Appunti ematologia

Ematologia

Il sangue è costituito da elementi corpuscolati come cellule e frazioni cellulari, sospesi in un liquido plasmatico costituito da acqua, sali minerali in forma ionica, proteine, glicidi ed altri soluti (il plasma). Svolge fondamentalmente tre funzioni:

• Trasporto: di ossigeno dai polmoni a tutto l’organismo e di diossido di carbonio dalle cellule ai polmoni;
• Regolazione: del pH dei fluidi corporei e della temperatura corporea;
• Protezione: si coagula in caso di ferita e difende contro agenti patogeni.

Nel maschio adulto il sangue è formato per il 55% da una parte liquida, detta plasma, e per il 45% da una parte corpuscolata, costituita da cellule o frammenti di cellule (valori indicativi per un maschio adulto sano), mentre nella donna la parte liquida è rappresentata al 60% e la parte corpuscolata al 40%. Il midollo osseo è l’organo deputato alla produzione della parte corpuscolata del sangue. Detto tessuto è presente nelle ossa di tutto l'organismo in quantità variabile dai 3.000 ai 4.000 centimetri cubi; tuttavia la parte di esso effettivamente funzionante, cioè il midollo rosso, si aggira sui 1.500 centimetri cubi. Da questo litro e mezzo di midollo rosso vengono fabbricati in un giorno circa 250 miliardi di globuli rossi, 15 miliardi di globuli bianchi e 500 miliardi di piastrine.

Prelevando una goccia di sangue da una regione periferica dell'organismo (per esempio dal polpastrello di un dito), e contando in essa gli elementi presenti, si può dedurre che in un millimetro cubo si trovano approssimativamente:

• 5 milioni di globuli rossi;
• 7.000 globuli bianchi;
• 250.000 piastrine.

Eritrociti (Globuli Rossi)

Gli eritrociti (globuli rossi) sono gli elementi senza nucleo più numerosi del sangue, nell'uomo adulto raggiungono i 5 milioni, nella donna 4,5 milioni per millimetro cubo. Hanno la forma di un disco biconcavo, che facilita gli scambi per diffusione della membrana plasmatica e la loro deformabilità, e, non possedendo nucleo (lo perdono durante l’emopoiesi), non possono essere definite quali cellule vere e proprie. Il citoplasma degli eritrociti è d'aspetto omogeneo e contiene una proteina fondamentale affinché essi svolgano la loro funzione principale, cioè quella di trasportatori d'ossigeno, detta emoglobina (Hb). L'emoglobina è un tetramero formato da quattro unità di globulina (due catene α e due catene β), che racchiudono ciascuna, in una gabbia di amminoacidi idrofobici, un gruppo eme, contenente ferro bivalente.

Leucociti (Globuli Bianchi)

I leucociti (o globuli bianchi) sono cellule contenenti un nucleo, più grandi ma meno numerose dei globuli rossi, in condizioni normali la loro concentrazione nel sangue è di circa 7.000/mm³; essi hanno inoltre il compito di difendere l'organismo dagli attacchi di agenti patogeni come batteri, virus o parassiti migrando nel sangue per mezzo di agenti chemio-attraenti che permettono loro di raggiungere la sede dell'infiammazione. I leucociti si distinguono in base alla presenza o assenza di granuli nel citoplasma.

Granulociti

I granulociti sono globuli bianchi “fagociti”, significa che il loro modo di difendere l’organismo dai germi patogeni è quello di individuarli e “mangiarli” (distruggerli fagocitandoli). Sono definiti granulociti, perché al loro interno sono presenti degli speciali enzimi che servono loro proprio per “digerire” i microrganismi che ingoiano. Costituiscono circa il 60% di tutti i globuli bianchi del sangue, e loro volta si suddividono in:

• Granulociti neutrofili: sono le più numerose cellule di questo tipo, e sono dei “fagocitatori” straordinari, in particolare di batteri, riuscendo ciascuno ad “ingoiarne” fino a 20 nella loro breve vita;
• Granulociti basofili: sono decisamente pochi, ma non per questo meno importanti. Questa categoria di globuli bianchi, infatti, è coinvolta specialmente nelle reazioni immunitarie di tipo allergico in quanto sono in grado di rilasciare istamina, che “scatena” l’infiammazione, ed eparina, sostanza che serve per aumentare la fluidità del sangue e prevenire la formazione di trombi (coaguli);
• Granulociti eosinofili: rappresentano circa l’1-2% del totale dei leucociti, e si attivano sia nelle reazioni allergiche che nelle parassitosi, ad esempio quelle intestinali dei bambini;

