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più o meno uniformi. Alla raccolta si effettua una caratterizzazione del germoplasma con le informazioni

relative agli individui del campione; si annotano su delle schede le caratteristiche del materiale

campionato, per fornire al breeder elementi utili per il successivo sfruttamento del germoplasma.

Esiste una partnership globale dedicata alla riduzione della povertà di aree rurali, all’incremento della

sicurezza alimentare, al miglioramento di salute e nutrizione umana e al management sostenibile delle

risorse naturali: il CGIAR (Consultative Group on International Agricultural Research). Questo possiede la

collezione di risorse genetiche più importante al mondo.

Le collezioni di semi possono essere di quattro tipi:

- di base, molto ampie, non intese alla distribuzione per coloro che operano in miglioramento genetico e

quindi volte per lo più alla salvaguardia e non alla valorizzazione;

- duplicate (o di back-up), costituite per sopperire ad eventuali disastri accaduti a collezioni di base;

- attive, che comprendono una core collection rappresentativa della variabilità disponibile nelle collezioni di

base, resa disponibile a chi ne fa richiesta;

- di lavoro per il breeder, composte da materiale di èlite, generalmente qualche varietà locale o comunque

varietà e non specie, da cui il breeder si aspetta alte probabilità di successo a breve-medio termine. Per lo

più il miglioratore fa riferimento alle collezioni di lavoro; tuttavia per ad esempio reperire geni di resistenza, è

necessario reperirli nelle collezioni attive.

Per conservare i semi si effettuano raccolta, parziale disidratazione e conservazione a basse

procede mantenendo l’UR

temperature. Per la conservazione a lungo termine si al 3-7% in celle

frigorifero a -20°C. Per la conservazione a medio termine si procede in locali a 4°C con UR al 30% circa.

Si effettuano dei test periodici di germinabilità e quando questa si riduce (del 10% o più), è previsto un

ringiovanimento, ossia si raccoglie il seme prodotto da 50-100 piante con caratteristiche conformi a quelle

inizialmente rilevate; ciò perché è stato dimostrato che in questa fase possono verificarsi mutazioni.

Per soddisfare le richieste è necessaria anche la moltiplicazione del germoplasma. La moltiplicazione in

campo delle accessioni è relativamente semplice per le specie strettamente autogame; mentre per

quelle allogame deve avvenire in condizioni di totale isolamento per ciascuna accessione.

In ogni caso, sia il ringiovanimento che la moltiplicazione devono avvenire evitando contaminazione genetica

delle accessioni e in luoghi con caratteristiche simili a quelli di raccolta.

Non sempre possono essere conservati i semi, in quanto: alcune specie sono propagate per via

vegetativa e dunque la propagazione per seme porterebbe a segregazione e perdita di caratteristiche;

alcune specie non producono semi (es. banano); i semi di alcune specie sono recalcitranti (non

ortodossi) cioè perdono subito di germinabilità se conservati tal quali o anche se sottoposti a

specie tropicali come l’avogado

disidratazione (è il caso di e di alcune tipiche di climi temperati come

castagno e noce). In tutti questi casi si procede alla conservazione in vitro del germoplasma. Si possono

utilizzare tre tecniche per la conservazione in vitro che si basano sulla totipotenza delle cellule:

- micropropagazione; si prelevano espianti e si coltivano in un mezzo di coltura in modo da rigenerare

l’organismo intero; il germoglio viene posto in un mezzo di coltura con rapporto ormonale sbilanciato a

favore delle citochinine in modo da ottenere un germoglio multiplo. A questo punto si separano i germogli e

vengono messi in mezzi di coltura con rapporto ormonale sbilanciato a favore delle auxine ottenendo la

radicazione e quindi la plantula che verrà poi messa a dimora per ottenere la pianta;

si può prelevare l’espianto o fogliare o caulinare che viene sterilizzato e inoculato

- propagazione da callo;

in mezzo callogenico in modo da ottenere il callo. Questo viene messo in mezzo di coltura sbilanciando il

rapporto ormonale a favore delle citochinine e ottenendo caulogenesi con germogli multipli che verranno

posti in mezzo di coltura con rapporto ormonale sbilanciato a favore delle auxine ottenendo rizogenesi e

quindi la plantula; questa può essere messa a dimora se il sistema vascolare delle radici è ben connesso

con quello del germoglio; sempre partendo da un callo si può ottenere direttamente l’embrione con

- embriogenesi somatica;

radichetta e apice vegetativo; questo si fa sviluppare in mezzo di coltura ottenendo la plantula.

