi fondamentali di trasporto accoppiato : il simporto in cui le diverse particelle sono

trasportate nello stesso senso, ed il controtrasporto (o antiporto) in cui le diverse particelle sono trasportate

in senso opposto.

Partiamo da un’osservazione sperimentale : questa tabella riporta le concentrazioni degli ioni sodio e

potassio in diversi ambienti: nel siero (sangue → presenza di elettroliti che non conferiscono nessuna

pressione osmotica netta in quanto sono perfettamente permeabili attraverso le fenestrature a meno

dell’effetto Donnan); nel LEC, oppure dentro il citoplasma di una cellula.

Vengono presi in considerazione tre tipi cellulari diversi : miocita (cellula muscolare scheletrica), l’assone

(parte di un neurone) e l’eritrocita (cellula caratteristica del sangue).

La concentrazione di sodio e potassio nel siero non è la stessa.

Il liquido interstiziale è il liquido nel quale si confrontano le cellule. L’osservazione immediata è che quelle

concentrazioni non sono le stesse per quanto riguarda interno ed esterno della cellula : lo ione sodio è quello

più abbondante nel LEC rispetto a quanto lo sia nel citoplasma, nel caso di tutti e tre i tipici cellulari.

Per quanto riguarda lo ione potassio la sua concentrazione è più bassa nel LEC di quando lo sia nel

citoplasma e lo vediamo in tutti e tre i tipici cellulari.

Siero e LEC sono alle stesse concentrazioni quindi dal punto di vista del rapporto di scambio tra il siero e il

LEC quegli ioni sono equiripartiti.

Queste differenze di concentrazione (LEC-citoplasma) non fotografano una situazione di equilibrio perché mi

aspetto sempre che il sodio si sposti dal LEC al citoplasma (differenza di potenziale chimico) e il potassio si

sposti dal citoplasma verso il LEC (differenza di potenziale chimico).

Perché quelle due soluzioni non sono uguali? La prima risposta è che al contrario delle fenestrature che

abbiamo nell’endotelio, le caratteristiche dell’altra interfaccia quella tra LEC e citoplasma siano diverse, siano

più peculiari.

Questa situazione è dipendente dall’attività di un tipo particolare di proteina : Na /K -ATPAasi cioè la

+ +

pompa del sodio e del potassio. La Na /K -ATPasi mantiene i gradienti di Na e K tra l’ambiente intra ed

+ + + +

extra-cellulare.

In questo caso si osserva il trasferimento di ioni sodio e potassio nella direzione di potenziali elettrochimici

crescenti : non è un processo passivo.

In generale i trasporti attivi avvengono nella direzione di potenziali elettrochimici crescenti : è positivo.

DG

Questo processo è attivo quindi per avvenire richiede l’accoppiamento con una reazione esoergonica.

La reazione esoergonica classica in questi processi è l’idrolisi di ATP.

Sono processi altamente selettivi, possono essere elettrogenici.

Sono disequilibranti ma possono portare ad uno stato stazionario.

(Esempio di domanda d’esame : In che cosa il meccanismo di azione di una pompa differisce da un

trasportatore semplice? )

Le Pompe rappresentano il sito di accoppiamento fra la reazione endo ed esoergonica.

L’accoppiamento può avvenire in due modi diversi :

• TRASPORTI ATTIVI PRIMARI : è la pompa stessa che è sede di idrolisi di ATP e traslocazione del

soluto.

• TRASPORTI ATTIVI SECONDARI : altri trasportatori agiscono in sinergia con la pompa nel realizzare

il trasporto.

- Selettività

- Inibizione da agenti specifici

- Inibizione da veleni metabolici + +

Pompa Na /K -ATPAasi

E’ certamente la pompa ionica più diffusa e più studiata.

È una pompa che trasporta sodio e potassio in due direzioni diverse (antiporto).

È una proteina ubiquitaria costituita da almeno due subunità (alfa e beta) : le subunità alfa hanno siti di

legame per ATP.

È una proteina chiamata “housekeeper” perché associata a grande varietà di funzioni della cellula e quindi

fondamentale. In particolare è coinvolta nei mantenimenti di potenziale elettrico tra faccia esterna e faccia

interna di una membrana, associata al mantenimento del potenziale elettrochimico necessario per il

mantenimento/svolgimento dei trasporti attivi secondari, e per il mantenimento di uno stato stazionario

osmotico.

Questa pompa realizza la traslocazione di 3 ioni sodio che vengono legati dal lato intracellulare e trasferiti al

lato extracellulare in antiporto/in scambio con 2 ioni potassio che vengono traslocati dal lato extracellulare al

lato intracellulare (→ 3 ioni sodio , 2 potassio contro una molecola di ATP idrolizzato).

PARTICOLARITA’ : viene traslocato un catione in più sul lato extracellulare di quanto non sia importato (ione

in più che si muove nella direzione del sodio).

Questa pompa porta all’esterno una quantità di carica positiva dello ione in più e per questo detta pompa

elettrogenica.

Quindi si genera un antiporto sodio-potassio ed è un processo endoergonico se guardato dal punto di vista

termodinamico.

Il valore del potenziale elettrochimico del sodio iniziale lo calcolo usando l’equazione del potenziale

elettrochimico, quindi lo stato finale è quello a cui corrisponde l’energia libera di Gibbs maggiore.

L’ATP viene convertito in ADP e pirofosfato → liberazione di una certa quantità di calore.

L’accoppiamento è perfetto quando positivi e negativi sono tra loro uguali.

DG

Na /K -ATPAasi : modello di funzionamento

+ +

Il funzionamento della pompa può essere schematizzato secondo un modello basato sull’acquisizione

sequenziale di modificazioni conformazionali, ciascuna delle quali è conseguenza della precedente e causa

della successiva.

Queste modificazioni, indotte da una serie di fosforilazioni e defosforilazioni. La pompa si apre in modo

alterno verso l’interno e verso l’esterno per poi tornare alla configurazione iniziale, pronta per eseguire un

nuovo ciclo di funzionamento.

Durante ciascun ciclo, la pompa estrude dall’interno della cellula 3 ioni Na+ e vi fa entrare 2 ioni K+,

ricavando l’energia per entrambi i trasporti contro-gradiente, attraverso la degradazione di una molecola di

ATP in ADP.

La pompa sodio potassio ha due stati conformazionali: E1 e E2.

E1 ha un sito di legame ad alta affinità per Na rivolto verso l'interno mentre E2, legato a P, ha un sito di

+

legame ad alta affinità per il K rivolto verso l'esterno.

+

1. La pompa in conformazione E1 lega 3 ioni sodio (i siti di coordinazione dei tre ioni sodio sono siti

diversi dai siti di coordinazione dei due ioni potassio).

Dal lato intracellulare la concentrazione di potassio è più alta della concentrazione intracellulare di

sodio. La conformazione E1 lega tre ioni sodio, ioni rappresentati alla concentrazione più bassa,

mentre non lega gli ioni potassio nonostante siano gli ioni a concentrazione maggiore.

Questo cosa fa pensare in termini di affinità della pompa in conformazione E1 per quanto riguarda

gli ioni sodio e potassio ? L’affinità della pompa per gli ioni sodio è maggiore dell’affinità della

pompa per gli ioni potassio nella conformazione E1.

L’equilibrio per il sodio è molto spostato a destra verso la forma coordinata di sodio; l’equilibrio per

il legame per il potassio è molto più spostato a sinistra (la pompa quindi non lega potassio).

2. La pompa lega uno ione magnesio e un ATP (lo ione magnesio non è coinvolt o nel processo di

trasporto ma nella reazione di fosforilazione).

Quindi si è formato un complesso ternario : pompa in conformazione E1 che ha coordinato una

molecola di ATP e 3 ioni sodio.

3. Questo intermedio di reazione è fosforilato : subisce una reazione di fosforilazione dovuta anche al

magnesio tale per cui si forma la conformazione E1 fosforilata.

Questo è un fatto nuovo in quanto la pompa è sito di fosforilazione a carico di ATP.

Si forma quest’intermedio che prende il nome di intermedio ad alta energia perché l’energia di

legame del gruppo fosfato è stata ceduta dall’ATP alla pompa.

Si forma un intermedio dove il gruppo fosfato è stato ceduto ad un acido aspartico.

Quell’aspartil-fosfato è stabile in conformazione E1 ma la conformazione più stabile per questo stato

è la conformazione E2.

4. Quindi il passaggio da E1 a E2 è un passaggio spontaneo che dipende dalla instabilità della

conformazione E1 quando è fosforilata verso la stabilità della conformazione E2.

La pompa si “apre” verso il lato extracellulare, l’affinità per gli ioni sodio diminuisce e vengono

rilasciati all’esterno. Siamo nella conformazione E2.

Che caratteristiche ha la conformazione E2? Per quanto riguarda dove sono rivolti i siti di legame per

gli ioni, sono rivolti outside. Ma nella conformazione E2 i rapporti di affinità sono opposti rispetto a

quelli precedenti : la conformazione E2 ha un’affinità molto bassa per il sodio ma ha un’affinità molto

alta per il potassio. Questa pompa permette l’associazione del sodio verso un ambiente dove la

concentrazione di sodio è maggiore rispetto all’ambiente di partenza (siamo nell’ambiente outside) e

permette la coordinazione del potassio nonostante la sua concentrazione in quest’ambiente sia più

bassa.

5. La pompa (E2—P) lega due ioni potassio presenti all'esterno della cellula, formando l'intermedio E —

2

P·2K .

+

Il legame tra il gruppo carbossilico dell’acido aspartico fosforilato e il gruppo fosfato stesso con la

pompa legata a due ioni potassio diventa un legame labile.

Quindi si ha l’idrolisi spontanea dell’anidride mista per cui il gruppo carbossilico rimane libero e

viene rilasciato il fosfato : si è completata la reazione di idrolisi di ATP (prima fosforilazione, poi

idrolisi dell’intermedio fosforilato). Quindi la pompa rilascia spontaneamente fosfato, rimanendo in

conformazione E2 con potassio legato.

Questa conformazione defosforilata con il potassio legato è instabile ed evolve spontaneamente

verso la conformazione E1 dove l’affinità del potassio è bassa mentre quella del sodio elevata. Il

potassio si dissocia anche se il sito di legame è rivolto verso l’ambiente dove la concentrazione di

questo ione è maggiore , il sodio si lega anche se il sito di legame è accessibile dal lato dove la

concentrazione di questo ione è minore.

In che cosa il meccanismo di una pompa differisce da un trasportatore semplice ? La variazione

conformazionale non dipende dall’equilibrio spontaneo ma nel caso della pompa dipende dalla

fosforilazione e defosforilazione di questa pompa → è l’idrolisi complessiva di ATP che spinge la variazione

conformazionale in una certa direzione.

Altra caratteristica della pompa rispetto a un trasportatore semplice è che l’affinità per il substrato non è la

stessa per una conformazione e per l’altra ma varia.

Quindi la pompa può catalizzare soltanto il trasferimento di sodio dal liquido intracellulare del citosol verso il

LEC e il trasferimento del potassio dal LEC verso il citosol.

Grazie a queste due caratteristiche la pompa diventa il sito di accoppiamento della reazione endoergonica ed

esoergonica.

Se continuo a portare ioni sodio dal citosol al LEC perché la concentrazione di sodio intracellulare non è 0 ? e

se la pompa continua a portare ioni potassio dal LEC verso il citosol perché nel LEC la concentrazione di

potassio non è 0 ? per la presenza di canali ionici → canali ionici sono responsabili del trasporto selettivo

di ioni secondo potenziali elettrochimici decrescenti.

Conseguenza di questa attività continua della Na /K -ATPAasi è il movimento di concentrazioni di sodio e

+ +

potassio in mezzi extracellulari e in mezzi intracellulari che sono molto diversi tra loro.

Condizione di disequilibrio allo stato stazionario : la quantità di calore che viene liberato dal nostro corpo è

dovuto al non completo accoppiamento tra reazione esoergonica e reazione endoergonica. Quindi la Na /K -

+ +

ATPAasi è indispensabile per mantenere i gradienti di sodio e potassio in ambienti intra ed extracellulare.

2+

Pompa Ca -ATPasi

Altra pompa ATPasi è quella del calcio che funziona in base agli stessi principi della Na /K -ATPAasi solo che

+ +

in questo caso abbiamo una conformazione che lega calcio ad alta affinità accessibile dal lato intracellulare.

Nello stato E1 la pompa ha elevata affinità per gli ioni calcio presenti nel citosol. Quando avviene l’idrolisi

dell’ATP il carrier passa nella conformazione E2 (accessibile al calcio dal lato outside ) e a questo

punto diminuisce l’affinità del calcio che viene rilasciato (nel RE o nell’ambiente extracellulare)

Questa ATPasi del calcio la troviamo con due localizzazioni diverse a cui corrispondono due famiglie di

proteine diverse :

• PMCA (plasma membrane calcium ATPasi) associata alla membrana plasmatica ed espelle all’esterno

della cellula due ioni calcio. Il suo funzionamento è fondamentale per mantenere bassa la

concentrazione di Ca nella cellula.

2+

Nel citosol la concentrazione del calcio in condizioni di riposo è 100 nanomolare (10 M); la

-7

concentrazione di calcio nel LEC è dell’ordine delle millimolarità (10 ). La differenza di concentrazione

-3

vuol dire che nel citosol è più concentrato lo ione calcio di diecimila volte rispetto a quanto non lo sia

nel LEC.

• SERCA (sarcoplasmic endoplasmic reticulum calcium ATPasi) questa pompa uniporta calcio

prelevandolo dal citosol e trasferendolo nel lume del reticolo endoplasmatico liscio o nel lume del

reticolo sarcoplasmatico. Anche questa pompa per ogni molecola di ATP idrolizzata trasferisce 2 Ca .

2+

Quindi a mantenere dell’ordine dei 100 nanomolare la concentraione intercellulare di calcio concorrono tutte

e due le pompe sia quelle che spingono il calcio verso il citosol che quelle che spingono il calcio verso il

reticolo.

Se guardiamo alla totalità delle ATPasi che conosciamo e le vediamo anche in relazione alla specificità della

loro localizzazione, troviamo un quadro abbastanza complesso perché troviamo :

la pompa Na K -ATPasi (→ funzione housekeeping cioè una funzione generale per la fisiologia);

+ +

• la pompa Ca -ATPasi : una localizzata sulla membrana plasmatica (PMCA) e una localizzata sulle

2+

• membrane intracellulari (SERCA);

la pompa H K -ATPasi (pompa protoni potassio) a localizzazione sulla membrana plasmatica

+ +

• associata a particolari epiteli, uno è l’epitelio gastrico (pompa fondamentale per la secrezione di

acido cloridrico da parte dello stomaco) l’altro è l’epitelio renale, quindi associata alla parete del

nefrone ed è coinvolta nel riassorbimento di bicarbonato e infine nel colon distale è associata

all’assorbimento di potassio e alla secrezione di ioni idrogeno;

la pompa V-ATPasi detta così perché è un ATPasi che uniporta ioni idrogeno verso il lume di un

• vacuolo digestivo (lisosoma). Uniportare ioni idrogeno significa rendere il pH acido.

Perché è vantaggioso avere pH acido ? Per impedire la retrodiffusione di una sostanza che se non

protonata può permeare il doppio strato lipidico ma se protonata non può più elettrodiffondere.

La pompa dissipa energia di ATP per mantenere un gradiente di concentrazione, la pompa inversa

invece dissipa un gradiente di concentrazione per sintetizzare ATP (esempio il complesso ff0 dell’ATP

sintasi).

Mantenimento del potenziale elettrochimico a cui sono associati i trasporti attivi

secondari

Per fare questo studio prendiamo in considerazione la pompa protone potassio H K -ATPasi.

+ +

La superficie dello stomaco è tale per cui esistono gli sbocchi di fossette gastriche che sono delimitate da

epitelio.

La parete della fossetta gastrica presenta tre tipi cellulari diversi : cellule mucipare (cellule che producono

muco) ; cellule principali (che secernono in forma inattiva il precursore di un enzima fondamentale per la

digestione delle proteine che viene poi attivato nella sacca dello stomaco attraverso una reazione acida che

converte il pepsinogeno in pepsina quindi l’acidificazione del bolo alimentare è fondamentale per attivare

quest’enzima digestivo); cellule parietali o oxintiche (che hanno a carico la secrezione di acido).

Nella picco della digestione acida il pH del bolo alimentare, che appare come una sospensione acquosa di

materiale non completamente solubile, è estremamente acido (pH 1).

Per capire qual è la concentrazione idrogenionica in alternativa al succo gastrico è guardare al sangue.

Il pH del sangue è dell’ordine di 7,4 (sangue refluo quello che lascia i tessuti).

Se il pH del plasma è 7,4 vuol dire che la concentrazione di ioni idrogeno nel plasma è 10 che tradotto in

-7,4

concentrazione idrogenionica significa [H ] = 0,4 x 10 milli equivalenti per litro (mEq/l).

+, -4

Nel succo gastrico il pH = 1 quindi la concentrazione di ioni idrogeno vale 10 quindi [H ] = 1x10 mEq/l.

-1 +, 2

Ci accorgiamo che nel picco della fase acida della digestione gli ioni idrogeno sono selettivamente pompati

verso il lume dello stomaco per un fattore di due milioni e mezzo di volte (quindi nel succo gastrico

troviamo due milioni e mezzo di volte più ioni idrogeno di quanto ne troviamo nel sangue).

Quel gradiente di concentrazione è di due milioni e mezzo di volte.

Centrale per il mantenimento di questo gradiente di concentrazione è l’attività della pompa H K -ATPasi.

+ +

È una pompa che trasferisce ioni idrogeno da inside la cellula a outside la cellula (nel lume) in scambio con

ioni potassio che da outside vengono trasferiti inside.

Tutto questo costa una molecola di ATP.

Non è un trasporto elettrogenico perché 4 cationi in una direzione contro 4 cationi nella direzione opposta.

È un antiporto elettroneutro.

Questa è la reazione catalizzata dalla H K -ATPasi.

+ +

Ma vista così questa reazione ci spiegherebbe soltanto come mai gli ioni idrogeno dal citoplasma della

cellula vanno nel lume della ghiandola gastrica, non dice nulla riguardo a quale destino il potassio abbia e

non dice nulla sul cloruro.

Se gli ioni idrogeno sono più concentrati nel lume dello stomaco di due milioni e mezzo di volte rispetto al

sangue va anche detto che gli stessi ioni cloruro sono concentrati altrettanto di più nello stomaco di quanto

lo siano nel sangue.

Quindi il trasporto degli ioni idrogeno è un trasporto attivo primario perché avviene attraverso la pompa

che è sede stessa del consumo di ATP mentre il trasporto degli ioni cloruro avviene per trasporto attivo

secondario.

Le cellule epiteliali sono cellule polarizzate funzionalmente cioè il pattern di proteine coinvolte nei fenomeni di

trasporto non è lo stesso se guardiamo la faccia luminale o mucosale della cellula (quella che guarda verso il

lume dell’organo) rispetto alla faccia vasolaterale o serosale (cioè quella che guarda verso il LEC e circolo

sanguigno).

Il sangue è quel compartimento acquoso che collega tutte le parti con un volume dell’organismo.

La prima catenella indica il doppio strato lipidico del lato serosale e l’altra del lato mucosale.

La disposizione topografica di questi trasportatori è fondamentale per il mantenimento dei trasporti nella

direzione in cui essi avvengono. Non è una disposizione casuale di questi componenti di membrana.

Incidentalmente a mantenere la dislocazione ineguale di questi componenti di membrana concorrono

proteine del citoscheletro, proteine accessorie, che impediscono il movimento in base alla dinamica

intrinseca della membrana (considerata come un mosaico fluido).

L’antiportatore H K -ATPasi è selettivamente espresso sulla faccia mucosale.

+ +

Questa è la pompa che genera il trasporto attivo primario di ioni idrogeno che vengono spostati da inside

verso outside in scambio con ioni potassio che vengono scambiati da otuside verso inside.

Qual è una sorgente praticamente inesauribile di ioni idrogeno che una cellula ha a disposizione ? L’acqua

(acido debolissimo) con una base coniugata (ione ossidrilico) forte. La pompa sodio potassio ATPasi può

continuamente agire trasportando protoni inducendo così la continua dissociazione dell’acqua.

Un’altra importante fonte di ioni idrogeno è l’anidride carbonica, un gas che in acqua, attraverso una

reazione spontanea si idrata → bicarbonato con una base coniugata (acido carbonico) più debole.

Elemento importante in questo processo è un enzima che ha localizzazione citosolica (nello schema A.C.)

A.C. che sta per anidrasi carbonica che catalizza la reazione di idratazione dell’anidride carbonica per

formare acido carbonico. È una reazione termodinamicamente favorita, quindi spontanea.

L’anidrasi carbonica è un componente essenziale per formare ad un elevato turnover l’acido che rappresenta

la fonte di protoni in questo caso; ma l’anidrasi carbonica ha anche un altro ruolo : quello di idratare

direttamente o meglio far reagire direttamente l’ OH base coniugata dell’acido acqua alla CO formando

- 2

direttamente bicarbonato. Quindi sia che a reagire direttamente con la CO sia acqua formando acido

2

carbonico prima che dissocia a bicarbonato poi, sia che a reagire con l’anidride carbonica sia lo ione

ossidrilico si forma bicarbonato.

Lo ione bicarbonato tende a generarsi all’interno del citoplasma, rispetto al LEC quindi al sangue, sperimenta

una differenza di concentrazione favorevole al suo movimento dal citoplasma verso il sangue cioè l’azione

dell’anidrasi carbonica tende a generare una concentrazione di bicarbonato intracellulare maggiore di

quanto non sia nel LEC e nel sangue → questo rappresenta la base termodinamica per il movimento di

bicarbonato attraverso la membrana.

Il movimento di bicarbonato avviene per via assistita attraverso il trasportatore antiportatore bicarbonato

cloruro HCO /Cl .

3- -

Il primo step riguarda l’ingresso dello ione cloruro dal sangue nel citoplasma. Poi lo ione cloruro è trasferito

dal citoplasma verso il lume dello stomaco.

Questo primo step riguarda la membrana vasolaterale/serosale ed è un processo assistito dall’antiportatore

bicarbonato cloruro.

Ma la concentrazione più elevata intracellularmente del bicarbonato utile allo scambio con il cloruro è resa

tale dalla anidrasi carbonica (che catalizza l’idratazione della CO ) e dalla anidride protonica (che continua a

2

spostare protoni verso il lume) → è un trasporto attivo secondario : perché l’equilibrio acido base del

bicarbonato + ioni H e acido carbonico è continuamente spostato verso la forma dissociata proprio perché i

+

protoni sono pompati dall’ATPasi verso il lume.

Questo è un esempio di trasportatore che non è sede di consumo di ATP ma agisce in modo sinergico con

una pompa (trasporto attivo secondario).

Se campioniamo, durante la fase acida della digestione gastrica il sangue arterioso in ingresso nello stomaco

e il sangue in uscita venoso dallo stomaco si troverà una concentrazione minore di cloruro in uscita di quanto

non sia in ingresso e una concentrazione maggiore di bicarbonato in uscita di quanto non sia in ingresso.

Questo aumento nel sangue venoso di bicarbonato refluo dallo stomaco è detta marea alcalina ed è una

conseguenza diretta della produzione di acido cloridrico.

Quello che si realizza è un “cortocircuito di potassio” poiché il potassio è pompato all’interno dall’ATPasi

protonica e poi il potassio è trasferito all’esterno dall’accoppiatore con il cloruro.