Monociti

Monociti: spesso definiti genericamente “spazzini del sangue”, questi leucociti rappresentano circa il 10% del totale e si suddividono a loro volta in due sottogruppi:

• Monociti a cellule dendritiche: sono dei “segnalatori” di minacce. In pratica marcano (perché sono in grado di individuarli), gli antigeni presenti sui microrganismi nemici e in tal modo li rendono “visibili” ai linfociti in modo tale che possano distruggerli;
• Monociti macrofagi: agiscono un po’ come i neutrofili fagociti, ma essendo più grandi e longevi di questi, sono in grado di inglobare e distruggere germi di dimensioni superiori e per tempi più lunghi. Inoltre, sono anch’essi dei marcatori di antigeni. Gli antigeni, lo ricordiamo, sono sostanze proteiche presenti sulla superficie dei microrganismi patogeni che sono in grado di innescare una reazione immunitaria da parte degli anticorpi. Se però questi antigeni non vengono riconosciuti i germi si moltiplicano indisturbati. Per tale ragione il ruolo dei marcatori è cruciale nella reazione immunitaria dell’organismo in caso di attacco infettivo;

Linfociti

I linfociti sono le cellule del sangue coinvolte più di tutte nell’organizzazione del sistema immunitario, ne garantiscono l’efficienza e rappresentano circa il 30% del totale. Si dividono in:

• Linfociti B: sono proprio questi globuli bianchi che hanno il compito di rilasciare nell’organismo gli anticorpi, ovvero sostanze proteiche a forma di Y che si legano agli antigeni dei microrganismi infettivi o delle cellule infettate e possono fare due cose: distruggerli direttamente, oppure “segnalarli” ai linfociti T affinché siano questi ad occuparsi della loro disintegrazione;
• Linfociti T: sono incredibilmente longevi (possono durare molti anni prima di “morire”) e ve ne sono di diverso tipo:
  • I linfociti T “helper”, che rilasciano una sostanza chiamata citochina, a sua volta responsabile di dirigere la risposta immunitaria degli altri leucociti;
  • I linfociti T “killer” (o citotissici) che, com'è facilmente intuibile, “uccidono” i germi infettivi rilasciando speciali molecole;
  • I linfociti T “memory” mantengono memoria del tipo di agente infettivo che ha attaccato l’organismo (es. un virus) anche dopo la guarigione, e si attivano immediatamente nel caso di un secondo “attacco”;
  • I linfociti T “regolatori”, che hanno un compito delicato: quello di controllare che gli altri linfociti T non “marchino” come nemiche le cellule sane del corpo anziché quelle infettate o neoplastiche. Attenzione: come vedremo, una loro débâcle sta dietro il meccanismo dell’autoimmunità;

Piastrine

Le piastrine svolgono un ruolo essenziale nell‘emostasi, cioè nell'arrestare la fuoriuscita del sangue dai vasi che si verifica in seguito a una lesione. Esse non sono vere cellule, ma frammenti derivati da grandi cellule prodotte dal midollo osseo, che prendono il nome di megacariociti. La concentrazione delle piastrine nel sangue è di circa 250.000/mm³. Le piastrine (dette anche trombociti) sono frammenti di cellule che fanno parte degli elementi figurati del sangue e la loro funzione è mediare il processo di emostasi e di coagulazione delle ferite. Come anche gli altri elementi figurati del sangue, le piastrine vengono prodotte dal midollo rosso delle ossa, hanno una vita media limitata e poi verranno distrutte nella milza.

Il plasma

Il plasma è un liquido di color giallo chiaro costituito per il 90% da acqua, per il 10% da sostanze organiche e sali disciolti. La proteina maggiormente rappresentata (60% del totale) è l’albumina: essa mantiene la pressione oncotica costante. Numerose le globuline (35% del totale), di cui fanno parte, tra le altre, le globuline β, di ormoni e di lipidi, e le immunoglobulline (anticorpi), che contribuiscono alla difesa immunitaria. Contiene anche glucidi, lipidi e fosfolipidi e numerosi ioni e cataboliti. Il plasma privo di fibrinogeno viene definito siero. Delle sostanze che compongono il plasma noi ci occuperemo solo di quelle che favoriscono o non consentono la coagulazione del sangue.

