Appunti di sviluppo di farmaci biotecnologici

SVILUPPO DI FARMACI BIOTECNOLOGICI (Gandin)

05/03/2021

Introduzione

08/03/2021 LEZIONE 1

Definizione di farmaco (drug): molecola, o insieme di sostanze o molecole (principio

attivo ed eccipienti) con azione specifica che ha un target molecolare (funzione

fisiologica preesistente), ad attività su un enzima od un recettore, per ristabilire

equilibrio fisiologico compromesso o funzione fisiologica corretta, o anche a scopo

diagnostico o preventivo (risonanza con contrasto, la sostanza viene assunta dalla

persona, farmaci usati nella diagnostica per immagini). Non deve essere né cibo né un

supplement, integratore. La normativa è diversa nei diversi campi. Ogni sostanza

riconosciuta dal testo della farmacopea, ha carattere precettivo, con funzione

regolatoria, ai sensi della legge è un testo di riferimento che contiene tutte le sostanze

considerate farmaci ai sensi della legge. Sono contenute tutte le informazioni sulla

sostanza, formula, struttura, composizione aa, modo di preparazione, usi, effetti

avversi. Ha anche tutte le indicazioni sui metodi da utilizzare per verificare identità

della sostanza, qualitativo e quantitativo. Informazioni anche sui contenitori dei vari

farmaci.

Farmacopea europea, testo che armonizza i contenuti di tutte le farmacopee dei

singoli stati in uno unico. Istituzione di una farmacopea internazionale per armonizzare

i contenuti di tutte le comunità statali.

Per questioni di sicurezza e di produzione. Problemi per il produttore perché deve

seguire le farmacopee singole per poter commercializzare il prodotto in ogni diverso

paese. Il vantaggio è soprattutto per il paziente perché può conoscere e avere accesso

a tutti i farmaci approvati.

Tentativo di creare una farmacopea internazionale, unica in tutto il mondo per

questioni di sicurezza, per la produzione, per armonizzare in modo da rendere

accessibili tutti i farmaci approvati da parte del paziente ed è utile per i produttori

perché vengono armonizzate le specifiche per produrre il farmaco e analizzarlo.

Glossario

- Composizione del farmaco

- Principio attivo

- Eccipienti

- Nome del marchio

- Nome genetico del principio attivo

- Nome chimico

FARMACOPEA: definizioni, metodi di analisi e riconoscimento, preparazione, indicazioni

per la produzione, convalide del processo

Cosa rende un farmaco tale? La dose

Effetto terapeutico ed effetti avversi, si verificano alle dosi terapeutiche

Efficacia del farmaco va presa in considerazione insieme alla sua sicurezza. Condizione

essenziale è efficacia e sicurezza per l’approvazione. Valutare la sicurezza: prendo in

considerazione l’indice terapeutico, dose tossica su dose efficace.

Indice terapeutico o finestra terapeutica, sono la stessa cosa.

Vie di somministrazione, ci interessa per lo sviluppo di un farmaco.

Due grandi famiglie: enterali e parenterali.

Enteros (intestino), hanno a che fare col sistema gastro-intestinale. Parenterali sono

per lo più quelle infusive (iniettive). Altre due vie classificate nelle parenterali, ma

sono due cose a parte: via inalatoria e via topica.

Differenza più grande tra parenterali ed enterali: proteine soggette a degradazione

nella via enterale, quantità che raggiunge il sangue molto bassa, va somministrato

molto più farmaco, una parte del farmaco viene persa per il pH dei succhi gastrici, ma

anche per effetto di primo passaggio. Tutte tali preparazioni vengono drenate

attraverso la vena porta nel fegato. Poi viene trasformato con inattivazione del

farmaco. Dovrò iniettare quantità maggiore. Anche quando inietto il farmaco per via

parenterale non è detto che la quantità che arrivi sarà uguale a quella somministrata

ma almeno non c’è la presenza di tale effetto.

Non tutte le vie enterali subiscono l’effetto di primo passaggio allo stesso livello. Le vie

parenterali però non lo subiscono affatto.

98% dei farmaci biotech somministrati per via parenterale.

Svantaggi delle vie parenterali: sono vie iniettive, quindi il farmaco deve avere delle

caratteristiche, deve essere solubile, o comunque devo portarlo in un mezzo

disperdente, discomfort per il paziente o compliance, la pratica deve essere sterile e

anche tutto il materiale iniettato (pirogeni). Il preparato farmaceutico deve essere

sterile quindi. Sono quindi vie di somministrazione più costose.