A contribuire alla concentrazione di potassio intracellulare maggiore di quanto non sia all’esterno sta anche

la sodio potassio ATPasi che mantiene condizioni di stato stazionario con potassio a concentrazione

maggiore nel citoplasma di quanto non sia all’esterno.

La formazione netta di acido cloridrico dipende da un trasporto disaccoppiato di ioni H con ioni CL per cui

+ -

non si forma acido cloridrico nella cellula ma si ha un trasporto separato del catione e dell’anione cosa che

permette di controllare molto bene il pH intracellulare (mantenendolo all’interno di valori fisiologici)

ugualmente di poter generare un’elevata acidità nel lume dello stomaco.

Molto importante poi la separazione topografica dei trasportatori poiché se il trasporto di bicarbonato

avvenisse anche in questa direzione (?) avremmo il trasporto di una base coniugata di un acido che è più

debole quindi di fatto si genera un acido forte rispetto a uno debole scambiando le basi coniugate : la base

coniugata dell’acido debole verso il sangue (marea alcalina); la base coniugata dell’acido forte all’interno del

succo gastrico.

Che destino ha il bicarbonato ? Viene regolato attraverso altre vie : via respiratoria e via renale.

I trasporti attivi secondari sono tutti elettroneutri.

A sostenere i trasporti attivi secondari non sono solo gradienti di concentrazione generati da pompe ma

sono anche differenze di potenziale elettrico cioè differenze di voltaggio tra faccia interna e faccia esterna.

+ -

Trasporto attivo secondario: cotrasporto Na -D glucosio

Famiglia di trasportatori che catalizzando un cotrasporto di glucosio accoppiato al movimento del sodio.

Il glucosio si lega in un sito di legame del trasportatore, il sodio si lega in un sito di legame del trasportatore

→ il legame del sodio induce una variazione conformazionale che fa variare l’attività per il glucosio.

Il glucosio si muove nella direzione lungo la quale si muove il sodio che è quella di gradiente di

concentrazione imposto dalla sodio potassio ATPasi.

È un esempio particolare perché abbiamo il cotrasporto di un catione con un anaelettrolita → si muove

quindi carica elettrica (non c’è l’effetto compensativo catione anione).

Stiamo studiando come mai la concentrazione di glucosio, che rappresenta la nostra glicemia normale, è tale

per cui questa stessa concentrazione di glucosio che troviamo nel sangue la troveremmo anche dentro

l’ultrafiltrato glomerulare.

Ma se guardiamo l’urina di glucosio ce n’è zero perché questo glucosio che è ultrafiltrato completamente

attraverso le fenestrature dei capillari viene recuperato attivamente.

Oppure potremmo guardare questa cellula come una cellula del duodeno del tratto assorbente del tratto

gastrointestinale dove il glucosio ci arriva attraverso l’assunzione di alimenti, i polimeri di glucosio vengono

idrolizzati da opportune amilasi, si forma il glucosio che viene assorbito completamente.

Durante la fase iniziale di assorbimento di un alimento la concentrazione di glucosio nel bolo alimentare è

maggiore di quanto non sia nel sangue non avremmo bisogno di considerare processi attivi ma nel

momento in cui il glucosio è completamente assorbito e ne rimane 0 (nel materiale fecale e urinario)

dobbiamo pensare ad un processo attivo.

Il glucosio si muove attraverso un trasferimento che è accoppiato al trasferimento secondo gradiente di

concentrazione del sodio.

Perché il movimento del sodio avviene secondo gradiente di concentrazione del sodio ? Perché la

concentrazione intracellulare di sodio è mantenuta bassa dalla sodio potassio ATPasi la quale trasferisce

sodio verso il LEC avendo questa proteina a localizzazione vasolaterale.

Quel processo è sempre aperto dal lume verso il LEC per la presenza di trasportatori sodio/glucosio da una

faccia e per la presenza della sodio potassio atpasi sulla faccia opposta.

A questo movimento continuo di sodio è agganciato il movimento continuo di glucosio.

Il glucosio arriva nel citoplasma è poi trasferito dal citoplasma verso il LEC dall’uniportatore (trasportatore

passivo, proteina GLUT nelle varie isoforme).

Anche qui l’accoppiamento di trasportatori passivi con poi un trasportatore attivo → esempio di trasporto

attivo secondario.

Queste proteine appartengono alla famiglia SGLT (sodio glucose transport family) le conosciamo due

isoforme :

• SGLT1 che ha localizzazione a livello di intestino tenute e tubulo contorto prossimale. Ha una

stechiometria di due sodio per un glucosio 2:1 (accoppia il movimento di due ioni sodio con un

anaelettrolita glucosio)

• SGLT2 che ha localizzazione a livello di tubulo contorto prossimale, ha una stechiometria 1:1

(accoppia il movimento di una molecola di glucosio con uno ione sodio).

Tra faccia interna e faccia esterna c’è una differenza di potenziale elettrico. Chiaramente l’accoppiamento di

queste differenze di potenziale elettrico nei confronti di un trasporto che prevede due cationi o un catione

sarà molto diversa. L’efficienza del trasporto sarà quindi molto diversa.

Se guardiamo alla complessità dei trasporti attivi

secondari che sono agganciati ai movimenti di

sodio e quindi se guardiamo alla complessità dei

cotrasporti (ione sodio + altre molecole) vediamo

un quadro molto complesso : il sodio è associato

al trasferimento di sodio bicarbonato, al

trasferimento di sodio potassio e due ioni cloruro

(trasportatori della famiglia CCC che trasportano

sodio insieme a potassio e due ioni cloruri );

oppure trasportatori che trasportano uno ione

sodio e uno ione cloruro; oppure uno ione sodio,

uno ione potassio e due cloruri. + +

Meccanismi di trasporto ionici : lo scambio Na /H (sodio/protoni)

Lo scambiatore sodio/protoni è una proteina (appartenente alla famiglia delle proteine CPA1) dove un

isoforma (NHE1) è ubiquitaria e ha funzione di housekeeping (regolazione del pH citosolico : processo

importante perché se consideriamo il citosol come sede della respirazione, anche se una parte di questo

processo avviene a livello dei mitocondri, possiamo considerarla come una reazione dell’ambiente interno

della cellula e la respirazione cellulare è fonte di continua produzione di CO e fonte di acidità per la cellula).

2

L’isoforma invece NHE3 ha localizzazione renale e intestinale, sulle membrane plasmatiche apicali; funzione

nel riassorbimento renale sali e bicarbonato; creazione microambiente acidico nell’unstirred layers che facilita

assorbimento dipeptidi e acidi grassi nell’intestino tenue.

Attraverso lo scambiatore sodio protoni si ha il movimento di sodio dal liquido extracellulare verso il citosol

in scambio con i protoni che si muovono dal citosol verso il liquido extracellulare.

Importanza di questa proteina nel mantenimento del volume cellulare.

Prendiamo come cellula modello un linfocita : una cellula che si trova in equilibrio osmotico quando esso è

sospeso in una soluzione di sodio cloruro 0,15 M, una soluzione isotonica rispetto all’ambiente intracellulare.

Quindi le dimensioni di questa cellula sono esattamente le dimensioni fisiologiche.

Da 0,15 M questa cellula viene sospesa in un mezzo 0,25 M di NaCl.

0,15 M è una quantità solida (grammi) che viene sciolto in acqua, ma sciolto in acqua il sodio cloruro non

esiste come NaCl ma è un sale, soprattutto un elettrolita. Quindi dal sodio cloruro generiamo Na solvatato in

+

acqua e Cl solvatato in acqua.

-

Il legame ionico che tiene insieme Na+ e Cl- si rompe quando questo soluto viene disciolto in acqua.

Da una molecola si ottengono due ioni, la concentrazione osmolare (che fa riferimento alla concentrazione

corretta per il numero di specie che contribuiscono all’osmolarità della soluzione) è il doppio della

concentrazione molare quindi quel citosol del linfocita ha le caratteristiche osmotiche di una soluzione 0,3

osmolare, condizione osmolare che posso simulare molto bene utilizzando NaCl 0,15 molare.

Sostituisco il mezzo 0,25 M al mezzo 0,15 M l’osmolarità.

L’effetto sarà indurre un movimento di acqua dalla regione dove l’acqua è più concentrata alla regione dove

l’acqua è meno concentrata (effetto osmotico). L’acqua lascerà quindi il citosol.

Osserviamo una riduzione del volume cellulare. Se aspettiamo un po’ di tempo il volume cellulare tenderà a

ripristinare i valori normali. Questo si ha perché la cellula tenderà ad equilibrare la sua osmolarità interna

rispetto all’osmolarità esterna cioè tenderà a porsi in un equilibrio osmotico.

Come si realizza questo processo? Attraverso l’ingresso di sodio cloruro.

Il sodio cloruro entra attraverso una combinazione di trasporti → per quanto attiene allo ione Na proprio

+

attraverso l’antiportatore Na /H , la sorgente di protoni in questo caso è l’acido carbonico.

+ +

Per quanto riguarda l’ingresso di cloruro c’è il coinvolgimento dello scambiatore cloruro bicarbonato: lo ione

Cl entra in cellula in antiporto con il bicarbonato. La combinazione di questi due processi ha l’effetto netto di

-

avere l’ingresso del sodio/cloruro e spostamento verso l’esterno di acido carbonico.

Questo avviene sempre perché la cellula mantiene sempre quest’effetto di trasporto dell’acidità prodotta

dalla respirazione cellulare verso l’esterno. In più in questo caso abbiamo in più l’effetto di massificazione

del processo perché questo è legato ad un nuovo stimolo che la cellula riceve cioè quello legato alla sua

diminuzione di volume cellulare.

Quando facciamo l’esperimento opposto il citosol diventa iperosmotico rispetto al liquido extracellulare quindi

l’acqua entra questo determina aumento del volume cellulare che comporta aumento della pressione

idrostatica che viene sperimentata dalla membrana plasmatica.

Possiamo adesso considerare il sodio cloruro come elettrolita implicato in una serie di processi di natura

osmotica.

Va notato che la densità di carica che si osserva sulla faccia della cellula che va sul lato mucosale e la densità

di carica che c’è sulla membrana che dà sul lato serosale è diversa.

Quindi esiste una differenza di potenziale elettrico tra la faccia interna e la faccia esterna della membrana a

cui corrisponde anche una differenza di potenziale elettrico transepiteliale tra la faccia serosale e quella

mucosale.

Se guardiamo la differenza di potenziale elettrico che esiste tra il lato serosale e mucosale di questa cellula

abbiamo delle differenze di potenziale elettrico dell’ordine dei 100 mV.

Questo è un esempio di trasporto sodio/cloruro attraverso un epitelio ad alta resistenza chiamato così

perché è un epitelio in grado di mantenere una elevata differenza di potenziale elettrico tra una faccia e

l’altra.

Cos’è che fa dissipare la differenza di potenziale elettrico ? Una corrente elettrica : se si genera una corrente

elettrica la differenza di potenziale elettrico si dissipa.

Cos’è che ostacola o favorisce un movimento di corrente elettrica ? La resistenza.

Quest’epitelio è ad alta resistenza e di conseguenza è un epitelio dove le correnti elettriche sono modeste e

quindi mantiene costante quella differenza di potenziale nel tempo.

Questa differenza di potenziale elettrico è utile al movimento di sodio dall’ambiente esterno verso il citosol

perché il sodio si muove secondo una differenza di potenziale elettrico favorevole al movimento dall’esterno

verso l’interno.

Il sodio si muove attraverso un canale ionico (cilindro in figura) cioè una proteina intrinseca di membrana

che seleziona soltanto il sodio in base alle sue caratteristiche geometriche.

È mosso in questo caso da una differenza di potenziale elettrico.

Il sodio muovendosi attraverso quel canale ionico porta dentro una carica elettrica positiva.

Il sodio però si muove anche per una differenza di potenziale chimico.

Sempre sul lato mucosale troviamo un’altra proteina è l’antiportatore bicarbonato /cloruro. Il cloruro si

sposta dal citoplasma verso il liquido extracellulare utilizzando anch’esso un canale ionico : quindi questo

movimento avviene contro gradiente di concentrazione e secondo una differenza di potenziale elettrico

favorevole.

Confronto tra epitelio a bassa resistenza e epitelio ad alta resistenza : alta resistenza significa che

deprime le correnti elettriche e quindi mantiene carico la differenza di potenziale elettrico; bassa resistenza

significa che le correnti elettriche sono meno sfavorite ma le correnti elettriche tendono ad annullare quella

differenza di potenziale elettrico.

Quello che differenzia un epitelio ad alta rispetto a bassa resistenza è il fatto di avere giunzioni serrate tra

cellule e cellule nel caso dell’epitelio ad alta resistenza e giunzioni lasse nel caso dell’epitelio a bassa

resistenza (permettono movimento di ioni e quindi passaggio di corrente elettrica).

Un epitelio ad alta resistenza permette movimenti di ioni soltanto attraverso la via endocellulare, un epitelio

a bassa resistenza permette movimento di ioni anche attraverso la via paracellulare e questo movimento di

ioni è quello di fatto responsabile dell’annullamento o diminuzione della differenza di potenziale elettrico

transepiteliale.

Trasporto di NaCl in epiteli a bassa resistenza : Accoppiamento strutturale

Sodio/potassio ATPasi con localizzazione serosale, il cotrasportatore potassio/cloruro e il simportatore di

sodio cloruro (altro caso di trasporto attivo secondario) : l’ATPasi mantiene la concentrazione intracellulare di

sodio bassa questo favorisce il movimento di sodio attraverso questo cotrasportatore a cui è agganciato

anche il movimento di cloruro. Il cloruro viene poi trasferito sul lato vasolaterale mediante contrasporto con il

potassio. Il cortocircuito di potassio è responsabile del movimento di cloruro su quella faccia della cellula.

Le proteine coinvolte sono le proteine della famiglia CCC di queste proteine troviamo due diverse

alternative :

Cotrasportatori di un sodio con un cloruro.

• Cotrasportatori sodio/potassio due cloruri. Quindi in questo caso il cotrasportatore è responsabile

• anche dell’ingresso del potassio che è uno ione che cortocircuitato grazie alla sodio/potassio ATPasi.

Si parla di accoppiamento strutturale perchè in questo caso è la stessa proteina strutturale di membrana

che simporta sia il sodio che il cloruro (in alternativa sia il sodio, sia il potassio che due cloruri). Quindi è la

stessa proteina di membrana che è sede del trasferimento sia del catione che dell’anione.

Trasporto di NaCl in epiteli a bassa resistenza : Accoppiamento funzionale

Osserviamo la faccia mucosale. Il processo di trasferimento di sodio cloruro è un processo che risulta dalla

combinazione di due antiporti.

Nel caso precedente era un simporto di sodio con un simporto di cloruro, qui un doppio antiporto : un

antiporto bicarbonato/cloruro (responsabile dell’ingresso di cloruro) e un antiporto di protoni con il sodio.

Lo chiamo accoppiamento funzionale perché sono due strutture diverse che però si accoppiano dal punto

di vista funzionale per generare complessivamente un trasporto di Na Cl

+ -

! sono tutti trasporti elettroneutri.

Trasporto di NaCl in epiteli a bassissima resistenza

Le cellule delle ghiandole intestinali producono una soluzione isotonica di NaCl in risposta a vari

stimoli di natura chimica, meccanica e neuroendocrina. Questa secrezione fa sì che il contenuto

intestinale, mano a mano che procedono i processi di digestione ed assorbimento, mantenga una

fluidità adeguata a garentire il suo passaggio lungo l’intestino. Il flusso secretorio è alimentato

dalla secrezione di Cl .

-

Gli ioni Cl entrano nella cellula dalla membrana basolaterale tramite il cotrasporto Na /K /2Cl e

- + + -

poi fuoriescono nel lume attraverso il canale CFTR localizzato nella membrana apicale; il Na e

+

l’acqua seguono per via paracellulare.

Questo esempio ci fa considerare un processo che è estremamente importante : il bilancio funzionale di un

organismo che è proprio legato al sodio cloruro inteso come osmolita (sostanza osmoticamente attiva) i cui

movimenti sono agganciati ai momenti di acqua.

TRASPORTO ATTIVO DI ACQUA

E’ un modo indiretto di parlare di trasporto attivo perché non parleremo mai di un trasportatore dell’acqua

(l’acqua non necessita di trasportatori!! essendo il più piccolo soluto di sé stessa, l’acqua si sposta attraverso

pori o attraverso il doppio strato lipidico).

Molti epiteli delimitano delle regioni dello spazio dove sono presenti soluzioni con concentrazione di acqua

uguali (isosmotiche), quindi non vi è nessuna premessa dal punto di vista osmotico per pensare ad un

movimento preferenziale di acqua in una direzione piuttosto che l’altra, eppure questi epiteli sono interessati

da flussi massivi di acqua molto importanti).

Studiamo come l’assorbimento di sodio cloruro diventi un fattore rilevante per il trascinamento di acqua in

una certa direzione → direzione del trasporto del sodio cloruro.

Il trasporto attivo di acqua si basa sulle proprietà di permeazione all’acqua dei soluti attraverso la via

endocellulare ma anche attraverso la via paracellulare ( = epiteli a resistenza abbastanza bassa : se la via

paracellulare è permessa vuol dire che le correnti elettriche dissiperanno quella differenza di potenziale).

Modello della doppia membrana

Detto modello della doppia membrana perché considera un epitelio associato ad un endotelio come due

membrane.

Endotelio ed epitelio hanno caratteristiche diverse per quanto riguarda i coefficienti di riflessione nei

confronti dei soluti e le loro proprietà epiteliali.

Considero l’epitelio assorbente : le cellule delimitano l’ambiente luminale dall’ambiente vaso-laterale (questo

è il primo epitelio che posso considerare come membrana dal punto di vista dei trasporti).

L’altra membrana è l’endotelio.

Jv = Lp (Dp +/- sDp)

I flussi massimi che consideriamo attraverso questo processo sono flussi in volumi di acqua per unità di

tempo per unità di superficie, che dipendono in modo direttamente proporzionale a Lp (coefficiente di

permeabilità idraulica) o a un altro coefficiente (Kf coefficiente di filtrazione se è un flusso turbolento) e la

differenza di pressione idrostatica e una differenza di pressione osmotica corretta per il coefficiente di

riflessione dei soluti che sono in gioco.

Caratteristiche dal punto di vista delle proprietà idrauliche e proprietà di trasporto.

Quell’epitelio assorbente presenta delle giunzioni intracellulari che sono molto strette.

Per semplicità possiamo assumere che quest’epitelio (epitelio assorbente) abbia complessivamente un

coefficiente di riflessione pari a 1 (s 1) se guardiamo la via paracellulare. Avere giunzioni strette significa

=

che il coefficiente di permeabilità idraulica o il coefficiente di filtrazione è relativamente piccolo ma

comunque diverso da 0 perché l’acqua si muove.

Di caratteristico quest’epitelio ha la possibilità di trasportare attivamente sodio cloruro.

Quindi il coefficiente di riflessione vale 1 se guardiamo i pori giunzionali ma quest’epitelio, attraverso il

consumo di ATP continua a trasferire NaCl.

Per quanto riguarda l’endotelio, sono presenti fenestrature che conferiranno a questa interfaccia un

coefficiente di permeabilità idraulica elevato e nel contempo conferiranno a questa interfaccia un coefficiente

di riflessione (se guardiamo a soluti che non sono proteine) pari a 0.

Il sodio cloruro non si può spostare attraverso questa interfaccia se non per via endocellulare. Ma il sodio

cloruro si può spostare attraverso questa interfaccia per via paracellulare attraverso le fenestrature.

Prendiamo il LEC e dividiamolo di tanti volumi infinitesimi spostandoci dall’epitelio verso l’endotelio.

Jv = flusso volumetrico

Il trasporto attivo del sodio cloruro genererà un aumento locale di pressione osmotica.

Un aumento di pressione osmotica nel LEC tenderà a spingere l’acqua da A → B : il richiamo di acqua è da

lume verso LEC.

Il movimento di acqua anche se dal punto di vista della pressione osmotica potrebbe avvenire in una

direzione o nell’altra, avviene sempre in una sola direzione quella dettata dal coefficiente di riflessione più

alto (prossimo a 1).

Se l’acqua si sposta dal lume verso il LEC , il volume del LEC tenderà ad aumentare (il volume di LEC che

aumenta dà una pressione idrostatica netta).

L’acqua va verso Lp più grandi. La pressione idrostatica che adesso è esercitata su entrambe le interfacce

darà un flusso netto di acqua da B → C che è maggiore di quanto non sia da B → A perché verso C (verso il

sangue) il coefficiente di permeabilità idraulica o il coefficiente di filtrazione è maggiore grazie alle

fenestrature.

Quindi il movimento di acqua andrà verso il circolo sanguigno.

Riassumendo : : Jv = Lp (Dp +/- sDp)

Si realizza un flusso volumetrico di acqua

Jv (A – B ) (flusso volumetrico di acqua) Dal lume verso il LEC su base osmotica

Jv (B – C) (flusso volumetrico di acqua) Dal LEC verso il sangue su base idrostatica.

Complessivamente il flusso di acqua è dal lume verso il sangue Jv (A-C) (questo seguendo un trasporto di

NaCl dove l’epitelio lo trasporta attivamente ma l’endotelio no, che crea la base osmotica per avere richiamo

di acqua.

L’acqua dal LEC va poi verso il sangue perché le condizioni idrauliche sono più favorevoli al movimento di

acqua in quella direzione.

Si genera il cosiddetto gradiente stazionario di NaCl .

Detto gradiente perché NaCl sarà tanto più concentrato verso l’epitelio e a uguale concentrazione del sangue

verso l’endotelio.

Stazionario perché quel NaCl tenderà sempre a passare le fenestrature per andare nel sangue e soprattutto

l’acqua che permea in quella direzione trascinerà il sodio cloruro quindi è necessario continuare a investire

ATP per mantenere quel gradiente di concentrazione.

Questo gradiente stazionario di NaCl è importante perché permette un recupero massivo di acqua, acqua

che può trascinare i soluti in essa disciolti.

Come ci aspettiamo essere la pressione idrostatica del citosol sanguigno nei capillari che sono a ridosso di un

sistema di questo tipo ? MOLTO BASSA. La pressione sanguigna scende a valori più bassi e questo permette

di privilegiare l’aspetto di riassorbimento.

Da dove arriva l’acqua che sta all’interno del tratto gastro intestinale? Anche in questo caso si tratta di un

processo di “cortocircuito” → acqua che viene riversata acqua che viene assorbita.

Quindi dove arriva quest’acqua che rappresenta la fase principale del bolo alimentare? Ci arriva attraverso

processi secretivi di acqua. L’effetto di digestione riguarda proprio la presenza di enzimi digestivi che

vengono secreti da tutte le cellule dei diversi tratti che stanno a monte del tratto dove avviene

l’assorbimento.

Per quanto riguarda qualche dettaglio anatomico dell’intestino lo consideriamo un tratto a struttura

cilindrica la cui superficie interna è caratterizzata dalla presenza di pieghe dette villi intestinali a cui

corrispondono cellule cilindriche (per quanto riguarda l’epitelio assorbente del villo) le quali a loro volta sono

dotate di microvilli.

Se moltiplichiamo la superficie totale data dai villi intestinali e a sua volta la superficie totale dell’orletto a

spazzola dei microvilli di ogni singola cellula otteniamo una superficie di vari metri quadrati.

In più c’è un’ottimizzazione dello scambio di materia per quanto riguarda la superficie complessiva.