La provetta per l’emocromo

Normalmente ha un tappo di colore che va dal lilla al viola. Ovviamente, se dobbiamo contare e esaminare le caratteristiche della parte corpuscolata del sangue dobbiamo esaminare il sangue intero. Quindi, c’è bisogno di rendere il sangue non coagulabile. Nel caso della provetta da emocromo l’anticoagulante utilizzato è l’EDTA (acido etilendiaminotetracetico) che legando il calcio rende incoagulabile il sangue.

I vetrini

I vetrini si distinguono in vetrini portaoggetti (primi) e coprioggetti (secondi). Il vetrino portaoggetti è una piccola lastra di vetro di dimensioni standard utilizzata in microscopia per collocarvici sopra il campione da osservare. Il campione viene ricoperto da un'altra piccola lastra, di plastica, o di vetro, chiamata vetrino coprioggetti. Il campione è posto tra il vetrino portaoggetti ed il vetrino coprioggetti, che a loro volta possono essere sistemati sul tavolino portaoggetti del microscopio per l'osservazione. Nei preparati a fresco, in cui il campione è bagnato con una goccia d'acqua, il vetrino coprioggetti aderisce fermamente al campione e al vetrino portaoggetti grazie alla forza di tensione superficiale presente all'interfaccia delle due lastre. Quando l'acqua evapora si assiste ad una perdita di adesione.

I coloranti: May-Grunwald e Giemsa

Il microscopio ottico

• 1 - Tubo verticale per fotografia;
• 2 - Oculare;
• 3 - Stativo;
• 4 - Revolver porta obbiettivi;
• 5 - Tavolino portaoggetti;
• 6 - Condensatore;
• 7 - Manopole di messa a fuoco;
• 8 - Sorgente di luce.

Storia

La nascita e lo sviluppo della diagnostica ematologica sono stati scanditi da una serie di scoperte a partire dalla seconda metà del XVII secolo, quando Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise, in una lettera alla Royal Society di Londra, la prima descrizione dei globuli rossi che aveva potuto osservare nel suo stesso sangue con l’ausilio di un rudimentale microscopio. Anche se viene riportato che molto probabilmente fu Marcello Malpighi, di Bologna, il primo ad osservare, nel 1661, i globuli rossi nel lume dei capillari di uomo e animale.

Un altro pilastro dell’ematologia di laboratorio fu la scoperta, nel 1877, della colorazione triacida da parte di Paul Ehrlich che permetteva di distinguere nuclei, citoplasma e fini dettagli cellulari. Con questa scoperta cominciò l’era della morfologia ematologica. Romanowsky inventò una tecnica di colorazione che rese visibili le strutture intracellulari, e Gustaaf Giemsa, nei suoi studi sul rilevo della malaria, descrisse un metodo per stabilizzare e standardizzare questa tecnica.

L’ultimo periodo di questa fase pretecnologica non fu legata ad un progresso tecnico, ma al “genio” di Maxxwell Wintrobe che standardizzò la procedura a quei tempi più affidabile, quella della misura del Packed Cell Volume (PCV), poi diventato ematocrito. Avendo a quell’epoca anche la possibilità di contare i globuli rossi e di misurare l’emoglobina, il “genio” seppe calcolare l’MCV (visto che il PCV era funzione sia del numero che della grandezza dei globuli rossi). Era chiaro che il contenuto emoglobinico medio potesse ottenersi dalla divisione del valore dell’Hb per il numero dei RBC. Ma il “genio” aveva bisogno di conoscere la concentrazione emoglobinica e capì che, aggiungendo il parametro volume si poteva ottenere la concentrazione emoglobinica corpuscolare media. Questi indici, che prendono il nome dall’autore, rimangono uno strumento indispensabile nella diagnostica dei disturbi dell’eritropoiesi, nonostante la confusione provocata da recenti articoli nei quali viene riportato che il parametro MCH è da preferire nella valutazione dell’ipocromia.