Un’importante tecnica di conservazione del germoplasma è la crioconservazione, ossia lo stoccaggio

in N liquido a -196°C. I vantaggi derivati da questa tecnica sono:

- contenimento degli spazi (in 35 l di N si possono conservare fino a 6000 espianti);

(limitati solo al costo dell’N liquido che è accessibile);

- contenimento dei costi di conservazione

- possibilità di conservare un ampio range di organi e tessuti;

- sicurezza sanitaria elevata a tale temperatura;

- conservazione per tempi virtualmente illimitati (le cellule vegetali entrano in quiescenza assoluta).

Per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio che romperebbero le strutture cellulari, è necessaria

una procedura preparatoria di disidratazione degli espianti; in questo modo la soluzione

citoplasmatica va incontro a vitrificazione, ossia solidificazione senza formazione di cristalli (la

soluzione acquosa viene portata a uno stato amorfo). Si effettua una procedura di slow cooling

(raffreddamento lento) di 1°C al minuto fino a -40°C e successivamente raffreddamento rapido fino a -

l’acqua extracellulare,

196°C. In questo modo, che ghiaccia prima essendo meno concentrata,

acqua dall’interno della cellula disidratandola.

richiama 5

Per valutare e caratterizzare il germoplasma vi sono diversi metodi:

- usi di descrittori o marcatori morfologici (caratteristiche bio-agronomiche standardizzate coltura per coltura);

caratteristiche, stabilite a livello internazionale, per descrivere una coltura;

in base all’adattabilità

- a stress biotici e abiotici;

- uso di marcatori molecolari; si valuta il germoplasma in base alle caratteristiche del DNA; si possono

analizzare centinaia di migliaia di loci in poco tempo e con poco dispendio economico; stanno prendendo il

sopravvento sui marcatori morfologici (descrittori);

- database di germoplasma.

DESCRIZIONE DELLA BIODIVERSITÀ

Descrivere la biodiversità è importante per:

descrivendo la biodiversità siamo in grado di monitorare l’erosione

- salvaguardia della biodiversità;

genetica e capire se è necessaria salvaguardia; stabilire se una collezione dovrebbe essere ampliata perché

raccoglie poca variabilità genetica; stabilire quale materiale collezionare, ad esempio ci si può accorgere che

alleli poco rappresentati nella collezione siano presenti con maggior frequenza in particolari sub-popolazioni

(concetto di stratificazione) o siano addirittura presenti solo in alcune sub-popolazioni; massimizzare la

diversità genetica in una collezione, facilitando anche l’identificazione di sinonimie, false sinonimie;

- valorizzazione della biodiversità; descrivendo la biodiversità è possibile costituire le core collection, ossia

piccole porzioni delle collezioni di base, che comprendono una variabilità genetica comparabile con esse; si

possono associare caratteristiche agronomicamente utili a particolari genotipi e proteggere genotipi di

particolare pregio (anche da frodi).

La biodiversità può essere descritta a livello fenotipico, sulla base di caratteristiche osservabili

morfologiche (es. colore e forma del frutto) o fisiologiche (es. resistenza a siccità o parassiti); o a livello

molecolare (isoenzimi e differenze a livello della sequenza di DNA).

DIVERSITÀ FENOTIPICA

La diversità genetica fenotipica può interessare caratteri qualitativi e caratteri quantitativi.