Se guardiamo la parete di questo cilindro che non è una parete geometrica semplice e osserviamo il villo in

particolare, osserviamo il villo formato dalla piegatura dell’epitelio assorbente (possiamo quindi definirlo

unità fondamentale) poi osserviamo l’orletto a spazzola associato ad ogni cellula epiteliale; il villo delimita

una regione dove si trova un vaso sanguigno che origina da un arteriola e finisce in una venula,

anastomizzato per formare un ciuffo di vasi che ha chiaramente il valore adattativo di aumentare il tempo di

residenza del sangue in quella regione e a questo è associato anche un vaso chilifero (vaso del sistema

linfatico) implicato in questo bilancio degli scambi di acqua.

Grazie ai processi di trasporto attivo di sodio cloruro che sono mantenuti allo stato stazionario, se prendiamo

un villo intestinale e lo sezioniamo e campioniamo l’osmolarità che c’è dall’apice fino alla base troviamo un

osmolarità che va da 450 mM all’apice fino a 150 mM alla base del villo laddove il sangue che è rimasto in

contatto con il villo rientra all’interno del sistema circolatorio sistemico.

Quindi un gradiente da 450 a 150 mM → questo gradiente si ha perché queste cellule dotate di orletto a

spazzola trasferiscono continuamente sodio/cloruro prelevandolo dal liquido che bagna il villo e lo

trasferiscono nel liquido interstiziale (chiaramente il sangue che entra in questa direzione man mano che sale

si va arricchendo di sodio cloruro e man mano che scende riceve il sodio cloruro).

Il sangue che entra e quello che esce ha la stessa composizione di osmolarità. Se seguiamo l’osmolarità del

sangue in ingresso e poi in uscita vediamo che questo gradiente cresce in senso apicale e decresce in senso

basale.

Volumi di acqua che si riferiscono ad un soggetto adulto normale : tipicamente 1500 ml di liquido (1,5 l)

assunzione di acqua attraverso la dieta, tale volume è ovviamente variabile si tratta di un valore medio.

A questi vanno aggiunti 1.5 l di acqua che deriva dalla continua secrezione delle ghiandole salivare.

Il volume del secreto gastrico è 2,5 L il fegato produce la bile una sostanza importante che ottimizza

l’assorbimento dei grassi, il secreto biliare è di 500 ml nelle 24 h. dobbiamo aggiungere 1,5 l di succo

pancreatico che è coinvolto nella fase alcalina della digestione che è la seconda fase della digestione delle

proteine. 1500 ml è la concentrazione enterica, è la secrezione delle ghiandole associate all’intestino in

quanto tale. Se sommiamo questi numeri vengono secreti 9 litri di acqua. A valle del tratto di assorbimento,

del duodeno ci sono ancora scambi di acqua.

ACCOPPIAMENTI ENERGETICI

ACCOPPIAMENTO DEL TRASPORTO DI ELETTROLITI AL V m

TRASPORTO NON-ELETTRONEUTRO

E’ un trasporto in cui un catione è trasportato, interagisce con il campo elettrico e

l’altra molecola, che è cotrasportata, non ha una carica elettrica (è

un’anaelettrolita).

È il caso dei trasportatori della famiglia SGLT (Sodium/Glucose Transporters).

La caratteristica di questi trasporti attivi secondari è di arrivare a concentrazione 0

(nell’ambiente extraepiteliale a favore del sangue) della sostanza che viene

assorbita da parte di quell’epitelio.

Con il movimento di sodio che avviene secondo un gradiente di concentrazione favorevole (cioè nella

direzione dei potenziali chimici decrescenti) e la polarizzazione della membrana (outside-inside) abbiamo

capito che grazie a processi diffusionali mediati da canali ionici di likaege per sodio e potassio (ed

eventualmente cloruro) mantenuti allo stato stazionario dalla Na /K ATPasi si genera questa differenza di

+ +

potenziale elettrico. Quindi la Na /K ATPasi è centrale non solo per mantenere a valori di stato stazionario il

+ +

gradiente chimico lungo le cui direzioni decrescenti si sposta il sodio del trasporto attivo secondari, ma

anche per mantenere allo stato stazionario il gradiente elettrico lungo il quale in direzione decrescente si

sposta il sodio.

Considero nella loro interezza quale sia la reazione endoergonica, quale sia la reazione esoergonica e sulla

base di questo parto per calcolare le concentrazioni vedendo come queste sono agganciate rispetto alla

differenza di potenziale elettrico.

• Reazione esoergonica : passaggio di Na da outside a inside.

+

• Reazione endoergonica: movimento di glucosio (G) da outside a inside.

Se quella reazione endoergonica prevede un inferiore rispetto alla reazione esoergonica,

DG

quell’accoppiamento in un trasporto attivo secondario è a minore efficienza perché una parte di quell’energia

liberata dalla reazione esoergonica non viene accoppiata a quella endoergonica.

Lo stesso se ci si trovasse nelle condizioni in cui il glucosio outside è più alto di quello inside avremmo una

reazione esoergonica che è accoppiata a una reazione altrettanto esoergonica, quindi ci sarebbe un

investimento inutile di energia che altro non fa che dissipare calore.

Quindi il ragionamento parte nella condizione in cui si abbia massimo accoppiamento tra la

trasformazione endoergonica e la trasformazione esoergonica cioè quando il negativo a carico del

DG

sodio è esattamente uguale al positivo a carico del glucosio → quando l’energia liberata dalla reazione

DG

esoergonica è uguale all’energia assorbita dalla reazione endoergonica.

Utilizziamo l’isoforma SGLT-2 quella che ha un rapporto stechiometrico (1:1) cioè un sodio per un glucosio.

Scrivere che la reazione esoergonica è accoppiata al 100 % con la reazione endoergonica lo esprimo

→ ) – ) = - ) + )

( ( ( (

Dm Dm m m m m

matematicamente : Na = - G Na finale Na iniziale G finale G iniziale

è quello che dà energia mentre è quello che assorbe energia (per questo il segno -).

Dm Dm

Na G

(m ) : il sodio va dall’esterno verso l’interno quindi il finale sarà l’interno mentre l’iniziale sarà l’esterno →

Na finale

RTIn[Na ] – RTIn[Na ] questa è la componente chimica alla quale viene aggiunta la

inside outside

Fψ - Fψ

componente elettrica → + (F perché z vale +1).

inside outside

RTIn[Na ] – RTIn[Na ] Fψ – Fψ

+

inside outside inside outside

T RTIn[G ] + RTIn[G ]

(m ) : il glucosio va nella stessa direzione - in questo caso non c’è

inside outside

G finale

nessuna scrittura che riguardi l’effetto del potenziale elettrico sul potenziale elettrochimico del glucosio

perché il glucosio non è un elettrolita.

QUINDI → RTIn[Na ] – RTIn[Na ] +Fψ – Fψ = - RTIn[G ] + RTIn[G ]

inside outside inside outside inside outside

RTIn[Na ] – RTIn[Na ] D

Raccolgo F +FD

ψ = - RTIn[G ] + RTIn[G ] con ψ ψ

= -ψ

inside outside inside outside i o

Si moltiplica primo e secondo membro per -1 (equivale a cambiare segno) :

RTIn[Na ] – RTIn[Na ] - FD

ψ = RTIn[G ] - RTIn[G ]

outside inside inside outside

RTIn[G ] / [G ] = RTIn[Na ] / [Na ] - FD

ψ

inside outside outside inside

Togliamo l’operatore logaritmo convertendolo in un esponenziale :

(-D F/RT)

[G ] / [G ] = [Na ] / [Na ] e ψ è sempre < 0

inside outside outside inside (e = esponenziale di)

La concentrazione di glucosio inside sarà tanto più grande rispetto alla concentrazione di glucosio outside

quanto la concentrazione di sodio outside è maggiore rispetto alla concentrazione di sodio inside ma su

questo rapporto c’è un elemento moltiplicativo e : ψ è negativo e quindi diventa e che mi dà un

(-D F/RT) +numero

ψ D

numero maggiore di 1 quindi questo è un fattore moltiplicativo che mi fa dire che il glucosio inside sarà

tanto maggiore rispetto al glucosio outside non soltanto per quanto è maggiore il sodio outside rispetto a

quello inside ma anche per questo effetto di moltiplicazione di questa concentrazione rispetto a questa.

Quindi già sarebbe favorevole in base alla differenza di concentrazione ma in più per il fatto che la differenza

di potenziale elettrico è negativa (se quella membrana si polarizzasse all’opposto si avrebbe un esponenziale

negativo che abbassa l’effetto del rapporto).

Con SGLT-1 (2:1) che trasporto due glucosi per un sodio il massimo accoppiamento tra trasformazione

esoergonica ed endoergonica si ha quando : 2Dm → 2(m ) – 2(m ) = - (m ) + (m )

Dm

Na = - G Na finale Na iniziale G finale G iniziale

La reazione esoergonica (il movimento di sodio) è contribuito da due ioni sodio quindi avremo il contributo

del potenziale elettrochimico di uno ione sodio che si muove nella direzione di potenziali elettrochimici

decrescenti più il contributo del potenziale elettrochimico dell’altro ione sodio che anch’esso si muove nella

direzione di potenziali elettrochimici decrescenti.

Faccio gli stessi passaggi di prima ma con il coefficiente 2 :

Quest’ultima equazione la converto in esponenziale : 2 (-D 2F/RT)

[G ] / [G ] = ([Na ] / [Na ]) e ψ ma è sempre <0

inside outside outside inside

La concentrazione di glucosio intracellulare è tanto maggiore rispetto alla concentrazione di glucosio

extracellulare quanto la concentrazione di sodio extracellulare è maggiore rispetto alla concentrazione di

sodio intracellulare ma è elevata al quadrato.

Se si spostano due sodi insieme ad un glucosio l’effetto della differenza di potenziale chimico sarà maggiore.

Quella parte di espressione che mi dice l’aggancio al potenziale elettrico varrà come e quindi aumenta

(-D 2F/RT)

ψ

anche il valore dell’esponenziale. Quel rapporto di glucosio inside rispetto al glucosio outside sarà ancora più

favorevole di prima rispetto ai rapporti sodio outside rispetto sodio inside.

TRASPORTO ELETTRONEUTRO : antiporto Cl / HCO

- 3-

Il trasporto elettroneutro prevederebbe un effetto favorevole nella direzione di uno

ione a seconda della ψ ma un effetto sfavorevole nella direzione dell’altro ione.

D

Un esempio è l’antiporto cloruro/bicarbonato.

Il cloruro si muove da outside a inside mentre il bicarbonato si muove da inside

verso outside.

Questo movimento del cloruro è sfavorito dalla differenza di potenziale elettrico

mentre il movimento di bicarbonato è favorito dalla differenza di potenziale elettrico.

Quindi questi due effetti si bilanciano e i rapporti di concentrazione dipenderanno

esclusivamente dalla componente chimica : mi aspetto di ricavare un’equazione dove

non c’è nessun esponenziale di – ψ

D . = - !

Dm Dm

Il massimo accoppiamento tra i due trasporti si ha quando : z = -1

Cl HCO3

Il cloruro si muove dall’esterno verso l’interno :

( +Fψ perché meno per meno = più)

inside

Raccolgo a fattor comune F ed esprimo la differenza dei due logaritmi come il logaritmo del rapporto degli

argomenti:

QUINDI la relazione per il cloruro è :

Il bicarbonato si muove da inside verso outside :

In questo caso le componenti elettriche si compensano e i rapporti di concentrazione degli ioni tra interno

ed esterno rappresentano l’unica discriminante per quanto riguarda l’efficienza dell’ingresso.

Cioè l’ingresso di cloruro sarà ranto più efficiente quanto più la produzione intracellulare di bicarbonato è

efficiente. Il bicarbonato inside tende sempre a crescere per effetto dell’anidrasi carbonica quindi è sempre

favorevole l’effetto di concentrazione all’interno della cellula perché l’anidrasi carbonica continua a

catalizzare quella idratazione e soprattutto perché la cellula continua a produrre anidride carbonica

attraverso il suo metabolismo.

Se consideriamo le cellule auxintiche esse trasportano attivamente i protoni verso il lume quindi tengono

spostato verso la forma dissociata l’equilibrio acido-base del bicarbonato. Quindi per effetto indiretto

dell’ATPasi protonica quello ione bicarbonato continua a dissociarsi anche al di là di quello che sarebbe

definito dalla costante di dissociazione acida di questo acido debole.

Altro esempio di trasporto elettroneutro è il sodio/cloruro. Ci aspettiamo che ci sia accoppiamento

energetico perché il sodio si muove dalla faccia a voltaggio positivo verso la faccia a voltaggio negativo

mentre il cloruro va dal negativo verso il positivo (è un simporto in questo caso).

SEGNALI ELETTRICI I

Consideriamo i soluti elettrolitici visti non tanto dal punto di vista della loro rilevanza osmotica ma per il fatto

che associata ad ogni ione è una carica elettrica.

La carica elettrica si misura in Coulombs.

Lo ione sodio ha un elettrone in meno quindi ha una carica negativa in meno quindi è un catione (10 -19

Coulombs).

Lo ione cloruro ha un elettrone in più quindi vale come anione ( ha una carica elettrica pari a +10 ).

-19

Se abbiamo una soluzione di elettroliti cioè una soluzione formata sciogliendo un elettrolita nell’acqua

abbiamo un numero uguale sia di cationi che di anioni → questa soluzione è elettroneutra.

Però localmente avremo continui movimenti di cationi e anioni ciascuno dei quali porterà nello spazio la

carica elettrica che gli compete (→ si genera una corrente elettrica misurata in Ampere).

Nello spazio dato dal solvente non misuriamo nessuna differenza di potenziale perché c’è un numero uguale

di cationi e anioni ( i due mezzi sono elettroneutri), ma se abbiamo una locale distribuzione ineguale di ioni

avremo una differenza di potenziale elettrico locale.

Quindi se la condizione di equiripartizione di anioni e cationi non è mantenuta si generano delle differenze di

potenziale elettrico.

Consideriamo un sistema molto semplice → cellula con il suo plasmalemma che separa il citosol dal LEC.

Un volmetro è uno strumento che ci permette di misurare se tra due punti nello spazio esiste una differenza

di potenziale elettrico.

Nel mio mezzo acquoso ho una cellula che è in perfetto equilibrio osmotico, ho a disposizione un elettrodo

così sottile e un volmetro così sensibile tale che io possa iniettare l’elettrodo attraverso la membrana

plasmatica e sperimentare una differenza di potenziale elettrico, se esiste, tra la membrana cellulare (lato

interno) e l’elettrodo di riferimento che mantengo nel liquido esterno.

La descrizione di questi processi è stata svolta in particolare da Hodgking e Huxley che hanno avuto

un’intuizione geniale che ha permesso loro di costruire una teoria sulla base di un’osservazione sperimentale.

Riassumendo :

• Volmetro

• Un elettro che campiona il potenziale elettrico sulla faccia della membrana

• Un altro elettrodo di riferimento posto all’esterno.

Paradigma sperimentale è stato il calamaro e in particolare gli assoni giganti del calamaro.

Gli assoni giganti guidano dei segnali elettrici dai gangli encefalici verso i muscoli del mantello.

Quindi per neurofisiologi che dovevano impiantare gli elettrodi all’interno della cellula era un materiale

estremamente utile e un sistema più facile da manipolare.

Partiamo dall’osservazione sperimentale → quando abbiamo gli elettrodi nel liquido extracellulare (LEC)

troviamo una differenza di potenziale elettrico pari a 0 millivolts (questo vuol dire che c’è un’equiripartizione

di cationi e anioni) quando poi inseriamo l’elettrodo all’interno della cellula vediamo dei valori di potenziale

elettrico che si attestano verso valori negativi con valori interni variabili da cellula a cellula.

Possiamo campionare cellule che hanno valori di potenziale elettrico molto negativi (sono cellule

iperpolarizzate e sono classicamente neuroni e cellule muscolari) le altre cellule presentano valori di

differenza di potenziale elettrico ma sono valori meno iperpolarizzati.

In tutti i casi osserviamo valori negativi che coincidono con una condizione tale per cui la faccia intracellulare

della membrana è a voltaggio negativo mentre la faccia esterna della membrana (osserviamo valori positivi)

è a voltaggio positivo.

Se mantengo l’elettrodo impiantato e seguo il segnale in funzione del tempo quello che vedo è una

differenza di potenziale elettrico costante nel tempo → si tratta di una condizione di stato stazionario.

Il potenziale di membrana a riposo è una differenza di potenziale elettrico tra faccia esterna della

membrana a voltaggio positivo e faccia interna della membrana a voltaggio negativo e che è mantenuta allo

stato stazionario (cioè è costante nel tempo se la cellula è a riposo). Se la cellula non è a riposo lo stato

stazionario si perturba e si genera un segnale.

Le concentrazioni intracellulari di sodio e potassio non sono le stesse perché

alla base di questa differenza di concentrazione sta proprio l’attività della sodio

potassio ATPasi.

Per tre casi cellulari diversi osserviamo le concentrazioni di sodio, potassio e

cloruro.

Sono concentrazioni millimolari in sta per INSIDE quindi il citosol ; ext sta per il

liquido extracellulare.

Em (m sta a indicare che è la proprietà di membrana di queste cellule) sperim.

(sta per sperimentalmente) per i diversi tipi cellulari riporta il valore di

differenza di potenziale elettrico, riporta quindi i valori di potenziali di

membrana a riposo.

Sappiamo che la concentrazione di sodio extracellulare sia maggiore di quella

intracellulare e viceversa per il potassio, alla base di questo c’è la continua

attività della sodio potassio ATPasi.

Nella tabella sono riportati anche dei valori in rosso indicati con Ei (ogni valore

si riferisce allo iesimo ione che sto considerando).

La sodio potassio ATPasi è alla base di quella ineguale ripartizione di ioni e se lo

ione sodio è più concentrato all’esterno della cellula, lo ione sodio continua a

sperimentare un gradiente di potenziale chimico che tenderebbe a spostarlo

verso l’interno della cellula.

Questo potenziale possiamo chiamarlo elettrochimico in quanto possono essere coinvolti fenomeni elettrici.

Quindi in quella condizione il sodio sperimenta un potenziale elettrochimico favorevole a muoversi

dall’esterno verso l’interno. Viceversa il potassio sperimenterà un gradiente elettrochimico, che lo tenderà a

spostare dall’interno verso l’esterno della cellula.

Ora questi movimenti di ioni dipenderanno dalla permeabilità che questi ioni hanno attraverso la membrana.

Se la membrana è impermeabile a quegli ioni questi movimenti non si realizzeranno, se la membrana è

permeabile a quegli ioni i movimenti si potranno realizzare.

Per una certa misura la membrana è permeabile al sodio e al potassio? Si → perché se non fosse permeabile

la concentrazione di sodio intracellulare sarebbe 0 e la concentrazione di potassio intracellulare sarebbe 0

perché la pompa continua a consumare ATP.

Quindi il fatto che quelle concentrazioni siano concentrazioni di stato stazionario dove le concentrazioni

sono diverse (e sono anche diverse da 0) intra ed extracellulare ci fa pensare che le permeabilità non siano 0.

Permeabilità che non sono 0 è un osservazione controintuitiva rispetto a quando avevamo considerato questi

ioni guardando al loro coefficiente di permeabilità attraverso il doppio strato lipidico.

Se guardiamo alle membrane artificiali, dov’è presente solo il doppio strato lipidico, i coefficienti di

permeabilità sono asintoticamente 0 sia per sodio che per potassio. Quindi per cercare le ragioni della

permeabilità la dovremmo cercare attraverso dei componenti di membrana.

Se ricordiamo i processi di trasporto attivo secondario possiamo pensare che la concentrazione intracellulare

di sodio non sia 0 perché il sodio continua a entrare in cellula attraverso il cotrasporto per esempio con

zuccheri e amminoacidi, il potassio invece continua a entrare in cellula per esempio in cotrasporto con il

cloruro.

Sodio potassio e due cloruri continuano a generare un passaggio intracellulare di questi ioni. Quindi già

attraverso i trasporti attivi secondari avevamo considerato che gli antiporti e i simporti di questi ioni con altri

ioni o con altre molecole tipicamente anaelettrolite ci danno questi effetti di concentrazione 0.

Consideriamo questa questione dal punto di vista della valenza elettrica che il processo può avere.

Data questa condizione mantenuta allo stato stazionario per quanto riguarda il sodio possiamo dire che il

sodio tenderà a muoversi dall’esterno verso l’interno secondo il potenziale elettrochimico decrescente scritto

come:

Dal momento che dall’ambiente di arrivo a quello di partenza esiste una differenza di potenziale

elettrochimico si genererà un flusso ionico soltanto se la membrana è permeabile allo ione.

La differenza di potenziale elettrochimico per quanto riguarda il potassio è :

Se considero la differenza di potenziale elettrochimico rispetto alla distanza x posso parlare di flusso.

Facciamo un analisi caso per caso vedendo quali sarebbero le differenze di potenziale elettrico che si formano

sui due lati della membrana se ad essere permeabile sia soltanto uno ione alla volta.

Considero quindi cosa succede se la membrana è una volta permeabile solo al sodio e una volta solo al

potassio.

Membrana permeabile soltanto al sodio

Se considero che solo al sodio la membrana sia permeabile succede che in base alla differenza di potenziale

chimico il sodio porta sulla faccia intracellulare della carica positiva.

Questo movimento di carica sulla faccia intracellulare porta ad un eccesso di carica positiva sulla faccia

intracellulare lasciando alle spalle un difetto di carica positiva : quindi la faccia extracellulare tenderà ad

assumere un voltaggio che è opposto. Nel sistema si è generato una differenza di potenziale elettrico (= un

gradiente elettrico).

Questa differenza di potenziale elettrico favorisce o sfavorisce lo ione sodio in base alla differenza di

concentrazione? Sfavorisce.

Quando arriviamo alla condizione di equilibrio (equilibrio elettrochimico) ? Quando il elettrico e il

DV DV

chimico sono fra di loro uguali e opposti di segno.

All’equilibrio abbiamo che :

Questa si chiama equazione di Nernst o equazione di equilibrio elettrochimico per il sodio.

Questa equazione permette di predire una differenza di potenziale elettrico transmembrana note le

concentrazioni nel citosol e nel lec (quindi ambiente interno ed esterno) di quello ione nell’assunzione che

solo quello ione sia permeabile.

F è la costante di faraday. Questa costante che ha le grandezze di millivolts vale 25,3 e significa che quando il

rapporto esterno su interno vale 1 la differenza di potenziale elettrico vale 12,3 mV.

Se la membrana è permeabile soltanto a uno ione la differenza di potenziale elettrico si avrà. Questa

differenza di potenziale elettrico può essere direttamente predetta attraverso l’equazione di Nernst e

rappresenta una condizione costante nel tempo.

Se facciamo riferimento a questo sistema sperimentale otteniamo :

Sono diversi i valori di millivolts quanto diverse sono le concentrazioni perché è la differenza di potenziale

chimico che spinge gli ioni in primis ed è la differenza di potenziale elettrico che respinge gli ioni man mano

che il sistema evolve.

Quindi tanto più saranno sbilanciate quelle concentrazioni tanto più la differenza di potenziale elettrico sarà

alta.

Se noi guardiamo Ei e lo confrontiamo con Em siamo lontani cioè in nessuno di quei tre casi il voltaggio di

membrana è prossimo allo stadio di Nernst per lo ione sodio.

! La differenza di voltaggio si ha in relazione alla mobilità dello ione ed essendo un solo ione che si muove è

chiaro che si porterà in modo netto carica da una parte lasciando in difetto l’altra.

Se guardiamo la quantità di carica positiva sul lato intracellulare e la confrontiamo con la quantità di carica

negativa sul lato extracellulare è ugualmente elettroneutro ma le cariche sono separate.