Un’altra rivoluzione dell’ematologia di laboratorio si ebbe quando Wallace Coulter sviluppò il primo analizzatore automatico per la conta e la determinazione delle dimensioni cellulari e lo presentò nel 1956. Era uno strumento a singolo canale che rivoluzionò i metodi manuali di conta in camera, tediosi e imprecisi. La tecnologia ad impedenza, implementata su questi analizzatori, è basata sul principio che il sangue è un cattivo conduttore di elettricità, mentre certi diluenti sono buoni conduttori. Quindi le cellule, passando attraverso un orificio capillare tra 2 elettrodi, spostano una proporzionale quantità di fluido conducente, aumentando la resistenza elettrica e causando una corrispondente variazione di potenziale fra gli elettrodi con la produzione di impulsi, l’amplificazione dei quali è proporzionale alla grandezza delle stesse. In poco tempo questi analizzatori furono in grado di fornire Contee Volume delle particelle e, in automatico, anche gli Indici di Wintrobe. Insomma, si passò da poche decine di test al giorno (refertati a mano in bella calligrafia), alla possibilità di eseguirne centinaia.

Un secondo principio fisico trovò applicazione nel conteggio cellulare: quello ottico, basato sulla rilevazione dei cambiamenti e della deviazione che un fascio di luce incidente subisce quando colpisce le cellule che scorrono in fila indiana. Il fascio di luce, originato dall’impatto con le cellule, colpisce fotodiodi e fotomoltiplicatori che emettono, in conseguenza dell’irraggiamento, impulsi elettrici che vengono analizzati elettronicamente. Un ulteriore miglioramento si ottenne mediante un principio complementare: la focalizzazione idrodinamica. Nasce la cosiddetta citometria a flusso: le cellule per mezzo di un liquido di sheath sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta.

Dopo l’implementazione dei primi contatori automatici, la situazione era questa: disponibilità di conte e Indici di Wintrobe facilmente disponibili, con qualche nuovo indice e anche, come in questo caso, asterischi di allarme su difficoltà nella conta, formula differenziale ancora affidata ad un morfologo. Ricordo che quando ho cominciato questo lavoro andavo con un collega in un laboratorio privato a leggere le formule (con le caselline da 10 da tenere sotto controllo per non “sballare”). Con la possibilità di avere rapidamente i dati numerici del CBC, così come avviene sempre quando c’è un avanzamento tecnologico in laboratorio, le richieste del test aumentano in maniera esponenziale. Pertanto, la formula differenziale diviene il “collo di bottiglia” nella refertazione del CBC con i vetrini che cominciano ad accumularsi sui banchi di lavoro.

A questo punto interviene l’industria che rendendosi conto che la formula differenziale rappresenta un ostacolo al fluire rapido dei dati tenta di automatizzare la formula differenziale, prima con la famigerata formula a 3 popolazioni. Poi con la formula a 5 (a volte 6) popolazioni con l’introduzione di un altro parametro (citochimico o di scatter di fluorescenza) oltre al parametro volume. Insomma, siamo arrivati ai moderni analizzatori che stiamo utilizzando che oltre ad esaudire i compiti per cui sono stati creati: eseguire delle conte precise ed accurate, contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali. E come compito aggiuntivo, hanno la possibilità di segnalare in modo più o meno sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature. Nascono i cosiddetti Flag. Questi sono i dati numerici dell’emocromo che riguardano i globuli rossi.

Ma da dove si comincia a leggere un emocromo? Dalle poche informazioni che abbiamo del paziente, quindi dall’ID e dal setting. Cioè il nome può darci qualche informazione sulla razza e sul sesso. Il reparto può darci informazioni sul tipo di situazione in cui si trova il paziente. In questo caso il paziente è in pronto soccorso e quindi probabilmente si tratta di una situazione d’urgenza.

Esempio: di fronte a questi dati citometrici e con notizie mancanti del sesso del soggetto, il CBC potrebbe essere passato per normale. Diverso è se abbiamo l’informazione del sesso. Con questa informazione l’esame, in effetti, diventa normale, mentre diverso è se vi avessi fatto comparire un nome maschile. Come vedete la WHO ha stabilito a 13 g/dL il limite inferiore dell’HB per i maschi e a 12 per le femmine. Non tutti sono d’accordo, con lavori anche importanti che riportano limiti diversi. Quello che è certo è che c’è una differenza fra popolazione bianca e nera sia per i maschi che per le femmine.

Ancora: Group Hemoglobin, g/dL White men, y 13.7 20-59 60+ 13.2 White women, y 20-49 12.2 50+ 12.2