I caratteri qualitativi (Mendeliani), sono quelli per cui gli individui di una popolazione possono essere

raggruppati in classi fenotipiche discrete (variabilità discontinua), ad esempio resistenza a malattie,

colore, ecc. Sono controllati da uno o pochi geni e sono scarsamente o per niente influenzati

dall’ambiente. La variabilità dei caratteri qualitativi in una popolazione può essere descritta in termini di

frequenze alleliche, ossia di quantità di un determinato allele rispetto alla popolazione stessa.

La resistenza alle malattie è spesso qualitativo (piante resistenti e suscettibili) tuttavia a volte è un

carattere quantitativo perché esiste una scala di suscettibilità.

I caratteri quantitativi sono metrici e si distribuiscono secondo una curva normale, con gli individui di

una popolazione molto grande che presentano variabilità continua per la possibilità di infinite classi

fenotipiche. Sono caratteri controllati da più geni, ciascuno dei quali segrega secondo modalità

e l’influenza

mendeliane. La presenza di più geni che controllano lo stesso carattere ambientale sul

fenotipo determinano il caratteristico tipo di variabilità (continua a distribuzione normale). Esempi di caratteri

quantitativi sono: produttività, resistenza a stress abiotici (siccità), resistenza ad alcuni stress biotici,

qualità tecnologica (es. contenuto proteico frumento). La variabilità fenotipica di caratteri quantitativi in

una popolazione si misura quantificando la dispersione dei dati intorno al valore medio, in termini di

2 (σ) o

varianza (σ ), deviazione standard coefficiente di variazione (σ/µ).

RICHIAMI DI STATISTICA

Media (µ): sommatoria dei valori esaminati diviso il numero degli elementi.

2

Varianza (σ ): rapporto fra la sommatoria dei quadrati degli scarti dalla media ed i gradi di libertà. È un

parametro che misura per una popolazione la distribuzione dei valori di una variabile attorno alla loro media.

Gradi di libertà (g.l.): numero di classi di valori indipendenti rilevati in una sperimentazione.

Deviazione standard (σ): radice quadrata della varianza.

Coefficiente di variazione (σ/µ): rapporto fra deviazione standard e media.

DIVERSITÀ A LIVELLO MOLECOLARE 1

Mentre un marcatore morfologico è il fenotipo derivante dalla presenza di un determinato allele ad un locus

cromosomico genico che controlla un carattere qualitativo, un marcatore molecolare è una sequenza di

DNA in corrispondenza di un locus cromosomico (es. ATTCG). Se in una popolazione esistono

1 Un locus è una specifica porzione cromosomica in cui si trova una determinata sequenza. 6

quest’ultimo è detto

almeno due marcatori per lo stesso locus, polimorfico. Un locus polimorfico è

dunque associato ad almeno due marcatori morfologici (es. giallo e verde) oppure almeno due

marcatori molecolari (es. ATTCG e ATTTG). Una marcatore a un locus polimorfico permette di

discriminare individui (e quindi descrivere la diversità genetica) non più a livello fenotipico ma sulla base

del marcatore stesso, ovvero di quella sequenza di DNA che porta un determinato locus.

I marcatori morfologici, che discriminano sulla base di poche caratteristiche discrete osservabili sono

limitati; i marcatori molecolari, che discriminano sulla base di differenze di DNA (3miliardi di coppie di basi

nell’uomo) sono invece virtualmente moltissimi.

La descrizione della biodiversità è utile a proteggere genotipi di pregio ed eventualmente evitare frodi;

in passato si utilizzavano i marcatori morfologici ma per la limitatezza di essi, questo metodo non è più molto

attendibili. Con i marcatori molecolari è più semplice caratterizzare e discriminare perché ci forniscono

molte più informazioni (es. S. Marzano).

Si può massimizzare la diversità presente in una collezione con la costituzione di core collection. Per

la salvaguardia e quindi per costituire la core collection, si scelgono individui che siano abbastanza

diversi fra loro (es. dendrogramma 42 genotipi pomodoro).