Membrana permeabile soltanto al potassio

La membrana separa le soluzioni dove la concentrazione di potassio è 182 mM nell’ambiente intracellulare e

5mM nell’ambiente extracellulare. Il liquido intra ed extracellulare è elettroneutro.

In che direzione tenderà a spostarsi il potassio ? dall’interno verso l’esterno. L’energia libera di gibbs va

diminuendo questo porta carica positiva all’esterno.

All’equilibrio :

Queste cellule hanno membrane più permeabili al potassio : la membrana avrà una differenza di potenziale

elettrico che è tanto più prossimo al potenziale di Nernst dello ione più permeabile.

Ma ci arriva quel valore di voltaggio? No perché la membrana è permeabile a tutti gli ioni ma con

permeabilità diverse.

Quindi quella differenza di potenziale elettrico sarà tanto più vicino al potenziale di Nernst dello ione più

permeabile e tanto più lontana rispetto allo ione più impermeabile.

In presenza di uno ione non permeante

Consideriamo soltanto uno ione non permeante e gli altri ioni coinvolti sono permeanti.

Come faccio a considerare un solo ione non permeante? Considero il fatto che quella membrana sia non

permeante per quello ione mentre per tutti gli altri lo sia.

Nell’ambiente extracellulare la coppia catione anione è il potassio cloruro mentre nell’ambiente intracellulare

la coppia catione anione è potassio pr – (intendo una proteina : una proteina è una molecola che non

permea la membrana plasmatica).

Il potassio e il cloruro sono permeanti, pr- non è permeante.

La soluzione di sinistra è elettroenutra e anche quella di destra.

Tra potassio e cloruro quale ione aspettiamo che si metta in movimento? Il potassio non si mette in

movimento perché non esiste una differenza di concentrazione fra questo e quell’ambiente. Uno ione che

sperimenta una forza chimica che lo potrebbe mettere in movimento è lo ione cloruro.

Osserviamo movimento di cloruro dall’esterno verso l’interno nella direzione dei potenziali chimici

decrescenti.

Quindi chimico diminuisce da sinistra verso destra e quella è la direzione del movimento del cloruro.

Dm

Il cloruro spostandosi porta carica negativa sulla faccia di arrivo (intracellulare) lascia una lacuna di carica

negativa sulla faccia extracellulare.

Guardando questa situazione dal punto di vista del potassio succede che questo si sposta lungo la direzione

di un elettrico decrescente. Quando il potassio si sposta quest’effetto diminuisce la differenza di

Dm

potenziale elettrico e questo stimola il movimento di altro cloruro.

Possiamo pensare di arrivare nelle condizioni di equilibrio di Nernst? Allora se il cloruro fosse l’unico ione

permeante (e non anche il potassio) arriveremo alla condizione di equilibrio di Nernst (perché il voltaggio

negativo impedisce il passaggio di altro cloruro e quindi arriveremo a una condizione in cui chimico e

Dm Dm

elettrico diventano uguali e contrari.

Ma questo non è il caso perché essendo anche il potassio permeante, il potassio si sposta secondo la

differenza di potenziale elettrico ma questo movimento tende ad annullare quella differenza di potenziale

elettrico che impedirebbe il movimento anche del cloruro.

Il movimento di uno ione in presenza di altri ioni movibili è agganciato al movimento di altri ioni attraverso

effetti chimici ed effetti elettrici.

Quindi alla domanda se possiamo arrivare alla condizione di equilibrio di Nernst → la risposta è si.

Ma questo equilibrio di Nernst si deve verificare simultaneamente sia per il potassio che per il cloruro?

All’equilibrio detto di Gibbs Donnan (che ricorda l’ineguale ripartizione degli elettroliti attraverso la parete

del capillare dovuto alla presenza di proteine nel sangue e non nel Lec). Quando si raggiunge la condizione

di equilibrio di Gibbs Donnan avremo che il totale del potassio e il totale del cloruro saranno

Dm Dm

simultaneamente uguali a 0 (metto a sistema le due espressioni). Scrivendo a sistema tot del cloruro e

Dm Dm

tot del potassio risolti simultaneamente uguali a 0 rappresenta proprio la condizioni di equilibrio dove sono

coinvolti due ioni permeanti.

L’equilibrio elettrochimico si raggiunge quando il utilizzabile per il movimento va a 0.

Dm

La condizione di equilibrio si raggiunge quando il rapporto di concentrazione tra potassio esterno su

potassio interno vale come il rapporto di concentrazione tra cloruro interno e cloruro esterno.

Quindi è il prodotto della concentrazione di potassio esterno moltiplicato il cloruro esterno ad essere uguale

al potassio interno moltiplicato il cloruro interno.

In questa nuova condizione di equilibrio a cui il sistema è arrivato vale che è il prodotto della concentrazione

catione per anione interno ed esterno, quando le concentrazioni si modificano fino ad arrivare a questa

condizione il sistema è arrivato all’equilibrio di Nernst (elettrochimico).

Vediamo cosa succede in termini di quantità totale di carica. Se guardiamo alla quantità totale di carica

dovremo considerare la carica positiva data dal catione (potassio), la carica negativa data dallo ione cloruro

ma anche la carica negativa data dal pr-.

Quindi all’interno avremo che, per il principio di elettroneutralità, dal momento che del potassio entra

all’interno, la concentrazione di potassio all’interno corrisponderà alla concentrazione totale degli anioni

(cioè concentrazione di cloruro + pr-) cioè la concentrazione interna di potassio sarà maggiore della

concentrazione interna di cloruro. E la somma della concentrazione interna di potassio e concentrazione

interna di cloruro complessivamente sarà maggiore della concentrazione esterna di potassio +

concentrazione esterna di cloruro.

Questo vuol dire che l’ambiente extracellulare tende a perdere sali mentre l’ambiente intracellulare tende ad

acquistare sali.

Nel compartimento dov’è presente l’anione non diffusibile (tipicamente pr-) la concentrazione di ioni

diffusibili tende ad essere maggiore.

L’ambiente extracellulare tende a perdere sali, quello endocellulare ad acquistarli.

L’ATPasi di membrana con il trasporto inequivalente di Na+ e K+ compensa l’effetto iperosmotico :

mantenimento di uno stato stazionario osmotico

La sodio potassio ATPasi mantiene uno stato stazionario osmotico perché l’ATPasi di membrana contrasta

continuamente l’effetto di Gibbs Donnan che tenderebbe a rendere il citosol iperosmotico rispetto

all’ambiente esterno e riesce perché trasporta tre ioni all’esterno contro due ioni che porta all’interno.

Se si avvelena la sodio potassio ATPasi la cellula si gonfia.

Il calore che le cellule producono perché non accoppiano perfettamente la reazione esoergonica dell’idrolisi

di ATP con la reazione endoergonica dei gradienti ionici è legato anche al mantenimento continuo

dell’equilibrio osmotico perché i citosol tenderebbero ad essere iperosmotici rispetto al liquido esterno

anche per effetto Gibbs Donnan.

Queste due soluzioni sono elettroneutre, non sono all’equilibrio di Gibbs Donnan. Vanno all’equilibrio di

Gibbs Donnan quando del cloruro si sposta e anche quando il potassio si sposta.

Sia il cloruro che il potassio si sposterebbero portando ad una condizione di equilibrio elettrochimico.

Consideriamo il movimento del cloruro : la situazione evolve fino alla condizione di equilibrio quando b

moli/litro di cloruro si sono spostate da dove il cloruro è più concentrato a dove il cloruro è meno

concentrato.

Quest’effetto comporterà un riassestamento delle concentrazioni iniziali che tenderanno verso le

concentrazioni finali e queste concentrazioni finali saranno quelle caratteristiche dell’equilibrio di Gibbs

Donnan.

All’equilibrio la concentrazione di cloruro esterno sarà lo 0,1 M iniziale – b moli/litro che si sono spostate.

Il potassio segue il cloruro per mantenere l’elettroneutralità di questo processo.

Quindi se si spostano b moli/litro in questa direzione si sposteranno anche b moli/litro in questa direzione di

potassio. Ma noi sappiamo che il cloruro si muove per differenza di potenziale chimico, il potassio si muove

per differenza di potenziale elettrico.

Quindi il potassio esterno anch’esso diminuirà da 0,1 M (concentrazione iniziale) a 0,1 M – b concentrazione

finale. Il potassio è andato a finire sul lato interno quindi la concentrazione di potassio interna varrà 0,1 M

iniziale + quelle b moli/litro che sono arrivate.

Questo è il sistema che è risolto simultaneamente secondo b → come faccio ad estrarre il valore di b ? lo

faccio imponendo quella relazione che io so esistere tra le concentrazioni interne ed esterne di potassio e di

cloruro quando il sistema ha raggiunto l’equilibrio di Gibbs Donnan.

Quindi adopero le concentrazioni all’equilibrio imponendo la condizione di equilibrio Gibbs Donnan per

calcolare b.

Secondo l’equazione Gibbs Donnan avrò potassio interno = 0,1 + b per cloruro interno = b = potassio

esterno = 0,1 -b per cloruro estreno = 0,1-b

Voglio arrivare alla predizione alla differenza del potenziale elettrico che si è stabilita quindi adopererò

queste concentrazioni all’equilibrio di Gibbs Donnan mettendo queste concentrazioni dentro l’equazione di

Nernst e vedrò quindi quant’è la differenza di potenziale elettrico che corrisponde al raggiungimento

dell’equilibrio di Gibbs Donnan.

Ricalcoliamo le concentrazioni togliendo agli 0,1 lo 0,333.. o aggiungendo allo 0,1 lo 0,333.. si ottengono le

nuove concentrazioni di equilibrio.

L’equilibrio lo raggiungerò in modo simultaneo per quanto riguarda il potenziale di equilibrio del potassio

con potenziale di equilibrio del cloruro.

Sia che io adoperi le concentrazioni di potassio mettendole dentro l’equazione di Nernst per il potassio, sia

che io prenda le concentrazioni di cloruro e le metta dentro l’equazione di Nernst per il cloruro le due

soluzioni devono essere identiche.

Il voltaggio di membrana (Em) sarà RT/F … faccio lo stesso ragionamento per il cloruro e metto il meno – perché quel z vale

-1

Quindi predico la stessa differenza di potenziale elettrico tra faccia esterna e faccia interna della membrana

sia se la guardo utilizzando le concentrazioni all’equilibrio di Gibbs Donnan del cloruro sia che io considero le

concentrazioni all’equilibrio di Gibbs Donnan del potassio.

-18 mV è molto più depolarizzato di -70 mV e di -90 mV. Il segno è lo stesso sempre meno.

Quel paradigma tale per cui la faccia esterna della membrana è a voltaggio positivo e la faccia interna della

membrana è a voltaggio negativo è confermato anche dalla condizione di Gibbs Donnan così come lo

osserviamo per quei potenziali a riposo della cellula.

L’assone gigante del calamaro, la fibra muscolare striata miocita di un mammifero, fibra muscolare striata

miocita di anfibio, queste tre cellule sono cellule chiamate altamente iperpolarizzate perché sono cellule

eccitabili.

Se prendessi in esame per esempio una cellula epiteliale troverei dei valori di potenziali di membrana che

sono molto caratteristici di equilibrio di Gibbs Donnan. Ci sono casi all’interno dei sistemi cellulari dove i

potenziali di membrana coincidono o sono molto prossimi al potenziale di Gibbs Donnan.

In quel -70 mV ci stanno i -18 mV dell’equilibrio di Gibbs Donnan, nei -90 mV ci stanno i -18 mV

dell’equilibrio di Gibbs Donnan e qualcos altro in più …

Con questo esempio abbiamo capito che quando sono presenti più gli ioni permeanti il potenziale di

membrana si assesta a dei valori caratteristici per l’uno e per l’altro ione. Possono raggiungere condizioni di

equilibrio. Inoltre il movimento di uno ione interferisce con la mobilità dell’altro ione.

Membrana permeante a due ioni

Ora consideriamo due ioni permeanti.

Consideriamo di volta in volta che tra i due ioni permeanti, uno sia più permeante dell’altro : condizione

intermedia a quella di equilibrio di Gibbs Donnan (perché nell’equilibrio Gibbs Donnan potassio e cloruro

sono tutti e due ugualmente permeanti) intermedia tra queste è l’altra estrema cioè la condizione di Nernst

dove uno ione è quello permeante.

Imponiamo la condizione che la permeabilità al sodio sia maggiore della permeabilità al potassio.

Il sodio si sposterebbe dall’esterno verso l’interno, il potassio si muoverebbe dall’interno verso l’esterno.

Il sodio porta dentro carica positiva, il potassio porta fuori carica positiva. Se quelle due permeabilità fossero

uguali e le differenze di concentrazione sono grossomodo uguali quei due movimenti si avrebbero ma

avrebbero intensità uguale e contraria → non ci sarebbe nessun effetto elettrico netto.

Considero quindi che il sodio sia più permeante del potassio e che ugualmente il potassio sia permeante.

Si sposta il sodio, questo porta dentro carica positiva e lascia una lacuna di carica negativa. Questa differenza

di potenziale elettrico deprime il movimento di sodio dall’esterno verso l’interno ma la differenza di

potenziale elettrico stimola il flusso di potassio dall’interno verso l’esterno.

Muovendosi il potassio scarica quella differenza di potenziale elettrico ma il movimento di sodio dall’esterno

verso l’interno la ricarica.

Vediamo dal punto di vista del potassio : il potassio si sposterà dall’interno verso l’esterno e porterà fuori

carica positiva. Questo lascerà una lacuna di carica positiva quindi un voltaggio negativo.

La stimola il flusso di sodio che avverrebbe per differenza di potenziale chimico dall’esterno verso

Dy

l’interno. Ma il flusso di sodio dissipa quella differenza di potenziale elettrico mentre il flusso di potassio la

rigenera.

Quindi il potenziale di membrana è un potenziale che dobbiamo definire come potenziale di diffusione

perché dipende dalla continua diffusione degli ioni, più ioni simultaneamente che siano lontani dall’equilibrio

elettrochimico.

Anche se queste diffusioni di ioni tenderebbero a far coincidere concentrazioni interne ed esterne di uno

ione e quindi il liquido intercellulare ed extracellulare sarebbero perfettamente rimescolati tra loro questo

non succede perché la sodio potassio ATPasi mantiene costantemente le concentrazioni in stato stazionario.

Alla base di tutto c’è la sodio potassio ATPasi che mantiene allo stato stazionario i gradienti chimici di sodio e

di potassio tra l’ambiente intra ed extracellulare.

La membrana cellulare ha una permeabilità diversa fra uno ione rispetto all’altro e in base a questo si

stabilisce un potenziale di diffusione.

QUINDI : il potenziale di membrana a riposo è un potenziale di diffusione dovuto a più ioni con permeabilità

diversa che si spostano secondo potenziali elettrochimici decrescenti mantenuto allo stato stazionario dalla

sodio potassio ATPasi.

Non è una situazione di equilibrio ma è una situazione costante nel tempo perché si accoppia sempre al

flusso attivo (dovuto alla sodio potassio ATPasi) i flussi passivi degli ioni che si muovono secondo i gradienti

elettrochimici decrescenti (ma la permeabilità di questi ioni è diversa per quanto riguarda la membrana

plasmatica).

I fenomeni di permeabilità sono associati alla presenza di canali ionici cioè proteine intrinseche di

membrana che definiscono nella loro struttura un canale di permeazione ione-specifico.

A definire la permeabilità diversa per il sodio e per il potassio di quella membrana sarà l’efficienza con cui il

canale per il sodio o il canale per il potassio media il movimento dello ione stesso (cioè quanto più è efficace

il canale nel trasferire ioni) ma anche il numero totale di canali per unità di superficie di membrana,

considerando che ciascun canale ha una sua caratteristica permeabilità..

Questi canali ionici sono definiti canali ionici di likaege : canali che determinano la fuoriuscita degli ioni

rispetto ai compartimenti, che non rendono totalmente impermeabile la membrana.

J = - U c d/dx RT lnc + z y

Na

Na Na Na F

J = - U c d/dx RT Inc + z y

K

K K K F

J = - U c d/dx RT Inc + z y

Cl Cl Cl

Cl F

Queste tre equazioni differenziali devono essere risolte simultaneamente cioè devo fare un ragionamento

che parte dalla valutazione dei flussi simultaneamente di tutti gli ioni potenzialmente coinvolti e poi porre

una condizione fondamentale → la sommatoria del flusso di cationi più sommatoria del flusso degli

(SJ)

anioni = 0.

(Sj-)

Bisogna che la quantità di ioni che si sposta attraverso la membrana sia uguale per quanto riguarda i cationi

e gli anioni in modo tale che anche attraverso il doppio strato lipidico mantengo una condizione di

elettroneutralità.

Non abbiamo delle soluzioni in cui ci siano più cationi che anioni perché il citosol è elettroneutro (tanti

cationi tanti anioni), il LEC è elettroneutro.

L’elettroneutralità deve essere mantenuta anche per quanto riguarda il doppio strato lipidico con la

differenza che la quantità di carica positiva che trovo su una faccia è uguale e contraria alla quantità di carica

negativa che trovo sull’altra faccia. Ma globalmente in termini di movimento di materia non c’è un

movimento netto è come se la membrana separasse tra tutti i movimenti possibili privilegiando quelli più

probabili in relazione al numero di canali di likaege che sono presenti e alla loro efficienza per quanto

riguarda i cationi e gli anioni.

La membrana ha una permeabilità differenziata rispetto agli ioni, dovuta ai canali ionici di likaege (che

sono specifici per sodio, specifici per potassio) che conferiscono alla membrana plasmatica valori di

permeabilità diversa che dipendono dalle caratteristiche del singolo canale likaege più il numero di canali

likaege espresso per unità di superficie di membrana.

Bisogna quindi sempre tenere in considerazione le proprietà intrinseche dei canali likaege e il numero di

canali espressi per unità di superficie. Da qui scaturisce la diversa permeabilità della membrana agli ioni e gli

ioni muovendosi in relazione al potenziale chimico definiscono una differenza di potenziale elettrico in

condizioni di stato stazionario.

Per ricavare l’equazione generale del potenziale di membrana a riposo partiamo dalla valutazione dei flussi di

ogni singolo ione iesimo visti attraverso l’equazione di Teorell derivando il potenziale elettrochimico secondo

x e imponendo la condizione di flusso complessivo di carica pari a 0.

La descrizione quantitativa del potenziale di membrana a riposo cioè quell’oggetto che ci permette di predire

i valori in millivolts di quella differenza di potenziale elettrico, questa equazione la otteniamo attraverso la

valutazione dei flussi di tutti gli ioni permeanti nell’assunzione di una membrana omogenea e campo

elettrico costante (cioè il potenziale diminuisce linearmente secondo fra la faccia esterna e la faccia

Dx

interna della membrana).

L’equazione di Goldman-Hodgkin-Kats è anche detta di campo costante per rimarcare l’importanza di

campo elettrico costante.

Si basa sulla condizione di elettroneutralità cioè si basa sulla condizione tale per cui la sommatoria dei flussi

dei cationi iesimi più la sommatoria dei flussi degli anioni iesimi sia uguale a 0.

RT/zF è quel valore di costante che conferisce le dimensioni dei Volt.

Sommatoria della concentrazione dei cationi nell’ambiente 1 (cioè extracellulare) ma la concentrazione di ogni

catione è moltiplicata per la permeabilità di quello stesso catione più la sommatoria delle concentrazioni degli

anioni nell’ambiente 2 (cioè intracellulare).

Per i calcoli generalmente si adottano i valori di permeabilità relative : i valori di permeabilità di ogni singolo

ione normalizzata relativa rispetto alla permeabilità di uno ione di riferimento (allo ione di riferimento diamo

valore di permeabilità 1 gli altri ioni avranno permeabilità relative che potranno essere maggiori o minori di

1).

La permeabilità relativa è normalizzata a quella del potassio quindi P /P = 1 mentre la permeabilità relativa

K K

del sodio vale P /P = 0,013 (cioè il sodio è permeabile solo l’1,3 % rispetto a quanto sia permeabile il

Na Na

potassio).

La permeabilità del cloruro relativamente al potassio vale P /P = 2 (vale doppio).

Cl Cl

Queste permeabilità relative che sono diverse dipendono da proprietà di permeabilità intrinseche ad ogni

singolo canale ionico e dall’abbondanza relativa dei canali ionici relativi ad ogni singolo ione.

Il potenziale di membrana a riposo sarà tanto più vicino al potenziale di Nernst dello ione più permeante.

Il cloruro è stato omesso perché il potenziale di membrana coincide con il potenziale di equilibrio del cloruro

(il cloruro è all’equilibrio elettrochimico a quei valori di voltaggio) e per rimarcare il fatto che a contribuire al

potenziale di membrana a riposo sono quegli ioni che sono permeanti e non si trovano all’equilibrio

elettrochimico.

Si ottiene -89 mV che è una predizione molto prossima ai -90 Mv.

Cosa succederebbe se quei valori di P aumentassero per un certo ione? Il voltaggio sarebbe lo stesso? Em ?

Vm sarebbe lo stesso? No ma si assesterebbe verso valori più prossimi al potenziale di Nernst dello ione che

è diventato più permeante.

Cosa può far cambiare la permeabilità? L’espressione dei canali linkaege oppure i canali ionici voltaggio-

dipendenti o canali ionici stimolo-dipendenti o canali ionici ligando-dipendenti, cioè canali ionici che sono

chiusi in una certa condizione a riposo e si aprono quando vale il voltaggio legano una sostanza oppure sono

deformati meccanicamente e generano delle variazioni rispetto alla condizione di riposo.

La membrana la vediamo come un’interfaccia che separa un ambiente che

è elettroneutro (tanti cationi tanti anioni) nel liquido extracellulare da un

altro ambiente elettroneutro (il citosol) con tanti anioni tanti cationi.

Elettroneutralità tra la faccia esterna e quella interna.

Per avere movimento di ioni deve esistere una forza elettromotrice perché

deve esserci una forza che sostiene il flusso J. Inoltre è molto interessante

considerare il flusso J perché dal momento che abbiamo un flusso di

materia che è una carica formale, al flusso J lo posso associare una

corrente elettrica.

Se questo è il flusso di particelle avrò anche una corrente in che è data

dalla valenza ionica moltiplicata per la costante di Faraday.

Per muovere una corrente elettrica misurata in Ampere insieme al

conduttore deve esserci anche il generatore di forza elettromotrice.

La membrana per la sua porzione lipidica rappresenta un dielettrico che mantiene separate delle cariche

quindi ogni elemento superficiale di membrana si comporta come un condensatore elettrico.

Quindi quei valori di permeabilità diffusionale semplice dell’ordine dei 10 cm al secondo ci ha permesso di

-13

dire che la membrana è un isolante che mantiene separate regioni a voltaggio opposto.

Quindi ogni elemento di membrana rappresenta un condensatore.

L’equazione di GHK permette di calcolare anche il potenziale di Nernst? Si. Equazione di validità generale.

Abbiamo calcolato l’equazione di Goldman-hodgin.. valutando i flussi e imponendo la condizione di

elettroneutralità (=flusso totale 0).

Per ricavare l’equazione di Nernst abbiamo valutato la differenza di potenziale elettrochimico, abbiamo cioè

valutato quando il potenziale elettrico e quello elettrochimico diventavano uguali.

Per la condizione di equilibrio di Nernst il flusso di quel determinato ione che è all’equilibrio elettrochimico

vale 0 perché all’equilibrio elettrochimico lo ione non si sposta più.

Per esempio ricaviamo il potenziale di equilibrio del potassio imponendo flusso di potassio pari a 0 si otterrà

l’equazione di Nernst.