Vantaggio: sono più veloci delle enterali e più riproducibili. La quantità che raggiunge il

sangue è più standardizzata rispetto la media della popolazione.

Per via sottocutanea la quantità deve essere piccola, maggiore per la via

intramuscolare e venosa. Quella sottocutanea soffre di variabilità, le altre molto meno.

Intradermica è più profonda della sottocutanea, quantità più piccola della muscolare

ma abbiamo il vantaggio che il farmaco è assorbito molto lentamente. Potrei volere

assorbimento lento ma prolungato nel tempo. Intravenosa dà la velocità maggiore,

posso anche somministrare a flusso continuo. Procedura invasiva e più costosa perché

richiede operatore sanitario, sito di iniezione può essere usato per un tempo limitato

perché il sito collassa.

Problema: le proteine possono aggregarsi per via intravenosa.

Via più desiderata è quella orale. Non ci sono farmaci biotech in questo senso. Ma

molti sono in fase di studio per la via sottolinguale, assorbimento rapido perché parte

molto ricca di vasi. Queste fenestrazioni però non sono grandi quindi assorbimento di

macrobiomolecole non sempre è efficace. L’effetto di primo passaggio è praticamente

nullo.

La via inalatoria o polmonare è molto studiata, viene impiegata per farmaci con effetto

a livello del parenchima polmonare, meno efficace per farmaci che devono arrivare a

livello sistemico. Il problema è che non è facile la standardizzazione, per la quantità di

muco presente. E richiede device di somministrazione particolari.

Farmacocinetica: quello che il corpo fa ad il farmaco. Parametri: assorbimento,

distribuzione, metabolismo, eliminazione.

Farmacodinamica: ciò che il farmaco fa al nostro corpo. Parametri: parametri che

interferiscono con l’efficacia del farmaco, interazione con il bersaglio del farmaco.

12/03/2021

Farmacocinetica: assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione.

15/03/2021

Farmaci più difficili da sviluppare sono quelli per organi e tessuti poco raggiunti dal

sistema circolatorio (tessuto adiposo, tessuto osseo). Sistema nervoso per la barriera

ematoencefalica. E barriera placentare.

Pharmacokinetic molecular optimization per modificare il profilo farmacocinetico della

molecola. Si può lavorare sulla solubilità, funzionalizzarlo con policationi, modificare la

dimensione.

Se scarsamente assorbito posso aumentare la solubilità, posso cambiare dimensioni e

carica funzionalizzando la molecola con policationi, proteggere particolari gruppi

chimici coniugando la molecola con siti facili da idrolizzare o da ossidare in modo da

inattivare o rallentare il suo metabolismo. Se ha emivita troppo breve: posso cambiare

la via di somministrazione. Se troppo tossico cambio via di somministrazione, uso

antagonisti, alcalinizzo, favorisco eliminazione, funzionalizzo .

Se il farmaco viene metabolizzato troppo velocemente posso proteggere i gruppi

reattivi.

Se l’emivita è troppo bassa? posso cambiare via di somministrazione. Se è tossico

posso cambiare via di somministrazione, posso abbassare tempo di emivita, posso

somministrare un antagonista o sostanza che stabilizza e aumenta eliminazione, o

funzionalizzare il farmaco (drug delivery) in modo da fargli raggiungere un bersaglio

specifico.

Prima si andava a tentativi, ora il processo di sviluppo è più razionale.

Dal 2010 si seleziona un bersaglio molecolare suscettibile al trattamento di una

patologia (rational design).

Prognostico: alterazione può essere indice che la patologia si svilupperà.

predittivo: sopravvivenza media/totale etc. è legato alla risposta di successo

terapeutico. Non solo al farmaco ma in risposta ad ogni tipo di terapia.

1. Modelli in vitro

2. Da affiancare agli studi in silico con modelli computazionali

Per legge il farmaco va testato almeno su due modelli animali

3. Validazione percorso di scaling up e produzione

4. Formulazione e stabilità della formulazione

5. Trial clinici

29/03/2021

Drug development process: dall’idea al medicinale passano in media 15 anni e da

10.000 molecole si arriva ad una molecola approvata ad uso terapeutico. Passi da

percorrere: discovery e razionalizzazione, fase di validazione in vitro o test pre-clinici

in laboratorio e poi nei modelli animali e poi le 3 fasi cliniche seguite da approvazione

e commercializzazione e poi fase 4.

Qualità, sicurezza, purezza. Sono rilevanti le contaminazioni del farmaco e delle cellule

e del medium. Approvazione dei prodotti da FDA e EMA. All’interno vi sono delle

sottocommissioni che si occupano di biofarmaci.