Alcuni genotipi sono associabili a caratteristiche agronomicamente utili (es. suscettibilità o resistenza a

malattie). Se un locus genico che controlla un carattere importante (es. risposta a stress) è strettamente

associato a un locus polimorfico (identificato da più marcatori in una popolazione) allora si potrà avere

associazione statistica tra un allele favorevole (es. resistenza) ed un marcatore (es. presenza di una

particolare banda). Il breeder potrà quindi fare richiesta alle banche del germoplasma di accessioni che

presentano quella determinata banda. Quindi l’utilizzo di marcatori potrebbe sicuramente aiutare il breeder a

utilizzare il germoplasma salvaguardato, il che porterebbe a una sua valorizzazione.

CLASSI DI MARCATORI MOLECOLARI

Le classi di marcatori molecolari non sono altro che le tecniche di biologia molecolare utilizzate per

caratterizzare le sequenze di DNA e dunque evidenziare marcatori molecolari. Esistono marcatori PCR,

microsatelliti (SSR) e SNP.

Molti marcatori molecolari si basano sulla PCR, tecnica molto utilizzata per produrre tante copie di specifiche

porzioni di DNA (clonaggio). Il clonaggio tramite PCR è chiamato spesso amplificazione, in quanto permette

di amplificare frammenti di DNA a partire da piccole sequenze a monte e a valle del frammento stesso. Per

la PCR sono necessari:

- DNA stampo;

- coppia di primer (sintetici) di DNA a singolo filamento, complementari alle sequenze a monte e a valle del

frammento da amplificare;

- DNA polimerasi stabile al calore (Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus acquaticus);

- buffer di reazione;

- nucleotidi.

La PCR si articola in tre fasi:

- denaturazione a 94°C; a tale temperatura si rompono i legami H del doppio filamento di DNA e si

separano le due eliche;

- appaiamento (normalmente a 55-60°C); i primer, disegnati per essere complementari a monte e a valle

del filamento, si appaiano con le eliche denaturate mediante legami H;

- estensione a 72°C; la Taq polimerasi catalizza la sintesi di DNA con la formazione di legami

dai primer in direzione 5’→3’, utilizzando i

fosfodiesterici a partire nucleotidi trifosfati (dNTP).

A questo punto vengono effettuate 30-35 ripetizioni del ciclo denaturazione-appaiamento-estensione

utilizzando un termociclatore. Si ottengono in questo modo tantissime copie della porzione di DNA

20

compresa fra i primer. Con 20 cicli di PCR si producono 2 copie di DNA.

I microsatelliti sono sequenze ripetute in cui ciascuna unità è composta da 2-5 paia di basi. Come già

visto, le mutazioni in loci che contengono regioni microsatelliti sono molto frequenti e consistono in un

diverso numero di unità di sequenze ripetute.

I marcatori microsatelliti si ottengono per amplificazione PCR della regione microsatellite, per mezzo di

primer fiancheggianti la regione stessa.

I marcatori SNP sono mutazioni di un singolo nucleotide a livello di un locus cromosomico e con le

tecniche di sequenziamento di DNA di nuova generazione (NGS) si possono identificare un largo numero

di SNP a prezzi ormai competitivi.

I marcatori molecolari possono essere assimilati ad alleli a un locus genico (entrambi sono varianti

genetiche a un locus cromosomico). Quindi, la variabilità molecolare in una popolazione, si può

anch’essa misurare in termini di frequenza dei marcatori (assimilabile alla frequenza allelica).

La mole di loci che si studia a livello molecolare è tale da rendere necessari altri parametri riassuntivi

della variabilità, oltre che la frequenza dei singoli marcatori:

- diversità genica o eterozigosità (H); probabilità che estraendo a caso due alleli dalla popolazione questi 7

siano diversi. Il problema è che potrebbero non essere presi in considerazione gli alleli rari che potrebbero

essere importanti in programmi di conservazione;

- ricchezza allelica; è un parametro molto utilizzato nella salvaguardia delle risorse genetiche; deriva da A

(numero di alleli) a cui si applica una procedura statistica computerizzata (rarefazione) per limitare la

dipendenza dalla numerosità del campione. A differenza dei H, considera anche gli alleli rari;

questo parametro fornisce un’idea di quanta variabilità genetica è

- proporzione di loci polimorfici (P);

stata evidenziata in una popolazione;

- contenuto di informazione sul polimorfismo (PIC); ha valore nullo (0) quando il locus è monomorfico e

teoricamente valore 1 (max) quando ogni individuo ha un marcatore diverso (impossibile);

- numero di alleli (A); si conta per un locus il numero di possibili alleli e si calcola la media per un set di loci.