Quanti ioni serve che siano più concentrati su una faccia rispetto all’altra per darci quella differenza di

potenziale elettrico ? Quante devono essere le cariche positive in più (qui) e meno (qui) per darmi il valore di

voltaggio a riposo.

Prendiamo un numero di riferimento plausibile come voltaggio a riposo : 80 mV. -80 mV è la differenza di

potenziale che esiste tra qui e qui. Quella membrana mantiene separate cariche positive da cariche negative,

quella membrana mantiene due facce di un condensatore attraverso un dielettrico dei lipidi di membrana (?)

grazie alla capacità di membrana. La capacità della membrana vale 1 microfaraday per ogni cm valore

2

misurato sperimentalmente prendendo un doppio strato lipidico e facendo un esperimento di capacità

(valore di capacità elettrica del doppio strato lipidico, questo è il valore di capacità del doppio strato lipidico

sia delle membrane naturali che artificiali perché questo dipende intrinsecamente dalla natura lipidica della

membrana).

La capacità elettrica la esprimo come la quantità di carica Q che è separata rispetto a un certo valore di

differenza di potenziale elettrico q/V V= il voltaggio (misurato in Volt) Q = quantità di carica (misurata in

Coulombs). Complessivamente questo rapporto (Q/V) vale 1 microfaraday per cm .

2

Da questo valore di capacità posso calcolare la quantità di carica q che è inegualmente ripartita su una faccia

rispetto all’altra. Posso vedere quanti Coulombs di carica ci sono in più se guardiamo a una carica positiva

sulla faccia esterna rispetto ai coulombs che sono in meno rispetto alla faccia interna (perché se C = q/V

allora q = C x V).

Quindi per ogni cm di membrana ci sono 80 miliardesimi di Coulombs in più sulla faccia esterna di quanto

2

non sia nella faccia interna. Questo se guardiamo la quantità di carica se invece guardiamo il numero di

particelle in termini di ioni : so che una mole di uno ione contribuisce per 96 mila e 500 Coulombs (costante

di Faraday di Coulombs.

Prendo questi -80 x 10 Coulombs al cm e lo divido per il valore della costante di Faraday ottengo 10

-9 2 -12

moli/cm dello ione che è più permeante. Quindi sono 10 moli di potassio in più per ogni cm di

2 -12 2

membrana.

RIASSUMENDO :

FORZA ELETTROMOTRICE

Il circuito elettrico equivalente definisce una combinazione di generatori di forze elettromotrici e di elementi

resisitvi posti in serie fra loro.

Uno ione è spinto a muoversi attraverso un canale likaege perché tende a portarsi al suo equilibrio

elettrochimico. Il generatore di forza elettromotrice è posto in serie.

La combinazione relativa ad un determinato ione è posta in parallelo a quella degli altri ioni che

contribuiscono a Vm.

Quindi alla fine ai due capi di questo circuito ci sarà una differenza di potenziale elettrico che dipenderà da

quanta corrente si muove in questo ramo (che è il ramo lungo il quale si muove la corrente di sodio dovuto

al generatore di forza elettromotrice per il sodio + i canali di likaege per il sodio) questo ramo che è posto in

parallelo rispetto al ramo per il potassio dove gli ioni potassio si muovono attraverso i canali likaege spinti

dal generatore di forza elettromotrice per il potassio più quest’altro per il cloruro.

A questi due capi del circuito elettrico misuro una differenza di potenziale elettrico che è il potenziale di

membrana a riposo.

Quel Vm che abbiamo calcolato attraverso l’equazione di Goldman … e quanto ritrovo qui ai due capi di

questo circuito considerando che questo circuito a sua volta consta di tre componenti : la componente iono

specifica del potassio, la componente iono specifica del sodio, la componente iono specifica del cloruro

ciascuna sostenuta dal suo specifico generatore di forza elettromotrice che è il potenziale di Nernst di

ciascuno ione, ciascuna corrente sostenuta dai canali di likaege.

Quindi la vera forza elettromotrice sarà una combinazione fra la forza elettromotrice dipendente dal

potenziale di Nernst correttta però per la differenza di potenziale elettrico di membrana. Quindi a definire il

movimento dello ione sarà una risultante tra la combinazione del potenziale di membrana a riposo a cui

sottraggo il potenziale di Nernst dello ione.

Questa cosa la sapevamo già perché quando abbiamo detto il cloruro lo considero come ione che

contribuisce al potenziale di membrana quando il suo potenziale di membrana e il potenziale di Nernst

coincidono? No perché la sua forza elettromotrice vale 0. Perché anche se in principio c’è una forza

elettromotrice data dal potenziale di Nernst siccome il voltaggio ai due capi del circuito coincide con il

potenziale di Nernst per lo ione quella forza elettromotrice vale 0, lo ione non si sposta.

Ho costruito un sistema di resistenze poste tra loro in parallelo, in serie a ogni resistenza ho il generatore

ipotetico per quel determinato ione che è il potenziale di Nernst, ma siccome questi elementi di circuito sono

chiusi da questi altri la forza elettromotrice è una combinazione del potenziale di Nernst e il potenziale di

membrana e il potenziale di membrana.

Consideriamo un ramo per volta :

- RAMO POTASSIO : lungo il ramo del potassio si formerà una corrente elettrica con intensità I (detta così

k

perché è una corrente elettrica associata al movimento del potassio e sfrutterà quale resistenza elettrica? I

canali likaege del potassio).

Lungo il ramo del potassio fluisce una corrente I che dipende da g (che è la conduttanza, cioè l’inverso della

k k

resistenza, fornito dal canale di likaege) moltiplicato per la differenza tra il voltaggio di membrana – il

voltaggio di Nernst dello ione.

Quanto più il voltaggio di membrana è lontano dal potenziale di Nernst del potassio tanto più la corrente di

potassio sarà intensa.

- RAMO SODIO : la corrente elettrica associata al movimento del sodio attraverso il canale likaege del sodio

che ha conduttanza g varrà : (V – E ).

Na m na

Perché Vm compare sia nel ramo del sodio che del potassio ? Perché il voltaggio di membrana è sempre lo

stesso.

Quindi queste due scritture ci dicono che si sposterà lo ione che è tanto più lontano dall’equilibrio

elettrochimico a quei valori di voltaggio di riposo di membrana e ci dice che si muoverà di più quello ione

che ha la g maggiore.

La corrente di potassio avviene dal lato intra verso il lato extracellulare. Mentre il sodio tenderà a spostarsi

dal liquido extracellulare all’interno.

La quantità totale di corrente che si muove vale → l’intensità di corrente totale = Ik + Ina = 0.

Per ricavare l’equazione di Goldman… avevamo fatto l’assunzione che la sommatoria dei flussi cationici e

anionici fosse 0. Stessa cosa adesso anche se stiamo considerando solo cationi, consideriamo

complessivamente che la quantità di ioni che si sposta dentro questo circuito sia 0 (tanta ne esce tanta ne

entra).

Poiché I = - I o I + I = 0 I = (V -E )g I = (V -E )g

K Na K Na K m K K Na m Na Na

E potenziale di Nernst g = conduttanza

(V – E )g + (V – E )g = 0

m Na Na m K K

V = (E g + E g )/ (g + g )

m Na Na K K Na K

Se sostituisco i valori nell’esempio indicato a lato Vm = -69 mV che coincide con il valore che abbiamo

calcolato con l’equazione di Goldman ..

Non ho soltanto un modo per esprimere il potenziale di membrana a riposo non ho soltanto l’equazione

GHK che mi permette di predire il valore di voltaggio a riposo ma anche l’equazione del circuito elettrico

equivalente.

Se vogliamo estendere possiamo dire che :

Sommatoria del potenziale di Nernst per ogni singolo ione iesimo moltiplicato per la conduttanza del canale

o della corrente per ogni singolo ione iesimo fratto la sommatoria della conduttanza di ogni singolo ione

iesimo.

I due approcci sono perfettamente identici cioè usare l’approccio del flusso netto = 0 campo costante e

calcolare e derivare l’equazione di Goldman.. oppure usare l’approccio corrente totale = 0 e riferire tutti ai

valori di forza elettromotrice e conduttanza danno un equazione che ci permette anche in questo caso di

calcolare il potenziale di membrana a riposo.

Abbiamo scritto l’equazione di Ohm generalizzata dove abbiamo identificato l’intensità della corrente (I), la

forza elettromotrice (f. e.m.) come differenza tra il voltaggio di membrana e il potenziale di Nernst, la

costante di proporzionalità come conduttanza (g) : si intende conduttanza di singolo canale.

Ora considero l’elemento di superficie di membrana dove non sono presenti canali e quindi la conduttanza

sarà 0.

Se invece ho un canale che in certe condizioni è aperto e in altre chiuso, la conduttanza di questo canale non

sarà la conduttanza del singolo canale ma la conduttanza del singolo canale moltiplicata per la probabilità

che quel canale sarà aperta (se il canale è chiuso infatti la conduttanza non si esprime, se aperto si).

Quindi l’equazione di Ohm generalizzata sarà uguale a l’intensità di corrente è uguale alla conduttanza del

singolo canale per la forza elettromotrice; ma per elemento di superficie di membrana (patch di membrana) :

l’intensità associata alla corrente iesima sarà data da un numero totale di canali ionici di quel patch di

membrana moltiplicata la conduttanza del canale ionico verso lo ione iesimo (ng) quindi la conduttanza

totale contribuita dagli n canali e Po che rappresenta la probabilità che quel canale sia aperto (vale 1 se

considero i canali di likaege, può variare tra 0 e 1 a seconda che il canale sia dipendente da qualche altro

parametro funzionale) Vm - Ei

Canali ionici di likaege

Sono proteine intrinseche di membrana che sostengono questo movimento di ioni attraverso il doppio strato

lipidico.

La struttura del canale per il Potassio è stata ottenuta nel 1998 (Doyle et al.) da Streptomyces lividans.

Questo canale è un tetramero di subunità identiche con un motivo a due eliche transmembrana.

Se guardiamo alle proprietà di permeabilità di questo canale vediamo che la permeabilità del potassio è circa

uguale alla permeabilità del Rubidio che è circa uguale alla permeabilità del Cesio : questi ultimi non sono

ioni fisiologici ma sono stati scelti da questi autori perché sono ioni che hanno il raggio di Pauling (raggio

ionico) molto simile tra loro. Attraverso la scelta di questi tre ioni è stato possibile confrontare l’effetto del

raggio di Pauling di uno ione però per classi simili di raggi ionici.

Hanno quindi preso in esame questa terna di ioni, questo fisiologico (K) e questi due non fisiologici (Rb, Cs) e

hanno visto che le permeabilità sono effettivamente tra loro confrontabili e complessivamente sono sempre

maggiori delle permeabilità che si possono misurare usando degli altri ioni (sempre monovalenti) che hanno

dei raggi di Pauling molto diversi come lo ione Sodio (Na) e lo ione Litio (Li).

Se maggiore è il raggio di Pauling, minore è la densità di carica quindi sarà più bassa la forza di interazione

con l’acqua (se il raggio di Pauling è minore, maggiore è la densità di carica quindi sarà maggiore la forza di

interazione con l’acqua).

Gli ioni entrano in questo canale ionico in forma nuda (anidra) o in forma idratata? Gli ioni si “spogliano”

delle molecole d’acqua ed entrano nel canale.

Disposizione delle molecole d’acqua attorno ad uno ione in soluzione acquosa. Il numero di

molecole d’acqua che si addensando attorno allo ione è tanto maggiore quanto minore, a

parità di carica, è il raggio anidro dello ione. Queste molecole si distribuiscono attorno allo

ione formando dei “gusci” in cui le molecole d’acqua sono più o meno dense (e quindi

compattate), a seconda del diametro dello ione che raggiudono (in figura sono mostrati i

primi due aloni di solvatazione attorno a due ioni di diametro diverso : il Na ed il K ).

+ +

Impegnandosi nel canale ionico lo ione perde l’interazione con l’acqua e viene stabilizzato attraverso delle

interazioni elettrostatiche con residui amminoacidici portati dalla proteina.

Anche se la struttura molecolare di molti canali ionici è oggi conosciuta, il meccanismo della loro selettività è

ancora oggetto di discussione. In prima approssimazione si può ritenere che nella molecola costitutiva del

canale ionico sia presente un condotto (poro) percorribile dallo ione e che questo condotto presenti una

regione critica dove è situato un filtro di selettività che consente il transito solo degli ioni di una

determinata specie. Questo “filtro” non può, tuttavia, essere un semplice restringimento del condotto che

selezioni gli ioni solo in base alla loro dimensione, come ritenuto tempo fa; questa ipotesi (detta “del

setaccio”) non potrebbe assolutamente spiegare perché molti tipi di canali sono permeabili a ioni di grandi

dimensioni (es K ) ed allo stesso tempo impermeabili a ioni di dimensioni minori (Na ).

+ +

Evidentemente, anche se il rapporto dimensionale tra il poro e lo ione deve comunque avere un ruolo

importante nella fenomenologia della selettività, altri fattori devono intervenire perché si determini una

interazione tra lo ione e canale tale che ioni di grosse dimensioni possano permeare ma non altri, addirittura

a dimensioni minori. È naturale aspettarsi che questa interazione sia di natura elettrica poiché le cariche

elettriche caratterizzano sia gli ioni che gli amminoacidi che formano le pareti interne del poro. Non si può

inoltre dimenticare che in soluzione acquosa ogni ione è avvolto da un guscio di molecole d’acqua detto

alone di solvatazione e che queste, essendo dei dipoli, si orientano lungo il campo elettrico generato dallo

ione.

Vediamo il concetto di stabilizzazione dello ione dentro il canale ionico nel filtro di

selettività piuttosto che stabilizzazione dello ione all’interno della sfera acquosa.

L’interazione di uno ione con un canale ionico può essere visto in termini classici di

equilibrio chimico : è proprio questo che definisce il fatto che lo ione preferisca

associarsi al canale ionico piuttosto che associarsi all’acqua, se questo equilibrio non fosse spostato in una

certa direzione quel canale ionico sarebbe inefficace.

In che cosa si traduce questa preferenza dell’interazione con l’acqua rispetto a preferenza con i canali ionici?

La forza di interazione : quanto più l’interazione è forte tanto più l’energia libera di Gibbs dello stato di

transizione si abbasserà.

Viene persa energia nel rilascio dell’acqua (effetto endoergonico) compensata da un effetto esoergonico cioè

il rilascio di energia con l’interazione tra il canale ionico e lo ione stesso.

Questo equilibrio chimico è spostato verso la forma legata per quanto riguarda lo ione potassio mentre lo

ione sodio, che ha un raggio di Pauling inferiore non riesce a intraprendere lo stesso numero di interazioni

con il filtro di selettività del canale ionico. Nel caso dello ione Sodio quindi non abbiamo una uguale

stabilizzazione per il legame dello ione con il canale ionico cosa che non succede per lo ione Potassio.

Nel filtro di selettività sono coinvolti degli ossigeni che formano doppi legami. Una struttura proteica con

ossigeno legato con doppio legame al carbonio la troviamo nel gruppo carbossilico impegnato nel legame

peptidico.

Quello che è stato trovato, attraverso l’analisi cristallografica, è che questi 4 ossigeni sono 4 ossigeni del

legame peptidico e sono sufficienti per dare la discriminazione tra un flusso di sodio rispetto a un flusso di

potassio.

Per il resto dello spazio lo ione interagisce con l’acqua.

Questa struttura per i canali ionici di likaege è stata riconosciuta analoga anche per i canali ionici di altra

natura in particolare per la classe di canali ionici voltaggio-dipendenti. Anche in questo caso ci sono canali

ionici che sono specifici per i diversi ioni ma invece di considerare il fatto che il canale ionico è sempre aperto

in questo caso, il canale ionico è chiuso in una certa condizione e aperto in un’altra. Ciò che discrimina

l’apertura o chiusura del canale ionico (lo stato aperto dallo stato chiuso) è la differenza di potenziale

elettrico transmembrana (quindi canali ionici che cambiano di conformazione in relazione al voltaggio che

essi sperimentano a cavallo della membrana).

SEGNALI ELETTRICI II

La pietra miliare nello studio del meccanismo di insorgenza del potenziale d’azione, quindi nella

comprensione dell’eccitabilità cellulare, è stata posta da due studiosi inglesi : Alan Hodgkin e Andrew Huxley,

verso la fine degli anni ‘40 del secolo scorso.

Hodgkin e Huxley disponevano in quegli anni della tecnica del voltage clamp e la applicarono su un

fortunato preparato sperimentale il cui utilizzo è diventato paradigmatico nell’intera elettrofisiologia :

l’assone gigante del calamaro. Questo cefalopode possiede due processi assonali lunghi qualche

centimetro e del diametro di quasi 1 mm che percorrono la parte sottostante il mantello e servono, con la

loro rapida attivazione elettrica, a promuovere la propulsione a getto d’acqua attraverso il sifone, utilizzata

dal calamaro per le reazioni di fuga.

L’assone gigante del calamaro, con le sue dimensioni e le sue proprietà eccitabili, forniva già dagli anni 1930

un substrato particolarmente adatto agli studi elettrofisiologici, utilizzato dagli statunitensi Cole e Curtis per

la possibilità di inserire longitudinalmente al suo interno un lungo elettrodo metallico filiforme.

Questo esperimento di stimolazione elettrica è applicabile sia a una cellula qualsiasi sia a una cellula

eccitabili.

Osserviamo il millivolmetro, l’elettrodo di riferimento, l’elettrodo di misura, e poi un elettrodo di riferimento

e un elettrodo attraverso il quale iniettiamo della corrente. Questa corrente è iniettata a partire da un

generatore di corrente esterno.

Quest’esperimento equivale ad iniettare corrente all’interno di un circuito resistivo capacitivo considerando

che la corrente iniettata a un capo del circuito si distribuirà lungo i rami del circuito resistivo capacitivo e

modificherà le differenze di potenziale elettrico che osservo ai capi del circuito.

Lo stimolo che viene applicato ha la forma di uno scalino di corrente.

Voglio vedere se questo è il decorso temporale della corrente iniettata come varia il voltaggio nel tempo,

come si modificherà quella proprietà che ho definito proprietà di membrana a riposo quando la membrana

non è più a riposo perché è interessata a una corrente elettronica (negativa).

Altra cosa da considerare è l’esterno e l’interno della cellula : posso mettere gli elettrodi in modo tale da

scaricare una corrente negativa diretta dall’interno verso l’esterno e questa corrente negativa come ci

aspettiamo modifichi il potenziale di membrana? Stanno viaggiando elettroni quindi cariche negative che si

stanno spostando in virtù della loro presenza nell’elettrodo e in virtù delle loro mobilità attraverso il

dielettrico, questi elettroni si stanno muovendo da una regione a voltaggio negativo verso una regione a

voltaggio positivo, quella differenza di potenziale diminuirà. In questo modo la corrente iniettata è una

corrente negativa outward (perché negativa rivolta verso l’esterno) ed è una corrente depolarizzante (E m

diventa meno negativo = depolarizzazione).

L’esperimento lo posso fare anche in modo opposto : in questo caso faccio scorrere una corrente negativa

inward, quindi sono cariche negative che si spostano da una regione a voltaggio più positivo verso la regione

a voltaggio più negativo (E diventerà più negativo = iperpolarizzazione).

m

QUINDI : innesco la corrente → guardo il sistema arrivare a un nuovo stato stazionario → vedo dove si

colloca il valore di voltaggio quando il sistema ha raggiunto il nuovo stato stazionario.

Ora non guardiamo soltanto dove si assesta nella nuova condizione di stato stazionario il voltaggio, ma

guardiamo anche con che cinetica questa modificazione avviene cioè come varia il voltaggio in funzione del

tempo.

1

2

Nel grafico in alto (1) è rappresentata la risposta del potenziale di membrana (DV ) a un impulso rettangolare

m

di corrente. L’andamento della risposta (linea c) presenta insieme le caratteristiche di un elemento

puramente resistivo (linea a) e quelle di un elemento puramente capacitivo (linea b)

Nel grafico in basso (2) è rappresentato lo scalino di corrente : prima la corrente non c’è, poi la corrente

viene iniettata, rimane applicata per un certo intervallo di tempo, poi la corrente viene rimossa, infine

mantengo la membrana monitorata nel tempo.

La corrente ha la forma di uno scalino perché quando comincio ad iniettare corrente, la corrente prima andrà

a distribuirsi lungo il ramo capacitivo (quindi avremo un immediato raggiungimento della capacità massima

del condensatore) e poi la corrente del ramo capacitivo comincerà a decadere a favore della corrente che si

muoverà lungo il ramo resistivo.

Questo è il tipico comportamento di un circuito resistivo capacitivo dove condensatore e resistore sono posti

tra loro in parallelo.

Lo scalino di corrente c’è anche quando rimuovo la corrente perché all’inizio avremo una corrente intensa

che viene dal ramo capacitivo quando il condensatore si scarica e questo fa fluire corrente lungo il ramo

resistivo.

La corrente totale della membrana (I ) è rappresentata dalla linea continua, la linea tratteggiata illustra

m

l’andamento temporale della corrente I quella che fluisce lungo il ramo resistivo, e I quella che fluisce lungo

i c

il ramo capacitivo.

I da 0 salta al valore massimo perché il condensatore si carica immediatamente e a condensatore carico la

C

corrente non passerà più attraverso il condensatore ma verrà sempre più privilegiata per quel ramo che fa

più fatica a condurla (quello resistivo) ma dove però l’assenza di un dielettrico e la presenza di un conduttore

permetterà il continuo passaggio di questa corrente. È una corrente favorita subito che però decade a favore

dell’altra.

(figura in alto → curva spezzata)

Per quanto riguarda il voltaggio esso si modifica secondo un andamento monotono cioè secondo una

funzione continua nel tempo. Perché a partire dal tempo 0, quando cominciamo a far fluire corrente, il valore

di voltaggio si modifica e dal valore V (voltaggio al tempo 0) si assesta ad un valore finale V e rimane al

0 f

valore V per tutto il tempo durante il quale lo stimolo di corrente rimane applicato.

f

Quindi osserviamo un andamento che ha una sua caratteristica funzione temporale, una funzione continua

nel tempo (fintanto che la corrente è continuamente somministrata).

È chiaro che c’è un punto di discontinuità in quella funzione a causa del decadimento di quest’effetto sul

voltaggio che si ha durante il tempo nel quale lo stimolo di corrente è stato rimosso.

Quindi alla somministrazione di uno stimolo di corrente il voltaggio risponde secondo un andamento che ha

una funzione monotonica rispetto al tempo e che ha un andamento di un certo tipo nella fase di

somministrazione di corrente e che ha un andamento speculare nella fase di desomministrazione della

corrente.

! Questo scalino di corrente è uno scalino positivo. Per convenzione uno scalino di corrente positivo significa

la somministrazione di una corrente depolarizzante. Quindi quel valore V quello al valore di plateau, sarà più

f,

positivo del valore di riposo : cioè una corrente positiva è una corrente depolarizzante, quel voltaggio sarà

meno negativo.

Quindi abbiamo una membrana che ha un certo valore di potenziale, inietto una corrente che fa andare

questo potenziale verso valori meno negativi (è una corrente depolarizzante).

Vedo che nel tempo questo valore di voltaggio cambia secondo quel tipo di funzione.

Se somministro una corrente iperpolarizzante ottengo l’effetto opposto : nel tempo vedo che il valore di

voltaggio si assesta verso valori più negativi.