Non serve far approvare il farmaco in ogni paese.

Target validation: silenzio target

Variabilità di espressione da valutare (sesso, età, univocità del target, etc.). vedere se

il target è raggiungibile dal farmaco.

Solo il 10% dei target è raggiungibile dai farmaci.

Fenomeni di compensazione con isoforme dello stesso enzima o di enzimi diversi che

si sostituiscono alla proteina che ho bersagliato col farmaco. Target undrugable.

1. saggi in vitro e studi in silico con modelli computazionali risparmiando tempo e soldi

simulando interazione con la mia molecola con il target. Ipotizzo attività ma devo

conoscere struttura e binding site della molecola. Prima faccio screening in silico e poi

verifico attività in vitro. Sistemi biochimici con enzimi isolati e vedo se c’è interazione

con test colorimetrici etc. saggi cellulari e con tessuti isolati (modelli ex vivo).

2. verificata l’azione della mia molecola, seleziono nel gruppo di molecole quelle più

promettenti. La legge prevede obbligatorietà di testare i farmaci sui modelli animali

(almeno 2 modelli animali), uno superiore e uno inferiore. Danno indicazione, anche se

limitata dal corredo genetico diverso dall’uomo. Serve per avere informazioni su

efficacia e tossicità del farmaco. Praticati secondo linee guida e limitando la sofferenza

dell’animale. Utili per ottenere informazioni sulla farmacocinetica anche se spesso il

corredo enzimatico è diverso dall’uomo quindi sono solo studi preliminari da ripetere

nell’uomo.

3. fasi cliniche. Va fatta formulazione in parallelo e fase di produzione su larga scala.

Lo scaling up va validato con uniformità di produzione con analisi dei lotti. Studi di

stabilità. Scelgo via di somministrazione in base al principio attivo (solubile o no), in

base al paziente di destinazione etc. la formulazione serve per rendere stabile il

principio attivo e non solo per la somministrazione.

4. test clinici (trial). Seguono parere di una commissione etica che valuta

ragionevolezza.

Fase 1: sicurezza e tollerabilità, si inizia a studiare farmacocinetica e farmacodinamica.

Solo se è efficace e ben tollerato si passa alla fase 2. Volontari sani

Fase 2: dura di più, di solito due anni, e solo il 35% dei farmaci la superano. I pazienti

aumentano e non sono volontari sani ma pazienti. Si raffina la conoscenza di

farmacocinetica e dinamica ed efficacia. Si valuta la risposta dose-effetto e si indaga il

dosaggio migliore senza avere effetti avversi. Vengono coinvolti pazienti malati.

Fase 3: multicentrica, coinvolge più centri e più di 1000 pazienti. Si inserisce la

valutazione della comparazione con il placebo o con un gold standard di riferimento

usato in precedenza. Si valuta rischio-beneficio. Ultima fase. Dura fino a 5 anni. Si

assembla un dossier su tutto quello che è stato fatto con la data molecola con dati

molto dettagliati e che viene inviata alle autorità competenti (EMA, AIFA, FDA). Non è

un processo statico, può essere richiesta revisione del dossier se non si ha immissione

in commercio per via emergenziale. Infine, vi è approvazione.

Fase 4: post marketing, il farmaco continua ad essere studiato dalle agenzie

regolatorie. Si tiene conto di tutto ciò che avviene in termini di reazioni avverse e

indesiderate, interazione con altri farmaci o effetti avversi che possono essere positivi

per essere sfruttati per nuovi utilizzi del farmaco stesso. Non ha una durata temporale

prefissata. Ci possono essere parziali o totali ritiri dei farmaci in via di nuove analisi e

valutazioni per capire se ci sono cause relazionali o temporali. Ritiro per effetti

collaterali a lungo termine. Si studiano interazioni o combinazioni con altri farmaci che

nello studio clinico non vengono valutati di solito.

In parallelo agli studi clinici si tiene in considerazione che gli studi sul farmaco non si

fermano perché si cerca di capire il meccanismo d’azione per arrivare a scoprire e

disegnare nuovi farmaci più promettenti. Si opera riposizionamento della molecola.

Anche in vista di trattare altre patologie.

Evidenze di tipo genico o proteico: alterazione o prodotto che porta a patologia o che

protegge dalla patologia.

- Differenze tra molecole piccole e biologiche

Piccole modifiche nelle piccole molecole determinano grandi differenze

nell’effetto terapeutico. Nelle biomolecole un piccolo cambiamento non porta a

modifica nel profilo di attività terapeutica.