Più grande è il campione più alto è il valore di A.

STRATIFICAZIONE

Molte specie hanno una variabilità genetica non molto ben distribuita. Ad es. in una sub-popolazione si

in un’altra

ha un allele A al 70% e uno a al 30%; sub-popolazione si può avere il contrario; può essere

che la prima fissi l’allele A e la seconda l’allele a. Quindi diverse sub-popolazioni possono fissare alleli

diversi. In questo caso la specie in questione ha una popolazione stratificata (strutturata).

La stratificazione è dovuta alla mancata panmissia che a sua volta può dipendere da:

- isolamento fisico o politico (mancato scambio di materiale coltivato tra Paesi);

- isolamento riproduttivo (per riproduzione autogama o per via vegetativa). Anche nella stessa area

geografica si possono trovare sub-popolazioni diverse;

- diverse pressioni selettive, dovute ai diversi agroecosistemi, in cui le popolazioni si sono evolute (es.

landraces o specie selvatiche);

- ragioni socio-economiche (es. preferenza di un certo tipo di frutto rispetto a un altro in una certa zona);

- eventi storici che determinano una drastica riduzione nella grandezza della popolazione (effetto collo di

bottiglia o bottle neck). Ciò influenza molto la ricchezza allelica e poco la diversità genetica, perché provoca

con molta più probabilità la perdita di alleli rari.

Sapere se c’è stratificazione è importante per la conservazione della variabilità. Se la popolazione è

stratificata, il germoplasma dovrà prelevarsi dalle varie sub-popolazioni oltre che dal centro di diversità.

L’indice F di Wright è un parametro molto utilizzato in genetica di popolazione, che esprime la varianza

ST indicano l’assenza

genetica che può essere spiegata da fenomeni di stratificazione. Valori di F di 0 di

ST

e l’uguaglianza indicano che c’è

stratificazione fra le popolazioni; valori di 1 stratificazione e quindi le

diverse sub-popolazioni fissano diversi alleli. Diverse specie hanno valori di F molto diversi; nel caso

ST

della specie umana è abbastanza basso (concetto di razza). 8

AUMENTO ARTIFICIALE DELLA VARIABILITÀ GENETICA

I metodi artificiali per aumentare la variabilità genetica in specie coltivate e per crearne di nuove sono:

incroci intra e interspecifici; mutagenesi sperimentale (compresa la poliploidia indotta mediante

(introduzione artificiale di geni da una specie all’altra a prescindere dal

colchicina); ingegneria genetica

meccanismo di riproduzione sessuale). I primi due metodi ripropongono i meccanismi evolutivi che

avvengono in natura (ricombinazione e mutazione). Queste metodologie devono essere considerate

complementari e non sostitutive di azioni di salvaguardia delle risorse genetiche.

INCROCI INTERSPECIFICI

Gli incroci interspecifici permettono di sfruttare GP2 e GP3 e aumentare quindi la variabilità genetica di

specie coltivate su cui poi si potrà fare selezione. Spesso geni utili del GP2 e GP3 sono trasferiti

mediante successivi reincroci con la specie coltivata.

Gli ibridi interspecifici e intergenerici artificiali in alcuni casi si sono direttamente impiegati per la

coltivazione creando nuove specie ibride.

In altri casi, ibridi interspecifici e intergenerici artificiali hanno permesso, per raddoppiamento

cromosomico artificiale, di ottenere nuove specie poliploidi.