Il valore di voltaggio è compreso tra il valore V (valore al tempo t = 0; V è il valore di voltaggio di

0 0

membrana a riposo) e V (valore di voltaggio finale cioè quando l’effetto si è completato).

f

Posso definire allora una funzione che mi descriva, in funzione del tempo, il passaggio dal valore di riposo a

quello finale e posso anche definire una funzione che mi descriva, in funzione del tempo, il passaggio da quel

valore finale a quello di riposo.

Quando chiudo il circuito e non somministro più corrente depolarizzante o iperpolarizzante, il voltaggio

torna al valore di riposo → quindi quest’effetto di perturbazione è perfettamente reversibile.

Distinguo la fase di depolarizzazione da quella di iperpolarizzazione.

FASE DI DEPOLARIZZAZIONE

Il valore di voltaggio di membrana, in funzione del tempo, vale :

V = V + (V – V ) (1 – exp -t/t) exp -t/t = e -t/t

m 0 f 0

Vuol dire che → la membrana parte da un valore iniziale V compie un salto di voltaggio totale che è pari a (V

0 f

– V ) che è moltiplicato (1 – exp -t/t). Avere 1 – l’esponenziale negativo del tempo vuol dire che quella è una

0

funzione crescente del tempo.

FASE DI RIPOLARIZZAZIONE

Il valore di voltaggio di membrana, in funzione del tempo, vale :

V = V + (V – V ) (exp -t/t) exp -t/t = e -t/t

m 0 f 0

Manca (1 - ) perché è un esponenziale negativa.

t è una costante detta costante di tempo → unità di misura espressa in secondi.

È una costante intrinseca, uguale al prodotto della resistenza della membrana per capacità della membrana :

semplifico volts con volts

ampere alla -1 significa reciproco della

corrente = secondi su columbs

semplifico coulombs con coulombs =

secondi t :

Pongo che il tempo t abbia un valore in secondi pari a

Questo V – V è il salto totale di voltaggio che viene compiuto quando il sistema raggiunge un nuovo stato

f 0

stazionario.

Vediamo come V cambi rispetto a V e come questo sia confrontabile rispetto al salto totale.

m 0

t mi dice che quando V -V è stato coperto per il 63 % del suo valore è passato un tempo pari a secondi.

t

f 0

Quando aspetto un tempo pari a secondi il valore di voltaggio di membrana si è modificato rispetto a

t

quello iniziale fino ad arrivare a un valore pari al 63% del salto totale che viene compiuto.

Nella fase di ripolarizzazioneo lo definisco come il tempo che deve trascorrere affinché la membrana sia

t

ripolarizzata. Il complementare di 63 è 37 → devo aspettare un tempo uguale a t = affinché la membrana

t

dal valore finale si ripolarizzi fino ad arrivare al 37% di quello iniziale.

Le due curve sono speculari : in un caso va al 63% , nell’altro caso ritorna giù del 63% quindi ritrovo il 37%

dell’iniziale.

Non definisco un valore assoluto ma lo definisco relativamente a V -V cioè relativamente al salto di

t f 0

voltaggio complessivo che viene svolto perché quest’esperimento è un esperimento dove gli effetti sono

graduati rispetto all’intensità degli stimoli.

Quindi avrò V -V che saranno diversi tra loro a seconda dell’intensità di corrente che somministro però devo

f 0

essere sempre in grado di definire per questa stessa identica cellula. Quindi non definisco rispetto ad un

t t

valore di voltaggio assoluto ma sempre relativamente a V -V in questo modo il mio esperimento è sempre

f 0

normalizzato a 100 indipendentemente dal salto di voltaggio che faccio che è in funzione dell’intensità di

corrente che somministro.

POTENZIALI ELETTROTONICI

Il potenziale elettrotonico è una qualsiasi variazione del potenziale di membrana a riposo.

Proprietà :

• Un potenziale elettrotonico è tipicamente una variazione del potenziale di riposo che ha le

caratteristiche di risposta graduata : in funzione dell’intensità dello stimolo applicato, viene evocata

una risposta proporzionalmente diversa.

Il potenziale elettrotonico può essere un potenziale depolarizzante o iperpolarizzante.

• La loro intensità (dei potenziali elettrotonici) è proporzionale allo stimolo applicato (stimolo che può

essere depolarizzante o iperpolarizzante, di conseguenza il potenziale elettrotonico sarà

depolarizzato o iperpolarizzato).

Rappresentano risposte passive di membrana durante le quali la conduttanza della membrana

• rimane costante. Sia se consideriamo la conduttanza di singolo canale (g) sia se consideriamo la

conduttanza di un patch di membrana (dove troviamo n canali ionici).

Questi potenziali elettrotonici sono sommabili temporalmente (e spazialmente).

• ! Se sommiamo due potenziali elettrotonici di segno opposto l’effetto sarà bilanciato. Quindi è una

sommazione algebrica.

ESPERIMENTO

Applico a un patch di membrana degli scalini di corrente. È una corrente positiva

quindi è una corrente depolarizzante. Il voltaggio di membrana seguirà quella

funzione esponenziale e si assesterà al voltaggio finale partendo da un voltaggio

iniziale (V ).

0

Il valore di voltaggio finale sarà proporzionalmente più depolarizzato in relazione

all’intensità di corrente che abbiamo iniettato.

Costruiamo un grafico in cui abbiamo l’intensità della corrente e la

rappresentiamo in funzione del voltaggio (la legge di Ohm dice che

l’intensità della corrente e il voltaggio sono tra di loro legati da una

relazione di proporzionalità diretta); la costante di proporzionalità è

proprio la conduttanza (legge di Ohm I = g V).

Infatti se prendiamo questi valori di intensità (1,2,3,4) li mettiamo in

ordinata e in corrispondenza di ciascun valore di intensità di

corrente riportiamo il voltaggio che otteniamo in ascissa, otteniamo

una retta.

La pendenza di quella retta è proprio il valore di conduttanza

(misurata in siemens), cioè l’inverso della resistenza (misurata in ohm).

Questo significa proprio che g è costante durante tutto il decorso dell’esperimento e l’intensità è

proporzionale allo stimolo applicato.

QUINDI in sintesi : Applico uno stimolo depolarizzante → questo farà variare il voltaggio della membrana →

genererà il potenziale elettrotonico cioè la risposta passiva. Questa è comunque una depolarizzazione

reversibile del voltaggio di membrana (V ).

m

(grafico sul quaderno)

In corrispondenza del tempo da V il voltaggio andrà verso Vf. Ci arriva a Vf ? Non si sa dipende da quanto

0

tempo lascio trascorrere perché la membrana si assesti al nuovo voltaggio. Questa quantità variabile di

tempo che devo aspettare (variabile rispetto al tipo di cellula che ho) sarà proprio in relazione alla costante di

tempo di quella determinata membrana di quella determinata cellula.

Se inietto più corrente il voltaggio si sposterà verso valori più depolarizzati sempre secondo la stessa t

perché sto facendo l’esperimento sullo stesso patch di membrana che ha le stesse caratteristiche di

resistenza e capacità.

A questo punto rilascio lo scalino di corrente e la membrana si rilasserà.

Se a questo punto inietto un altro scalino di corrente, il voltaggio di membrana si modificherà nuovamente,

questo valore V sarà più alto di quello precedente perché lo scalino di corrente è stato applicato sulla

f1

membrana che non ha ancora raggiunto il V . L’effetto depolarizzante sarà maggiore perché è un effetto

0

sommato su un effetto che si sta ancora estinguendo.

è sempre la stessa e mi definisce il voltaggio sul quale gli effetti successivi si sommano rispetto agli effetti

t

precedenti.

Se gli scalini di corrente sono separati nel tempo in modo da permettere una corretta riperpolarizzazione i

potenziali elettrotonici saranno sempre della stessa forma e porteranno lo stesso a V .

f

Se gli scalini di corrente sono somministrati ravvicinati gli effetti si sommano, sempre secondo t.

La probabilità di avere questa sommazione temporale (cioè sommazione nel tempo degli effetti di ogni

singolo stimolo) sarà tanto maggiore se è grande o se è piccolo ? Se è grande ci mette di più a

t t t

ripolarizzarsi quindi c’è più possibilità che uno stimolo successivo cada quando la membrana non è ancora

completamente ripolarizzata.

Con potenziali elettrotonici opposti si otterranno effetti opposti, e poi la membrana si ripolarizzerà fino al V 0.

C’è un’intensità limite che si può indurre alla membrana?

Effetto Joule → passaggio di corrente significa anche somministrazione di calore, ma al di là dell’effetto Joule,

le risposte graduate dovrebbero dare lo stesso tipo di risposta indipendentemente dall’intensità che l’ha

generata (a parte l’effetto Joule).

Nel caso delle cellule eccitabili il discorso cambia perché si sovrappone all’effetto elettrotonico, al potenziale

elettrotonico un altro tipo di potenziale.

Questo è quanto succede per le cellule non eccitabili.

Vediamo cosa succede per le cellule eccitabili (neuroni, miociti, cardiomiociti, cellule muscolari lisce).

Le distinguiamo perché sono cellule più iperpolarizzate ma anche perché sanno dare una risposta diversa

rispetto alle altre cellule.

Applichiamo uno stimolo depolarizzante, otteniamo una risposta passiva cioè evochiamo un potenziale

elettrotonico cioè una depolarizzazione reversibile del voltaggio di membrana.

Quindi se facciamo un esperimento in cui misuriamo l’intensità dell’effetto in relazione all’intensità di

corrente depolarizzante ci accorgiamo che, quando immettiamo una quantità di corrente tale per cui il mio

voltaggio finale Vf o il voltaggio durante la depolarizzazione passa attraverso valori cosiddetti voltaggi-soglia

(depolarizzazione-soglia), la risposta diventa attiva.

Con le cellule eccitabili evochiamo potenziali elettrotonici soltanto finché l’intensità della corrente

depolarizzante genera un effetto di depolarizzazione che sta sotto il valore soglia. Se l’intensità della corrente

depolarizzante raggiunge il valore soglia, la risposta non è più un potenziale elettrotonico ma è detta

potenziale d’azione. Anche in questo caso è una risposta totalmente reversibile.

Esperimento di stimolazione elettrotonica con tre scalini di corrente.

d1, d2, d3 vogliono dire corrente depolarizzante 1, 2, 3. V varrà -60 mV, stiamo guardando all’assone di un

0

neurone (porzione detta anche cilindrasse).

A d1 corrisponde un V e ritorno V , con d2 arriviamo a V con ritorno V0. La soglia per questo neurone è

f 0 f

fissata a -40 mV : non occorre che lo stimolo arrivi esattamente come V ai -40 mV, basta che il voltaggio

f

finale permetta il raggiungimento del voltaggio soglia. Sopra i 40 mV il potenziale è detto potenziale

d’azione.

Nel caso A : assone gigante del calamaro, nel caso B miocita cardiaco ventricolare. Anche nel caso B arrivato

alla soglia scatta quest’effetto detto potenziale d’azione. La risposta non è più passiva ma attiva.

Il valore soglia è variabile da cellula a cellula e in funzione dello stato funzionale in cui la cellula si trova.

Si conosce un fenomeno noto come accomodazione della soglia, per cui quella soglia può essere

accomodata verso il basso o verso l’alto. Accomodazione verso il basso vuol dire che la soglia si raggiunge a

valori di voltaggio meno depolarizzati mentre l’accomodazione verso l’alto vuol dire che la soglia si

raggiunge a valori di voltaggio più depolarizzati.

Consideriamo il valore soglia come valore di voltaggio critico al di sopra del quale o in corrispondenza del

quale la risposta attiva sostituisce la risposta passiva.

CARATTERISTICHE RISPOSTA ATTIVA

• Nella risposta attiva il valore di conduttanza g o G non è costante ma è una funzione del tempo e del

voltaggio.

• La forma di questo potenziale d’azione : riconosciamo una fase detta potenziale di riposo, stimolo

efficace (talvolta chiamato prepotenziale), salita rapida con inversione del potenziale (spike),

ripolarizzazione, iperpolarizzazione postuma.

• depolarizzazione , una fase detta inversione del voltaggio (spike), una fase detta ripolarizzazione e

una fase detta iperpolarizzazione (o iperpolarizzazione postuma).

Il potenziale d’azione è un processo tutto o nulla, non è sommabile. Se somministro uno scalino di

• corrente che porta la membrana alla soglia e fa generare il potenziale d’azione, un secondo scalino

di corrente somministrato subito dopo non aumenta i valori di voltaggio del potenziale d’azione.

Quindi non è sommabile.

È un segnale che si può propagare senza attenuazione : concetto che riguarda la propagazione dei

• potenziali siano essi potenziali elettrotonici, siano essi potenziali d’azione.

• Durante il potenziale d’azione la membrana è refrattaria cioè non può essere stimolata nuovamente.

FASI DEL POTENZIALE D’AZIONE

Se guardiamo a un neurone la scala temporale del potenziale d’azione è dell’ordine dei 3,4,5 millisecondi.

I valori di potenziale mostrati dalla membrana sono compresi tra due valori estremi : il più iperpolarizzato

corrisponde al potenziale di equilibrio del potassio, il più depolarizzato corrisponde al potenziale di

equilibrio del sodio.

Nella fase di depolarizzazione il voltaggio passa da valori negativi fino a intersecare la linea di voltaggi 0

cioè per una fase del potenziale d’azione il voltaggio di membrana vale 0.

La fase al di sopra del voltaggio 0 è la fase di inversione : dallo 0 millivolts fino al picco, quel voltaggio di

membrana si è invertito, cioè dal valore di riposo (faccia ext positiva, faccia int negativa) siamo arrivati sul

picco di potenziale d’azione nella condizione invertita cioè faccia ext negativa, faccia int positiva.

Raggiunto quel valore di picco (overshoot o eccedenza) la membrana si ripolarizza (questa è la fase di

ripolarizzazione) in cui il voltaggio interseca i valori di voltaggio di riposo ma il voltaggio cade a valori più

negativi rispetto al riposo per una durata di tempo detta iperpolarizzazione postuma.

Il fatto di vedere il voltaggio passare dal valore soglia iperpolarizzato (molto negativo) a quel valore positivo

cosa fa pensare ? Il valore del voltaggio di riposo rappresenta la conseguenza del fatto che ogni ione tende a

muoversi fino a raggiungere una condizione di equilibrio elettrochimico cioè il movimento di uno ione

imporrebbe alla membrana il voltaggio corrispondente al suo potenziale di Nernst. Siccome la permeabilità è

diversa i valori di voltaggio di membrana si assestano a valori diversi rispetto al potenziale di Nernst.

La fase di depolarizzazione è molto rapida e suggerisce che nella membrana durante la risposta attiva diventi

molto alta rispetto alla condizione di riposo, la permeabilità allo ione sodio.

La permeabilità al sodio aumenta fino ad un valore massimo che è raggiunto in corrispondenza del punto di

overshoot del potenziale. La permeabilità al sodio torna poi ai valori caratteristici del riposo.

Nella fase di ripolarizzazione diventa alta la permeabilità al potassio. La permeabilità al potassio ha un

andamento caratteristico sfalsato nel tempo e questo permette di distinguere i due effetti antagonisti :

l’aumento di permeabilità al sodio determina l’ingresso di sodio, l’aumento di permeabilità al potassio

determina l’uscita di potassio. I due effetti sono spostati nel tempo: prima l’effetto dovuto al sodio poi

l’effetto dovuto completamente al potassio.

La permeabilità al potassio raggiunge il suo valore massimo durante la ripolarizzazione, ma siccome la

permeabilità al potassio rimane significativamente alta anche quando il valore di voltaggio è tornato al valore

di riposo, esso dà questa iperpolarizzazione postuma : cioè osservare una iperpolarizzazione postuma è

dovuto al significativo aumento di permeabilità rispetto alle condizioni di riposo che c’è anche dopo che la

membrana si è ripolarizzata.

Se guardiamo all’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz è una fotografia del voltaggio di membrana costante

perché la membrana è a riposo. Ma quando la membrana esce dalle condizioni di riposo non è detto che tale

equazione non sia più valida ma è necessario modificarla per quello che succede durante la fase di non

riposo.

Quello che succede durante la fase di non riposo è un aumento della permeabilità agli ioni.

Quindi i valori di voltaggio che osserviamo durante il potenziale d’azione sono predicibili in termini di

equazione di Goldman-Hodgkin-Katz (equazione di campo costante), riuscendo a definire momento per

momento quanto è la permeabilità al sodio e al potassio in quel determinato tempo.

Altro modo di rappresentazione del potenziale d’azione è questo:

E’ possibile ricostruire l’andamento del potenziale d’azione dalle variazioni di conduttanza di sodio e potassio

(linea continua) (g e g ) dovute all’apertura e alla chiusura dei canali Na e K voltaggio dipendenti.

+ +

Na K

In linea tratteggiata è possibile osservare il voltaggio di membrana e il potenziale d’azione.

Le variazioni di conduttanza seguono esattamente la forma che abbiamo visto per le variazioni di

permeabilità.

Quando la permeabilità cambia gli ioni si muovono, siccome ogni ione porta della carica elettrica questo

genererà una corrente e questa corrente sarà esprimibile in termini di conduttanza a quella determinata

corrente ionica che la membrana in quel momento ha.

Quindi è possibile predire i valori di voltaggio di membrana tempo per tempo anche durante il potenziale

d’azione usando l’approccio del circuito elettrico equivalente.

Che cosa cambia adesso e definisce i nuovi valori di voltaggio? A cambiare sarà il valore di conduttanza alla

corrente ionica.

Con G-H-K vedevamo variazioni di permeabilità che determinano il movimento di materia, questa materia è

dotata di carica elettrica, questo vorrà dire variazione di conduttanza alla corrente ionica.

È come se quel ramo resistivo acquisisse una resistenza elettrica con un valore più basso di Ohm e questo

permette il passaggio di più corrente. Infatti diminuire la resistenza significa aumentare la conduttanza.

CANALI IONICI A CONTROLLO DI VOLTAGGIO (voltage gated ion channel)

Gated significa che sono aperti in relazione al voltaggio in cui la membrana si trova.

Questi canali hanno il poro di permeazione ione selettivo che è voltage gated cioè aperto in relazione al

voltaggio.

La risposta attiva delle cellule eccitabili dipende dalla presenza di canali ionici la cui conduttanza (o

permeabilità) ionica è modificata da stimoli esterni.

I canali ionici possono essere sempre aperti (canali di leakage), canali voltaggio-dipendenti, canali chemio-

dipendenti aperti da un messaggero extracellulare (neurotrasmettitore), canali chemio-dipendenti aperti da

un messaggero intracellulare (cAMP, Ca , IP , proteina G, ecc).

2+, 3

PARADIGMA STRUTTURALE : uno ione interagisce con l’acqua, uno ione lascia l’acqua e si impegna nel

filtro di selettività, attraverso il filtro di selettività lo ione si sposta nella direzione secondo potenziali

elettrochimici decrescenti.

Nell’architettura molecolare di questi oggetti si definiscono delle regioni chiave della struttura proteica, dove

avvengono tutti i processi grazie ai quali il canale comincia a sostenere l’aumento di permeabilità, la

conduttanza alla corrente ionica.

Osserviamo la rappresentazione assiale di un tipico canale voltaggio-dipendente costituito da 4 subunità

(tetramero), ogni monomero comprende 6 catene polipeptidiche ad alfa-elica.

Osservare le regioni tra la catena 6-5, 6-5 di ciascun monomero che costituiscono una struttura regolare.

Lo schema mette in evidenza il segmento S4 (che è il sensore di voltaggio).

Il modello della “sliding helix” postula che, nello spessore della membrana, le cariche positive del segmento

S4 debbano essere neutralizzate da altrettante cariche negative disposte sui segmenti adiacenti (S3 e S5).

Quindi la forza di interazione elettrostatica tra le cariche positive del sensore di voltaggio e le cariche

negative dei segmenti adiacenti, dipende proprio dalla differenza di potenziale elettrico (quando varia,

cambia la forza di interazione) → la depolarizzazione della membrana provocherebbe un avanzamento

rotatorio del sensore del voltaggio verso l’ambiente esterni, secondo “scatti” di circa 2 ampere.

Se fotografiamo la membrana dove siano presenti n canali ionici, vedremo una distribuzione di proteine che

sono comprese nelle conformazioni chiuse o aperte.

Il processo di gating, che fa passare dalla conformazione chiusa alla conformazione aperta un canale ionico,

va visto come un equilibrio chimico.

Il processo di gating significa CLOSED → OPEN , la conduttanza vale 0, l’unica permeabilità che la membrana

avrà in quel momento dipenderà dal voltaggio e quindi dai canali leakaege.

Definiamo una costante che è la costante che definisce la transizione da closed a open e la costante che

a b

definisce la transizione da open a closed.

! Nessun equilibrio chimico è spostato in una direzione piuttosto che in un’altra.

Quindi la popolazione di n canali ionici, a un determinato potenziale di membrana, sarà compresa tra la

conformazione closed, open, la cui abbondanza sarà diversa a seconda del voltaggio di membrana.

A voltaggi più iperpolarizzati quell’equilibrio chimico è spostato verso la conformazione closed (è questa la

caratteristica della condizione di riposo) in relazione alla costante b.

Quando il voltaggio cambia comincerà a popolarsi la conformazione open perché quell’equilibrio si sposterà

verso destra in relazione alla costante a.

Quindi a voltaggi depolarizzati avremo tanta più probabilità di trovare canali open quanto più alta sarà a.

Quindi quel tipo di equilibrio chimico esprime la voltaggio dipendenza dei canali ionici.

Va considerato anche un’altra cosa: quando il voltaggio passa da valori di riposo a valori più depolarizzati,

per esempio alla soglia o sopra la soglia, si innesca la conversione della popolazione di canali ionici da closed

verso opened, questa transizione avrà una sua determinata cinetica (un suo determinato andamento

temporale → tempo dipendenza).

È la tempo dipendenza della conversione da closed a opened che mi definisce quest’andamento temporale.

Quali sono i canali che rispondono più rapidamente alla variazione di voltaggio? Quelli del sodio. Quelli più

lenti sono quelli del potassio.

Quindi c’è tutto il tempo durante il potenziale d’azione perché predomini l’effetto del sodio, che è più

precoce, rispetto all’effetto del potassio, che è più tardivo.

Cos’è che fa estinguere il valore di permeabilità alta al sodio dovuta ai voltaggi depolarizzati? Il fatto che i

canali per il sodio esistono in una terza conformazione detta inactivated (i canali si inattivano) anche in

questo caso la conversione da closed a open o closed a inactivated è voltaggio dipendente e tempo

dipendente.

Abbiamo descritto il comportamento dei canali ionici voltaggio dipendenti come un processo di variazione

conformazionale che si accompagna a una variazione del voltaggio (differenza di potenziale elettrico

sperimentata dal canale ionico quando esso è associato ad un determinato patch di membrana).

La variazione conformazionale in prima approssimazione quindi riguarda due stati : closed e opened.

Le proteine sono in conformazione closed a valori di voltaggio più iperpolarizzati, mentre la popolazione di

proteine si sposta verso la conformazione opened per valori di voltaggi più depolarizzati.

La conversione dalla conformazione closed alla conformazione opened è legata alla depolarizzazione di

membrana e questo spiega perché la membrana debba essere portata alla soglia di fuoco perché si inneschi

il potenziale d’azione (sotto il potenziale di fuoco abbiamo un comportamento elettrotonico).

Va anche tenuto conto di un altro aspetto : che la variazione di conformazione da closed a opened e da

opened a closed (ricorda che tutti e due gli step sono dipendenti dal voltaggio) ha anche una sua tempo-

dipendenza → cioè è necessario attendere un certo tempo affinché, una volta cambiato il voltaggio, la

popolazione di canali si sia portata tutta verso la nuova distribuzione.