Sviluppo dei biofarmaci: cambia un po' il drug discovery e il drug design rispetto

alle piccole molecole.

Step 1: devo conoscere patologia e sapere quale molecola è suscettibile di

interazione per ottenere effetto diagnostico o curativo. Seleziono gene target e

identifico un modo per isolarlo e per clonarlo. Faccio esprimere il prodotto del

gene in un sistema adatto (cellulare). Ottenuto il prodotto verifico espressione e

livello di espressione e purifico (3 fasi di purificazione successive, iniziale,

intermedia e finale) e verifico la struttura molecolare e la funzione. Produzione e

verifica del prodotto. From function to gene approach. Altro modo di sviluppo è

from gene to screen (ottengo librerie di cDNA da fonti conosciute, faccio analisi

e identifico sequenze principali e le clono ed esprimo. Ottenuto il prodotto

purificato, lo testo. Simile alla creazione di migliaia di molecole a caso che poi

testo, trial and error. Approccio casuale e non razionale). Pro del from function:

so già se il target è drugable e suscettibile di interazione. Contro: più costoso e

porta via più tempo. È più veloce e semplice esprimere tutto, purificare e vedere

se funziona, ho più probabilità che qualcosa funzioni.

Step 2: ottimizzazione della resa e del sistema di espressione.

Step 3: molecular optimization per massimizzare farmacocinetica e

farmacodinamica e potenziale terapeutico. Modificare solubilità modificando

gruppi funzionali. Nei prodotti bio l’ottimizzazione modifica la farmacodinamica

e la farmacocinetica perché è fortemente limitato dalla natura stessa della

molecola. Posso ridurre metabolismo o aumentare l’escrezione. Lo faccio con

metodi di simulazione computazionali o svolgo saggi di valutazione dell’attività

e tento di avere relazioni struttura- attività in modo da capire fondamenti che

portano a farmacocinetica e dinamica e modifico le caratteristiche con

modifiche strutturali. Esempio: posso modificare la biomolecola che pesa meno

di 50 kDa e facilmente eliminata in modo da aumentare la sua emivita

coniugandola con un dominio Fc con uno spaziatore chimico o con residui

specifici in modo che la coniugazione porta a una dimensione e ingombro

maggiore e quindi vi è meno attacco da enzimi deputati al metabolismo.

Aumento emivita.

tecniche strumentali per verificare struttura, folding (spettroscopia Raman) e

meccanismo/funzione (taglio proteolitico con fluorescenza emessa da molecola

coniugata al substrato)

Stabilità chimico-fisica: denaturazione, aggregazione, si lavora sugli eccipienti e

packaging. Instabilità chimica dovuta a ossidazione e proteolisi e si lavora su eccipienti

e biomolecola in sé.

Test da fare per garantire purezza e stabilità: ci sono le indicazioni nelle linee guida per

tali validazioni. Il compito del biotecnologo e dell’equipe in ambito regulator, risponde

alla autorità competente e ricerca metodi sufficienti per garantire stabilità e purezza

ma in linea con la farmaceutica. Non si usa una tecnica soltanto ma si usano più

tecniche.

Aggregazione e precipitazione dovuti a interazione idrofobica tra le proteine. Può

anche avvenire durante la filtrazione perché le molecole vengono a contatto tra loro

tramite avvicinamento.

Stabilità microbiologica: difficile da ottenere se non ho intervento precedente, per

natura questi prodotti portano con sé contaminazioni. Per garantire per 6 mesi una

certa stabilità, non è sufficiente usare una formulazione con agenti antibatterici o

conservanti ma è necessario sterilizzare il prodotto di partenza, ma non è semplice. È

necessario fare ciò nel caso dell’iniezione.

Metodi: fisici e chimici.

Fisici: autoclave, irradiazione, filtrazione.

Chimici: composti gassosi come formaldeide ed etanolo con effetto nei confronti dei

patogeni.

Gli unici utilizzabili sono irradiazione (ma non per DNA ed RNA), filtrazione (il più

impiegato, si fanno filtrazioni successive). Il metodo chimico viene usato solo se non ci

sono particolari della proteina esposti che possono reagire con queste sostanze.

Strategie di acceleramento nello sviluppo del farmaco: sviluppato per più applicazioni

in parallelo da usare per molte patologie diverse, si fa per risparmiare soldi e per

cercare di avere più approvazioni possibili per le diverse malattie. Si fa anche per le

piccole molecole ma mol