In queste figure vediamo l’espressione di come noi interpretiamo la posizione di quell’equilibrio chimico in

termini di voltaggio dipendenza.

In ascissa è riportato il voltaggio, in ordinata abbiamo i valori

delle due costanti e la costante è la costante di primo

a b : a

ordine che definisce la conversione da closed a opened e la

costante è la costante di primo ordine che definisce la

b

conversione da opened a closed.

Ciascun valore di è funzione del voltaggio.

a o b

Per cui l’effetto del voltaggio sulla posizione di quell’equilibrio

chimica dipenderà dai valori di costante e che vengono

a b

assunti per quel determinato valore di voltaggio cioè i valori di

e non vengono definiti indipendentemente dal voltaggio

a b

ma vengono definiti come funzione del voltaggio.

A voltaggi più iperpolarizzati l’equilibrio chimico sarà

spostato verso sinistra, è la costante che assume valori

b

predominanti.

Spostandoci a valori di voltaggio meno iperpolarizzati (quindi

più depolarizzati) diventa sempre più importante a scapito

a

del valore di quindi quell’equilibrio chimico si sposterà verso

b

destra perché aumenta e diminuisce.

a b

Addirittura a valori di 0 mV o anche prima (-20, -10) pur

restando ancora dentro voltaggi negativi è diventata nulla o

b

prossima al nulla ed ha raggiunto valori molto grandi.

a

Come dobbiamo leggere la situazione di un patch di

membrana? In termini probabilistici.

Dove definiamo P(O) → probabilità di avere in canali in

conformazione opened, che è asintoticamente a 0 per valori più

iperpolarizzati; diventa asintoticamente verso 1 ai valori più

depolarizzati.

Se considero P(O) probabilità di avere canali in conformazione

opened, P(C) = 1-P(O).

Possiamo dire che l’apertura dei canali la esprimiamo come

→ questa relazione mi da una curva sigmoide (figura B)

a/a+b

che è compresa tra valori prossimi asintoticamente a 0 (ai voltaggi

più iperpolarizzati) e va verso valori prossimi asintoticamente a 1

ai voltaggi più depolarizzati.

Qui è possibile osservare la tempo-dipendenza della

probabilità di apertura di questi canali. La tempo-

dipendenza ha un valore caratteristico, una curva

monotonica.

Potremmo definire una costante di tempo della variazione

conformazionale : in principio ci sono canali che rispondono

rapidamente alla variazione di voltaggio in termini di tempo

dipendenza, e canali che rispondono più lentamente.

I canali per il sodio e per il potassio si distinguono proprio

per la loro tempo-dipendenza.

Una terza conformazione è detta INACTIVATED dove il canale è aperto però non permette corrente ionica

cioè la sua conduttanza è 0.

Qual è la differenza tra la conformazione closed e la conformazione inactivated ? Quella closed si può aprire,

ma quella inactivated non si può aprire (deve prima chiudersi per permettere l’apertura dei canali ionici).

Qual è la differenza tra la conformazione opened e la conformazoine inactivated ? Uno permette la corrente

(opened) quello inactivated no.

Questo processo definito “gating” (= “apertura delle porte”) è un processo che è stato descritto da Hodgkin e

Huxley circa metà del 900 e che ha preceduto di 50-60 anni la scoperta dei canali ionici e la definizione in

termini strutturali di queste differenze conformazionali.

Hodgkin e Huxley ebbero un intuizione : parlarono di una gate (che apre il canale) e una gate (che inattiva il

canale).

Osserviamo le curve sigmoidi per i canali per il sodio e per il potassio voltaggio-dipendenti : dove

l’andamento in funzione del voltaggio è indicato come conduttanza ma siccome la conduttanza esiste se e

soltanto se il canale è aperto quella scala di conduttanza può essere detta come una scala di probabilità dove

la probabilità di apertura vale 1 quando la conduttanza ha raggiunto il valore massimo (perché a valori

massimi di conduttanza siamo certi che i canali siano asintoticamente aperti) e il valore 0 di conduttanza

vale quando i canali sono chiusi.

A valori di voltaggio di -60 (di riposo) la conduttanza del potassio è prossima allo 0 : canali del potassio in

conformazione closed; lo stesso dicasi per la conduttanza dei canali del sodio (anche se la conduttanza al

potassio è più alta di quella del sodio).

Infatti i valori di voltaggio di riposo di una membrana sono più vicini ai potenziali di Nernst del potassio di

quanto non siano vicini ai potenziali di Nernst del sodio : questo è dovuto ai canali di likaege più abbondanti

nel potassio.

Possiamo considerare il 50 % di transizione come valore di riferimento.

Se sovrapponiamo quelle due curve normalizzandole a 100 non sono molto diverse. Concludiamo che la

probabilità di apertura per i canali del sodio e la probabilità di apertura per i canali del potassio in funzione

del voltaggio non è molto diversa.

Quello che è diverso è il tempo di vita : 1-5 millisecondi per il sodio e 1-30 millisecondi per il potassio.

Prendiamo in considerazione 5 e 30 : quel valore di tempo di vita dà il tempo che deve trascorrere affinché il

50 % dei canali passi da una conformazione all’altra.

Quali sono i canali più veloci dal punto di vista cinetico? Quelli del sodio.

Quelli più lenti dal punto di vista cinetico sono i canali del potassio.

Quindi quando ci spostiamo da -60 mV (voltaggio di riposo) ai voltaggio di 10, 15 mV più depolarizzati cioè

alla soglia di fuoco, la depolarizzazione è ugualmente importante per far convertire sia i canali del sodio sia i

canali del potassio in modo significativo da quasi 100 % nella conformazione chiusa a una frazione

significativa che è diventata aperta.

Partiamo dai -60 mV per arrivare alla soglia di fuoco dobbiamo arrivare a 10 mV più depolarizzato quindi da

-60 a -50 mV (questa è la soglia di fuoco). Questa depolarizzazione di 10 mV è ugualmente competente per

convertire sia la popolazione di canali per il sodio sia la popolazione di canali per il potassio → i 10 mV di

depolarizzazione fa spostare la probabilità asintoticamente a 0 (probabilità di apertura) a un valore

significativamente diverso da 0 sia per i canali del sodio sia per i canali del potassio.

Quindi alla soglia di fuoco abbiamo un effetto di innesco di corrente ionica che è sostenuta da quella

frazione di canali che sono passati dalla conformazione chiusa alla conformazione aperta.

Se guardiamo al voltaggio diciamo che l’evento è ugualmente probabile sia per il sodio che per il potassio

ma la velocità con cui questo evento si realizza sarà molto maggiore per i canali del sodio di quanto non

succeda per il potassio. Quindi la corrente che si innesca più precocemente sarà quella permessa dai canali

del sodio e la corrente che si innesca più tardivamente sarà quella permessa dai canali del potassio.

No inattivazione perché la conversione da opened a inactivated per i canali del potassio è così lenta che non

la vediamo durante i 4 millisecondi di un potenziale d’azione.

L’attivazione dei canali per il sodio da -50 a 0 mV, da -60 a + 10 mV per quelli del potassio quindi una piccola

differenza c’è sulla voltaggio dipendenza.

Quando il canale ionico si apre si innesca una corrente ionica che dipenderà dal valore di conduttanza che

vale g se guardiamo il singolo canale ionico, ma varrà NgP dove P indica quanti canali aperti o quanti

O O

canali chiusi sono a quel voltaggio, g indica la conduttanza di singolo canale e N volte dirà quanti canali

ionici ci sono.

Quindi una membrana per essere eccitabile deve esprimere tanti canali ionici per unità di superficie.

Come facciamo per rendere non più eccitabile una cellula non eccitabile ? Togliamo i canali ionici.

Quando si attiva il canale ionico quindi passiamo da closed a opened vediamo che ogni canale ionico

esprime la sua conduttanza (g) e ogni ione subirà un effetto dettato dalla forza elettromotrice che

sperimenta (la f.e.m si può esprimere ttraverso l’equazione di Ohm generalizzata : differenza tra il voltaggio

di membrana e il potenziale di Nernst di quel determinato ione).

Per quanto riguarda i canali del sodio : la corrente del sodio avrà un’intensità pari alla conduttanza dei canali

per il sodio moltiplicato per il valore di f.e.m.

depolarizzante = cationica

iperpolarizzante =

anionica

(g piccolo perché considero

il singolo canale)

Per convenzione quando la corrente è negativa, essendo la corrente sostenuta da un flusso di ioni positivi ma

la corrente ha un segno meno vuol dire che è una corrente cationica inward.

Viceversa nel caso di una corrente positiva significa che è una corrente cationica outward.

I due valori sono diversi, quindi al di là del segno che ci dice soltanto se la corrente è inward o outward, il

valore assoluto ci dirà qual è l’intensità della corrente.

Quindi di fatto ciò che definisce la depolarizzazione di membrana nelle fasi iniziali del potenziale d’azione è

proprio una corrente di sodio perché quando i canali ionici passano dalla conformazione chiusa alla

conformazione aperta, il sodio è lo ione che sperimenta la forza elettromotrice maggiore.

Di tutto il processo che riguarda la variazione di voltaggio di membrana ci possiamo

chiedere quale sia il fattore limitante. Il fattore limitante in questo caso è il gating

(apertura) del canale ionico : questo è il processo che impone la durata temporale

all’intero potenziale d’azione.

Una volta che il canale ionico è passato dalla conformazione chiusa a quella aperta, è in

grado di trasferire ioni ad elevata efficienza.

Ricordiamo che un canale ionico è una proteina che media la corrente ionica

transmembrana perché si sostituisce all’acqua nel suo poro di selettività per quanto

riguarda la stabilizzazione dello ione. Quindi il processo di trasferimento di ioni attraverso

il canale ionico può essere visto come un equilibrio chimico multiplo, dove abbiamo una k 1

che è la costante di binding da una faccia verso l’altra e una k che è la costante di binding

2

dal poro di selettività all’altra parte della membrana. Per ciascuna k possiamo definire una

k e una k

on off.

Confronto quali sono i valori numerici delle costanti che sono complessivamente le rate limiting step

guardando il caso di un trasportatore semplice e nel caso di un canale ionico.

Nel caso di un trasportatore semplice il flusso massimo, che dipende dalla costante flip-flop è caratteristico

di una costante che vale da 10 a 10 sec .

2 3 -1

Per il canale ionico il flusso massimo che dipende dalla costante k cioè da quanto velocemente lo ione si

2off

sposta dal filtro di selettività verso l’ambiente intracellulare, questa costante vale da 10 a 10 sec quindi da

6 8 -1

4 a 5 ordini di grandezza maggiore di quanto non sia la costante di un equivalente struttura che però

trasferisca gli ioni attraverso una variazione conformazionale.

Quindi una volta che il canale ionico si è aperto questo trasferisce ioni ad elevatissima efficienza per il canale

è aperto e accessibile, il filtro di selettività è aperto e accessibile da entrambi i lati (extr e int) non c’è nessuno

step in più che permetta l’accessibilità da una parte o dall’altra come nel trasportatore semplie (dove

l’accessibilità è da una parte in conformazione flip o dall’altra in conformazione flop e la velocità con cui

avviene questa variazione conformazionale impone la velocità all’intero processo).

Nel caso del canale ionico quindi diventa limitante il processo di gating (processo di cambiamento

conformazionale iniziale).

Ipotetica istantanea di un patch di membrana Se fotografassimo la superficie di una

cellula eccitabile dove troviamo dei canali ionici : N canali ionici per unità di superficie, N

= 32 le conduttanza di alcuni valgono 0, di altri g.

La conduttanza G dell’intero patch varà 32 volte g moltiplicato per la probabilità che quei

canali siano aperti.

Qui 16 sono aperti e 16 chiusi, quindi la conduttanza di questo patch di membrana varrà

32 x 0,5 (probabilità di apertura) volte g.

Questa è una situazione transitoria ad un certo tempo t.

CANALI NAV (conformazione INACTIVATED per il sodio)

E’ la conformazione tale per cui non c’è più la corrente ionica quindi g per un canale

inactivated vale 0 (tanto quanto quella per un canale closed).

Qual è la differenza tra un canale inactivated e un canale closed ? Il canale closed si può

aprire, il canale inactivated si deve prima chiudere e poi è disponibile nuovamente per

l’apertura.

Questo dipende dai valori di costante.

Tanto più grande è tanto maggiore sarà la probabilità che il canale si apra, tanto maggiore è tanto

a2 g

maggiore sarà la probabilità che un canale aperto si inattivi.

c’è anche una k2 e quindi la possibilità che un canale da closed passi ad inactivated.

è maggiore sia di k2 che di questo vuol dire che quando la membrana si depolarizza prevale il processo

a g

di apertura ma una volta aperti i canali si inattivano.

è maggiore di k2 quindi con la depolarizzazione i canali che si inattivano sono quelli che si sono prima

g

aperti e non quelli che erano chiusi i quali si inattiverebbero direttamente.

Quindi c’è del tempo fisico durante il quale la conduttanza della membrana diventa elevata perché c’è una

finestra di tempo durante la quale i canali per il sodio si aprono prima di inattivarsi.

Qual è l’importanza della ripolarizzazione? La ripolarizzazione ha il vantaggio di aumentare (far passare i

b

canali da aperti a chiusi) ma anche di far aumentare k1 (quindi far aumentare la conversione dei canali per il

sodio da inattivati a chiusi). Siccome i canali da chiusi preferenzialmente passano ad aperti e inattivati, i canali

che si chiudono quando la membrana si ripolarizza sono quelli inattivati piuttosto di essere quelli aperti.

Quindi i canali che si chiudono sono quelli inattivi piuttosto che quelli aperti.

(questo ragionamento vale per i canali del sodio)

! Quando la membrana la portiamo alla soglia di fuoco. Questa depolarizzazione innesca l’apertura ma

l’apertura contiene dentro di se anche l‘inattivazione come processo. Se parliamo in termini di finestra

temporale l’inattivazione avviene più lentamente di quando non avvenga l’apertura. Prima si aprono poi si

inattivano perché è maggiore di k2 piuttosto che i canali da chiusi siano portati ad inattivi.)

g

CANALI KV ( conformazione INACTIVATED per il potassio)

Per i canali del potassio siccome i valori di costante (fondamentalmente la costante sono

g)

tali per cui la conformazione inattivata non è mai raggiunta durante i tempi di durata del

potenziale d’azione, possiamo considerare il contributo dei canali per il potassio durante il

potenziale d’azione, per quanto riguarda la loro chiusura e apertura e apertura e chiusura.

Quindi i canali per il potassio non hanno inattivazione (ci vuole troppo tempo per avere

inattivazione → i canali Kv hanno una cinetica di apertura più lenta di quelli Nav).

Importante è la questione temporale.

FASE INIZIALE DI DEPOLARIZZAZIONE

La fase iniziale di depolarizzazione (cioè quando arriviamo alla soglia di fuoco, soglia alla quale scatta il

potenziale d’azione ) è predominata da questo ciclo :

La depolarizzazione, che è servita a stimolare la membrana, induce la conversione da closed a opened dei

canali ionici voltaggio-dipendenti ma anche la conversione da closed a opened dei canali del potassio

voltaggio-dipendenti.

La corrente di potassio ha importanza minore perché i canali modificano la conformazione lentamente e

perché la f.e.m del potassio è molto bassa a valori di voltaggio prossimi al riposo.

Questa conversione (dei canali da chiusi ad aperti) induce una corrente inward di sodio.

A sua volta la depolarizzazione stimola o inibile l’apertura dei canali per il sodio? Sono canali che sono chiusi

a voltaggi negativi e la probabilità della loro apertura cresce fino a valori prossimi a 0 mV, quindi la

depolarizzazione stimola l’apertura dei canali per il sodio.

È un ciclo a feedback positivo (è un processo esplosivo).

! Lungo quei voltaggi che si stanno alzando verso il positivo la f.e.m. varia perché il voltaggio sta diventando

sempre più vicino al voltaggio di Nernst del sodio.

Invece man mano che ci si sposta verso la fascia ascendente sul potassio la f.e.m. varia aumentando perché ci

spostiamo verso valori sempre più lontani rispetto al potenziale di Nernst del potassio.

(La corrente di potassio adesso non è importante perché il processo di gating di questi canali è molto più

lento rispetto a quelli del sodio.)

La probabilità di apertura dei canali per il sodio è massima a valori di voltaggio depolarizzati.

Perchè raggiunti quei +35 / +40 mV dello spike del potenziale d’azione la conduttanza al sodio torna a valori

prossimi allo 0 ? Ci troviamo a voltaggi depolarizzati quindi la probabilità di apertura di quei canali è alta.

La corrente di sodio tende ad attenuarsi e quasi ad esaurirsi per effetto della f.e.m. che è diminuita (perché ci

siamo spostati verso valori prossimi al potenziale di Nernst del sodio).

La conduttanza va a 0 quindi quei canali non trasmettono più corrente ionica in quanto i canali del sodio si

inattivano. Questo ci spiega perché, pur a valori di voltaggio molto depolarizzati, la conduttanza torna

prossima a 0 (non per effetto di chiusura ma per inattivazione).

FASE DI RIPOLARIZZAZIONE

Considerata fra lo spike del potenziale d’azione e il punto in cui il voltaggio incontra nuovamente i valori di

voltaggio di riposo.

Questa fase di ripolarizzazione è possibile perché i canali del sodio da opened stanno inattivandosi (si

inattivano più lentamente di quanto non si aprano). La reazione di inattivazione avviene continuamente

durante la fase di depolarizzazione, però siccome il processo di inattivazione è lento rispetto a quello di

apertura, si ha predominanza di apertura nella fase di salita e predominanza di inattivazione nella fase di

discesa.

In questa seconda finestra temporale la corrente del sodio si è esaurita però siccome la membrana si è

trovata a valori di depolarizzazione, questo ha permesso il sostenimento della variazione conformazionale

più lenta che è l’apertura dei canali del potassio (quando essi si aprono mediano una corrente cationica

outward che ripolarizza la membrana).

Quindi a corrente del sodio esaurita (perché i canali si sono inattivati) abbiamo che la depolarizzazione è

competente all’apertura dei canali per il potassio (processo che avviene lentamente). La corrente di potassio

è una corrente outward che ripolarizza la membrana, questo sfavorisce la corrente di potassio = processo a

feedback negativo. Ecco perché man mano che la membrana si ripolarizza, i canali del potassio che sono

aperti passano alla conformazione chiusa (questo è un processo che si automodera).

La lentezza della variazione conformazionale che si ha dalla chiusura verso l’apertura per i canali del potassio

caratterizza anche la fase di apertura verso chiusura. Succede che una volta che il voltaggio di membrana è

tornato ai valori di riposo , siccome i canali del potassio hanno cinetiche lente anche verso la chiusura, c’è

una finestra temporale durante la quale i canali per il potassio sono ancora aperti anche se la membrana si è

ripolarizzata.

Quindi i valori di voltaggio di membrana scenderanno verso valori ancora più negativi (più iperpolarizzati

rispetto al riposo) perché lo ione potassio sta imponendo alla membrana il potenziale di Nernst. Questa è

detta fase di iperpolarizzazione postuma → la corrente uscente di potassio stimola la chiusura dei canali del

potassio, la quale a sua volta inibisce la corrente outward di potassio fintanto che si è esaurita (cioè i canali

sono passati nella conformazione chiusa).

Questa after iperpolarization ha avuto l’importanza di convertire i canali del sodio che erano inactivated

riportandoli verso la conformazione chiusa. La membrana torna ad essere a riposo e quindi ri-eccitabile.

La iperpolarizzazione stimola il passaggio da aperto a chiuso che però deprime la corrente outward la quale

a sua volta deprime l’iperpolarizzazione.

PROPRIETA’ DEL POTENZIALE D’AZIONE

• Il potenziale d’azione è una risposta attiva che dipende da conduttanze che non sono costanti ma

sono funzioni del tempo e del voltaggio.

• Prevede diverse fasi che abbiamo analizzato in termini di probabilità di apertura, chiusura,

inattivazione dei canali ionici e la loro tempo-dipendenza.

• E’ un evento tutto o nulla

• E’ un evento che non è sommabile

• E’ un processo che prevede refrettarietà

Il potenziale d’azione è un evento tutto o nulla, cioè il fatto che non sia un potenziale sommabile, ha a che

fare con il fatto che è un processo che prevede una fase di refrettarietà.

Osserviamo la somministrazione di stimoli progressivamente crescenti, ma nessuno di questi stimoli (i primi

tre) è tale da portare la membrana alla soglia di fuoco : quindi si osservano effetti proporzionali allo stimolo.

Lo “stimolo liminare” è quello che porta la membrana alla soglia di fuoco. Scatta il potenziale d’azione,

stimoli successivi somministrati come stimoli sopraliminari (che sicuramente sono di intensità tale da portare

la membrana alla soglia di fuoco) producono potenziali d’azione che sono sempre della stessa forma.

Sulla questione ”nulla” : quando non c’è potenziale d’azione vuol dire che non riusciamo attraverso la

depolarizzazione della membrana ad innescare il processo esplosivo di apertura dei canali per il sodio,

perché i valori di voltaggio a cui la membrana è stata portata elettrotonicamente non sono così depolarizzati

da consentire una corrente di sodio in ingresso che inneschi questo processo esplosivo.

Quando siamo sovrasoglia, basta oltrepassare la soglia di fuoco, per cui quando si innesca il ciclo dei canali

sono tutti gli N canali che vengono coinvolti. Quindi se vengono coinvolti tutti gli N canali la forma del

potenziale d’azione sarà sempre quella.

Quali fattori possono far cambiare la forma ad un potenziale d’azione? Fattori che influenzano sulla

voltaggio-dipendenza dei canali ionici. Un altro motivo dipenderà da il corredo dei canali ionici che sono

espressi in quel determinato patch di membrana.

Per esempio se ho un potenziale d’azione di un neurone non trattato come ci aspetteremmo essere la forma

del potenziale d’azione se attraverso la somministrazione di una certa sostanza, la conversione da aperto a

inattivato dei canali per il sodio fosse inibita ? La fase iniziale è la stessa poi subisce una lenta discesa, la

corrente del potassio si è innescata ma continuamente antagonizzato dalla corrente di sodio che non si

esaurisce. Questo comporterebbe un disfunzionamento totale del neurone.

Tutto o nulla è perché una volta che si innesca il ciclo dei canali la risposta della membrana dipenderà da

quei canali n che sono funzionali.

Quindi l’innesco dei cicli di canali e la tempo dipendenza del ciclo dei canali definisce non soltanto la forma

ma anche il fatto che durante l’intero potenziale d’azione la membrana sia refrattaria (cioè se viene rieccitata

non risponde ad un altro potenziale d’azione).

Durante il ciclo dei canali la membrana è refrattaria sia a qualsiasi altro stimolo, sia a tutta l’intensità in

eccesso rispetto a quella necessaria per arrivare alla soglia.

Della refrettarietà distinguiamo una refrettarietà assoluta e una refrettarietà relativa.

La fase di refrettarietà è quella legata ai milli secondi durante i quali si ha la depolarizzazione e la

ripolarizzazione ma per quei milli secondi che sono caratteristici della iperpolarizzazione postuma

un’eventuale altro stimolo in che condizione sarebbe applicato in termini di situazione di membrana?

Se lo stimolo lo applichiamo nell’iperpolarizzazione postuma : abbiamo una membrana dove è ancora

significativa una corrente ripolarizzante di potassio, abbiamo una membrana che è meno reattiva per i canali

del sodio in quanto sono ancora in numero significativo inattivati però si stanno chiudendo.

Abbiamo accumulato un certo numero di canali in forma chiusa quindi riattivabile, la membrana è però sotto

ancora l’effetto di una corrente iperpolarizzata di potassio → questa è la condizione di refrettarietà relativa.

Questo significa che la cellula può essere nuovamente depolarizzata (nuovamente portata alla soglia di

fuoco) ma in questo caso occorre uno stimolo di intensità più alta di quello liminare.

Qui abbiamo un esempio di stimoli con stessa intensità somministrati in tempi diversi : fintanto che non si

recupera la iperpolarizzazione postuma tutti gli stimoli successivi al primo, se di eguale intensità, sono

inefficaci perché la membrana è in refrettarietà relativa. Lo stimolo diventa efficace e genera un potenziale

d’azione perché la iperpolarizzazione postuma è stata recuperata (siamo tornati a valori di voltaggio di

riposo).

Possiamo però evocare il potenziale d’azione in tempi sempre più vicini ad uno già innescato quanto più

somministriamo uno stimolo intenso se lo somministriamo nella refrettarietà relativa.

Il potenziale d’azione è il processo che innesca delle correnti elettriche che si spostano lungo gli assoni e

queste correnti elettriche si spostano lungo gli assoni trasferiscono segnali lungo la rete nervosa.

Il concetto fondamentale è che se consideriamo queste correnti come l’evento che trasferisce informazioni,

come si fa a trasferire l’informazione che è graduata nell’intensità; se l’informazione di uno stimolo sensitivo

viene trasferita attraverso processi che dipendono dal tutto o nulla del potenziale d’azione come si fa a

conservare l’informazione della gradualità del segnale quando gli eventi che ne conseguono sono tutto o

nulla si evocano burst di potenziale d’azione a frequenza diversa e la frequenza del potenziale d’azione porta

l’informazione dello stimolo che l’ ha provocato.

SEGNALI ELETTRICI III

Abbiamo iniettato corrente in un patch di membrana, abbiamo generato un potenziale d’azione, l’abbiamo

seguito nel tempo.

Cosa succede al resto della membrana che abbiamo a disposizione ? Cosa succede agli n patch di membrana

che sono continui con quello stimolato o addirittura molto distanti da quello stimolato ?

A livello del lato extracellulare ho indicato un pattern di cariche positive (→ membrana a riposo) perché su

quella faccia della membrana abbiamo un’abbondanza di ioni potassio che risiedono nel tempo mediamente

in maggiore quantità su quella faccia relativamente agli effetti di differenza di concentrazione, agli effetti di

pompaggio della sodio/potassio ATPasi → effetti dovuti a canali di likaege o effetti dovuti a quella piccola

frazione dei canali ionici per il potassio voltaggio-dipendenti che a valori di riposo si trovano ugualmente

nella conformazione aperta.

Inoltre quella differenza di potenziale elettrico è resa molto bene considerando che 12 mila ioni potassio in

più per micron quadrato danno quell’effetto (= membrana a riposo).

Per quanto riguarda il lato intracellulare ho indicato un pattern di cariche negative, questo pattern è dovuto

alla mancanza di ioni potassio che invece di risiedere in quella localizzazione si sono spostati per effetto dei

canali di likaege dove c’è la faccia voltaggio-positiva.

Questa è la situazione che viene fotografata dall’equazione di G-H-K in termini di valori di voltaggio e

dall’equazione del circuito elettrico equivalente.

A circa 1,2 millisecondi osserviamo cosa succede dopo che si è innescato il potenziale d’azione cioè

focalizziamoci sullo spike del potenziale d’azione laddove abbiamo l’inversione del voltaggio.

Quell’area evidenziata è l’area del patch di membrana dove i canali ionici si sono attivati ed hanno, secondo

la loro tempo dipendenza portato alla variazione della conduttanza della membrana per cui si sono innescate

le correnti depolarizzanti.

Identifico un segno meno ( - ) perché ci sarà meno carica positiva. Il segno meno è dovuto agli ioni sodio che

sono presenti in concentrazione inferiore rispetto allo stato stazionario perché si sono accorpati sulla faccia

interna della membrana per effetto dell’attivazione dei canali ionici.

In condizioni di riposo la faccia a potenziale positivo (ext) è tutta isopotenziale rispetto all’intera superficie di

cellula, l’altra faccia quella interna anch’essa è isopotenziale rispetto a tutta la superficie che io prendo in

considerazione, ma quando fotografo la situazione ad 1,2 millisecondi dall’innesco del potenziale d’azione

solo sullo spike, il patch di membrana interessato dal potenziale d’azione (in rosso) non è più isopotenziale

rispetto alle regioni vicinali.

Quindi ogni volta che si ha una differenza di potenziale elettrico tra due punti dello spazio, se la resistenza

del mezzo non è infinita (cioè conduttanza asintoticamente a 0) cioè se ha valori ragionevoli si innesca una

circuitazione di corrente elettrica che va dalle regioni a riposo verso la regione dove si è invertito il voltaggio.

Per quanto riguarda la faccia intracellulare siamo sempre sullo spike del potenziale d’azione, c’è inversione di

voltaggio, quello stesso patch di membrana se fotografato dal lato intracellulare lo vedremo a voltaggio

opposto. Quelle regioni non sono più isopotenziali tra loro, mi aspetto una corrente elettrica sempre se la

resistenza elettrica abbia valori che non sono asintoticamente all’infinito (la resistenza elettrica è ragionevole

per sostenere quella corrente). In questo caso qual è il mezzo lungo il quale si muove la corrente elettrica? Il

citosol.

La resistenza del citosol e la resistenza del LEC sono uguali o sono diverse ? DIVERSE. Il mezzo che ha che ha

la resistenza elettrica maggiore è il citosol che ha una struttura in cui sono presenti numerosi componenti

proteici che hanno tutta una serie di cariche elettriche che interferiscono elettrostaticamente con gli ioni

impediscono il movimento di ioni a cui sarebbe associato il passaggio di corrente elettrica sul lato

intracellulare (noi ci aspettiamo che la resistenza del lato intracellulare sia maggiore di quella del lato

extracellulare).

Se questa regione a carica positiva è interessata dal movimento di cariche positive verso questa, la

concentrazione di cariche positive verso questa. La concentrazione di cariche positive qui intorno tenderà a

diminuire (?) così come questa concentrazione di carica positiva tenderà ad essere distribuita verso regioni a

voltaggio negativo quindi il valore di voltaggio negativo nelle regioni vicinali tenderà a essere diminuito.

Questo si traduce in una differenza di potenziale elettrico nelle regioni vicinali che è, rispetto alla condizione

di riposo, depolarizzata. Cioè la depolarizzazione si estende nelle regioni vicinali per effetto del potenziale

d’azione in un determinato patch di membrana per cui le regioni vicinali vengono portate alla soglia di fuoco

e innescheranno a loro volta un potenziale d’azione.

Quindi se aspetto x millisecondi il potenziale d’azione lo vedo esaurirsi sul patch di membrana dove lo

evocato ma lo vedo riprodursi identico (perché è un effetto “tutto o null”) basta che la membrana nelle

regioni vicinali sia portata alla soglia di fuoco.

Dopo che si è esaurito in questo anello, lo vedrò ricomparire in un anello a diametro maggiore, cioè

l’andamento del potenziale d’azione dal sito di innesco tenderà a muoversi centrifugamente.

Perchè questo potenziale d’azione non rimplode al centro? Per la refrettarietà. Questa regione si è

ripolarizzata e ci troviamo in una fase di refrettarietà prima assoluta poi negativa.quindi questa regione è

refrattaria e il potenziale d’azione non può far altro che generare correnti che si muovono in direzione

centrifuga.

La depolarizzazione che è portata da questo movimento di corrente cioè l’attenuazione del voltaggio

positivo e negativo rispetto al riposo nelle regioni circostanti deve far arrivare la membrana alla soglia di

fuoco perché altrimenti quel potenziale d’azione non si estende.

L’intensità delle correnti generate da un potenziale d’azione è sempre sufficientemente alta da portare alla

soglia di fuoco le regioni vicinali.

Incidentalmente capiamo l’importanza del fatto che il potenziale d’azione sia un evento tutto o nulla : perché

proprio per questa proprietà l’effetto depolarizzante nelle regioni continue avrà sempre lo stesso valore

(l’intensità del potenziale d’azione è sempre sovrabbondante rispetto alle richieste necessarie per arrivare alla

soglia di fuoco. Una volta innescato un potenziale d’azione in un punto dell’assone lo vedremo comparire a

10 km di distanza se quell’assone è lungo 10 km.

Così come avevamo descritto la costante di tempo per illustrare quanto la membrana rispondeva

velocemente rispetto a un effetto generato con una corrente in un patch, adesso dobbiamo considerare la

costante di spazio per capire quanto velocemente si propaga questo potenziale d’azione.

! Quando il potenziale d’azione arriva in fondo all’assone e trova una resistenza di membrana (perché lì

l’assone termina) trova uno spazio sinaptico e una membrana post sinaptica, la conduzione del potenziale

d’azione non avviene più in modo diretto come avviene in un assone ma si hanno processi di trasmissione

sinaptica.

Cosa definisce il fatto che il potenziale d’azione si possa propagare? Deve essere raggiunta nelle regioni

vicinali la regione soglia quindi il fatto di avere una direzione di propagazione rispetto che un’altra dipenderà

dai valori soglia della membrana che di volta in volta sarebbe potenzialmente interessata dai potenziali

d’azione.

Che cosa definisce il valore soglia ? Caratteristiche della membrana in termini di canali.

Se osserviamo l’assone gigante del calamaro in sezione trasversale vediamo la

regione che è attiva (circuitazione delle correnti come avviene).

Il potenziale d’azione è un evento innescato in un punto e una serie di eventi a cascata che si riproducono

tutti quanti uguali gli uni agli altri si ha l’effetto completo.

Cosa potrebbe terminare un potenziale d’azione ? Per esempio una inibizione dei canali per il sodio e per il

potassio in un punto particolare (così si avrebbe un blocco della conduzione del potenziale d’azione).

Il potenziale d’azione è un evento trasmissibile. Bisogna capire come le perturbazioni elettriche evocate in

un punto specifico della membrana si trasmettano lungo la distanza e capire con che velocità e con che

efficienza rispetto alla dimensione spaziale.

Una reazione di fuga per esempio prevede lo scatenarsi di una risposta comportamentale degli stimoli che si

genera nella corteccia motoria ma gli effettori che entrano in azione per determinare la reazione di fuga è

l’apparato muscolare scheletrico quindi i segnali devono muoversi lungo una distanza fisica e tanto più

velocemente si muoveranno tanto inferiore sarà il ritardo tra elaborazione della risposta e genesi della

risposta.

Circuito resistivo capacitivo

Osserviamo un patch di membrana e la forza elettromotrice e un ramo resistivo. Noi sappiamo che in realtà

ci sono tre forze elettromotrici (Vm-Ek ; Vm – ENa ; Vm-Ecl) e tre rami resistivi (il ramo resistivo dato dai

canali per il sodio, per il potassio e per il cloro).

Osserviamo i rami di circuito che connettono i vari patch di membrana, i rami di circuito non hanno

componenti capacitive (non c’è l’interposizione di nessun dielettrico lungo il LEC o lungo il citosol), ci sono

due elementi resistivi : una resistenza IN (cioè la resistenza del citosol, la resistenza che la corrente incontra

dal lato intracellulare) e una resistenza OUT (cioè la resistenza del LEC, la resistenza che la corrente incontra

dal lato extracellulare). La resistenza del citosol è molto maggiore dell’altra.

Queste sono correnti iniettate che circuitano verso l’esterno : le frecce diventano sempre

più strette man mano che ci allontaniamo: l’attenuazione delle correnti è dovuta alla

resistenza del mezzo (in questo caso il citosol).

C’è anche una terza resistenza che è data dalla membrana stessa : perché per circuitare la corrente essa deve

passare anche attraverso la membrana.

Se quella resistenza di membrana è elevatissima, quella corrente non circuiterà perché la membrana non

esprime i canali ionici.

Non esprime i canali ionici o si associa all’assone una cellula accessoria detta cellula di Schwann che

avvolgendosi a manicotto isola generando resistenza elettrica dell’ordine dei gigaohm.

Vediamo adesso come si distribuisce nello spazio un certo salto di

voltaggio che si genera in un certo punto.

Questo è un esperimento riprodotto in termini di depolarizzazione

elettrotonica cioè sto considerando un processo di trasferimento delle

correnti senza che vi sia il potenziale d’azione.

Il comportamento di una cellula in termini di potenziale d’azione è quello

che si somma rispetto a un comportamento elettrotonico.

In questo esperimento elimino la possibilità di avere potenziale d’azione

(avveleno i canali) inietto corrente nel punto che indico con 0 (punto di

origine dell’esperimento) il voltaggio va da V0 a Vm secondo tau.

Guardo cosa succede quando iniettando corrente per andare da V0 a Vf,

all’origine, che cosa succede a distanze x diverse da 0.

di x me lo ritrovo a distanze x diverse dall’origine.

DV

Se faccio un campionamento di sarà massimo man mano che mi

DV, DV0

sposto deltav diminuisce fino a valori prossimi allo 0.

Quella corrente che ho iniettato e che si è trasmessa secondo x si sarà

attenuata fino a 0 perché ogni resistenza (sia quella del citosol che quella

del LEC) avrà l’effetto di attenuare l’intensità di corrente e quindi avrà l’effetto di attenuare il che vedo in

DV

tutti gli x diversi da 0.

Sto attenuando la corrente, la mia corrente si dissipa per effetto della resistenza del mezzo.

Propagazione passiva dei potenziali elettrotonici attraverso correnti elettrotoniche

A) Resistenza al flusso nel citoplasma (ri)

B) La resistenza della membrana è rm (dipende dalla conduttanza)

e (perché

-1 l/l)

è la distanza dal punto di iniezione della corrente dove vedo il massimo diminuire fino al 63 % (cioè ne

DV

l

rimane ancora il 37 %).

Se diminuisce è perché la resistenza agisce su quella corrente che si sta propagando.

DV

La corrente sarà propagata meglio se è grande o se è piccolo ? Cioè quell’assone sarà un conduttore

l

migliore se l è grande o è piccolo? Se è grande.

l

(Se è piccolo vuol dire che la membrana della cellula è un buon conduttore, adesso se è grande vuol dire

t l

che quell’assone è un buon conduttore).

la esprimo come la radice quadrata tra la resistenza di membrana / la resistenza intracellulare + resistenza

L

extracellulare. Ma siccome la resistenza intracellulare è molto maggiore di quella extracellulare, quest’ultimo

posso trascurarlo.

Visto così quel rapporto è un numero puro, come fa ad avere le dimensioni di cm ? In realtà queste

resistenze non sono misurate in Ohm, sono resistenze misurate in Ohm corrette per il fattore geometrico.

Il fattore geometrico è, per la resistenza che attraversa la membrana, è quello che tiene conto di una corrente

che passa per una lunghezza molto piccola ed una superficie molto grande. La resistenza del liquido

intracellulare è la resistenza che passa per una sezione piccola ma per una lunghezza molto grande.

Quindi sono fattori geometrici tale per cui la formula reale di è questa :

l

è data dalla resistività specifica di membrana (r ) / la resistività specifica intracellulare tra i due e al

l sm

numeratore troviamo anche il raggio R (del conduttore che stiamo osservando).

La resistività specifica di membrana (r ) si misura in Ohm cm ; la resistività specifica intracellulare (r ) si

2

sm sin

misura in Ohm cm :

Se da un punto qualsiasi origine della stimolazione vedo attenuare perché i voltaggi nelle regioni

DV

adiacenti sono fatti variare attraverso il passaggio di correnti elettrotoniche che sono attenuate secondo l,

vedrò che se questo è il salto di voltaggio rispetto a x e se questa è la soglia di fuoco, iniettando una

corrente che porti la membrana sovrasoglia, quanto lungo è il tratto di assone che è suscettibile ad evocare

nuovamente il potenziale d’azione ? Sarà la lunghezza che corrisponde all’intersezione tra la soglia di fuoco e

il valore quando questo interseca il valore della soglia di fuoco cioè quella evidenziata è la regione

DV

assonale che è utile per l’innesco dei nuovi potenziale d’azione.

Se fosse maggiore quell’esponenziale sarebbe più piatta perché le correnti elettrotoniche si attenuano di

l

meno. La regione assonale utile per nuovi potenziali d’azione sarebbe maggiore.

Il potenziale d’azione ha sempre la stessa durata in millisecondi. Quanto maggiore è la lunghezza utile per

generare nuovi potenziale d’azione tanto più velocemente questi potenziali d’azione li vedrò spostarsi nello

spazio.

(La velocità è spazio/tempo se lo spazio aumenta e il tempo resta costante, la velocità con cui vedo

rigenerarsi il potenziale d’azione sarà maggiore quando è grande). Quindi questa velocità di riproduzione

l

del potenziale d’azione sarà maggiore quanto più alto sarà il valore di l.

Anche qui gioca un ruolo fondamentale il fatto che il potenziale d’azione sia “tutto o nulla”, che abbia una

durata discreta (quindi tempo costante) ma se lo spazio è maggiore la velocità diventa maggiore.

Possiamo interpretare tutto in termini di teoria del cavo. Un assone trasferisce correnti elettrotoniche che si

generano quando c’è un salto di voltaggio in un certo punto.

Qual è l’oggetto che trasferisca correnti elettriche ? Un conduttore. Allora posso dire che l’assone si

comporta come un cavo conduttore : ma è un buon conduttore o un cattivo conduttore ? Un buon

conduttore è un conduttore che lungo la distanza non attenua corrente elettrica per effetto delle resistenze

(effetto Joule) un cattivo conduttore invece è un materiale che fa passare corrente ma l’attenua per effetto di

una sua caratteristica intrinseca. Per decidere se un assone è un buon o cattivo conduttore devo considerare

tre elementi : 1) le correnti sono attenuate secondo 2) il potenziale d’azione ha sempre la stessa forma e

l

stessa intensità 3) la soglia è costante in condizioni di riposo.

Cosa dobbiamo vedere di caratteristico dell’assone per decidere se è un buon o un cattivo conduttore?

Guardiamo com’è fatto per esempio le dimensioni.

Parlando di dimensioni significa che guardiamo al raggio : il raggio può influenzare e (se è piccolo il

t l t

potenziale d’azione si innesca in fretta ; se è grande, è grande il tratto che è interessato ai nuovi potenziali

l

d’azione).

La velocità di propagazione dei nuovi potenziale d’azione è direttamente proporzionale a e inversamente

l

proporzionale a t.

si misura come prodotto tra resistenza di membrana x capacità di membrana → t = r C

t m m

r è inversamente proporzionale al raggio R dell’assone, Cm è direttamente proporzionale a R (quindi i due

m

effetti si compensano).

In entrambi i casi perché se aumenta R aumenta A.

C’è un problema → R dipenderà dalle caratteristiche intrinseche della cellula ma i neuroni sono cellule

mononucleate, quindi all’aumentare di R il rapporto nucleo/citoplasma “peggiora”. Quindi vi è una sorta di

limite all’aumento di R dovuto proprio al peggioramento del rapporto nucleo/citoplasma.

Data questa scrittura di cosa abbiamo? Abbiamo una strategia evolutiva che ha portato le cellule a

l

diventare giganti ( = assone gigante del calamaro) quindi un vantaggio evolutivo.

Gli assoni giganti del calamaro li troviamo associati alla condizione dei segnali verso i muscoli volontari del

mantello (da cui dipendono i movimenti natatori).

Un’alternativa è il gigantismo che agisce sul fattore R. , però questo gigantismo è limitato dal fatto che il

rapporto nucleo/citoplasma peggiora.

Un esempio di gigantismo di una cellula eccitabile dove il rapporto nucleo/citoplasma in realtà rimanga

sempre ottimale è la cellula muscolare scheletrica, quella sinciziale (non è mononucleata).

L’alternativa strategia adattativa è la mielinizzazione. Su quale parametro del valore agisce la

l

mielinizzazione ? Agisce sulla resistenza specifica di membrana perché avvolgere l’assone con il manicotto di

mielina significa aumentare la resistenza specifica di membrana.

! La resistenza specifica di membrana normalizzata rispetto al valore geometrico compare al numeratore.

Confronto delle fibre mieliche classificate secondo la classica nomenclatura istologica/citologica.

Le fibre Aa hanno diametro dell’assone di 18,5 micron e conducono i potenziali d’azione a 42 m/s.

Le fibre A b hanno diametri inferiori e conducono a 25 m/s.

Le fibre Ag 11 micron di diametro che conducono a 17 m/s. Quindi andando verso le sezioni inferiori le

velocità diminuiscono (perché l’effetto di R vale anche nel caso delle fibre mieliniche).

B 4,2

per quanto riguarda una fibra amielinica 2,5 micron confrontabile con la fibra B e conduce a velocità che è un

decimo di quella mielinica → 0,4-0,5

Nel caso del Loligo (calamaro) conducono 18-33 m/s : il calamaro ha evoluto neuroni con assoni che sono

500:18 volte più grandi per condurre potenziali d’azione a velocità confrontabile rispetto alle fibre mieliniche.

Quindi la strategia adattativa che prevede il gigantismo dell’assone di fatto si scontra con il problema di

mantenere un rapporto nucleo/citoplasma ottimale.

Altra strategia adattativa era legata all’aumentare la resistenza specifica di membrana, cosa che viene

realizzata attraverso l’evoluzione della guaina mielinica.

Se guardiamo agli assoni periferici parliamo di cellule di Schwann che si avvolgono a manicotto, se

guardiamo il sistema nervoso centrale parliamo di cellule gliali.

La presenza o meno di guaina mielinica determina anche un diverso meccanismo di propagazione dei

potenziali d’azione per cui nel caso dell’assone non mielinico la conduzione è detta continua perché ogni

elemento di membrana dell’assone diventa competente a evocare il potenziale d’azione. Mentre nel caso

degli assoni mielinizzati la conduzione è definita saltatoria perché la corrente elettrotonica interna può

circuitare verso l’esterno e quella esterna può circuitare verso l’interno solamente in corrispondenza dei nodi

di Ranvier.

Nelle regioni internodali (cioè laddove sia presente la guaina mielinica) la resistenza di membrana dovuta alla

presenza della cellula di Schwann è dell’ordine dei 160.000 Ohm cm . In questa regione non sono espressi i

2

canali per il sodio e i canali per il potassio voltaggio dipendenti e non è espressa la sodio potassio ATPasi.

I canali per il sodio e per il potassio voltaggio dipendenti li vediamo espressi nelle regioni nodali dove la

resistenza diventa quella caratteristica della membrana assonale (dell’ordine dei 20 Ohm cm ) inoltre la sodio

2

potassio ATPasi è espressa e localizzata sulle regioni internodali. La conduzione è saltatoria perché vediamo i

potenziali d’azione non generarsi continuamente lungo tutto il decorso dell’assone ma saltano da un nodo di

Ranvier a quello successivo.

Nella regione internodale la resistenza è molto elevata e questo ostacola la circuitazione verso l’esterno della

corrente elettrica quindi i canali per il sodio e per il potassio voltaggio dipendenti così come la sodio

potassio ATPasi non avrebbero alcun ruolo in questa regione (perché è una regione che non è a contatto con

il LEC dove può muoversi la corrente elettrica).

Viceversa in corrispondenza dei nodi abbiamo canali ATPasi e resistenze lasse per permettere la circuitazione

della corrente.


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177

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11.44 MB

AUTORE

Olgap01

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biologia
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Olgap01 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Fisiologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Beltramini Mariano.

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