Esistonobarriere che non permetterebbero gli incroci interspecifici e intergenerici e possono essere:

- pre-zigotiche; come isolamento geografico, ecologico (habitat differenti), stagionale (differenti epoche

di fioritura), meccanico (differenti specie di pronubi), incompatibilità genetica che impedisce la

formazione dello zigote (es. il polline che non riesce a germinare sullo stimma);

- post-zigotiche; come non vitalità o scarsa vigoria degli ibridi, sterilità degli ibridi (ad es. per mancato

appaiamento degli omologhi in meiosi che determina un’anormale distribuzione dei cromosomi nei gameti).

Per superare tali barriere riproduttive, si può:

- individuare i genotipi adatti (es. accessioni italiane di Trifolium negrescens si incrociano più facilmente

con Trifolium repens rispetto ad accessioni turche perché c’è una certa struttura di popolazione);

(es. MxF ≠ FxM) o gli incroci con specie ponte (ad

- sfruttare incroci reciproci esempio Nicotiana repanda

x Nicotiana tabacum sono incompatibili e per trasferire la resistenza a nematodi della prima, si utilizza come

specie ponte N. sylvestris compatibile con entrambe);

- utilizzare tecniche particolari di impollinazione come la rimozione dello stigma (se è questo a provocare

l’incompatibilità), l’uso di sostanze ormonali (gibberelline) sulla pianta portaseme per favorire l’allungamento

del tubetto pollinico all’interno dello stilo, l’impollinazione con polline intraspecifico devitalizzato;

- modificare il livello di ploidia; ad esempio da colture di granuli pollinici di patata tetraploide si possono

ottenere individui diploidi che possono facilmente incrociarsi con specie selvatiche di patata (anch’esse

diploidi). Dopo l’introduzione dei geni utili, si può ripristinare lo stadio tetraploide con l’induzione del

raddoppiamento cromosomico (vedi poliploidia indotta);

(generalmente nei casi in cui all’incrocio interspecifico segue una

- utilizzare la coltura in vitro di embrioni

dell’endosperma);

degenerazione

- attuare la fusione di protoplasti derivanti da cellule somatiche per degradazione della parete cellulare. È

una tecnica un po’ più spinta nella quale vengono presi i protoplasti per rottura delle cellule di parti di due

piante monoploidi e messi in glicole etilenico; i protoplasti si fondono generando calli ibridi da cui avrà origine

la pianta diploide desiderata.

POLIPLOIDIA INDOTTA

La poliploidia indotta può essere un valido strumento per superare barriere di incompatibilità

interspecifiche e intergeneriche, mediante cui si creano nuove specie poliploidi.

Gli effetti della poliploidia indotta possono anche sfruttarsi per ottenere maggiori dimensioni delle parti

riproduttive e vegetative (importante in specie da fiore) o sterilità (ad es. per banano e anguria triploidi

senza semi). Per indurre la poliploidia si può usare la colchicina che interferisce sul flusso mitotico

impedendo la migrazione ai poli opposti dei cromosomi omologhi. In questo modo da un individuo

diploide si ottiene una cellula figlia diploide (e non due cellule figlie aploidi), che potrà originare

individui tetraploidi. Gli effetti della poliploidia indotta possono aversi sul fenotipo.

Un esempio di poliploidia si ha nella fragola attualmente coltivata (Fragaria ananassa) che è ottoploide, a

differenza della fragolina di bosco (Fragaria vesca) che è diploide; questo è un caso di poliploidia ottenuta

L’assenza

per incrocio spontaneo circa tre secoli fa. di semi nelle banane è un altro effetto della poliploidia

sul fenotipo (il banano coltivato è una forma triploide sterile derivata dall’incrocio di due specie fertili, Musa

acuminata e Musa balbisiana). Per produrre angurie triploidi senza semi (sterili) si seminano

con angurie diploidi. L’impollinazione favorisce la formazione di frutti partenogenetici

contemporaneamente

da parte della varietà triploide (di per sé sterile).

Un esempio di poliploidia indotta mediante incrocio artificiale si è avuto con il Triticale, allo scopo di 9

combinare l’attitudine produttiva del grano duro (Triticum turgidum) con la rusticità della segale (Secale

cereale) molto resistente al freddo e ai parassiti.

T. turgidum 2n=4x=28 (AABB) S. cereale 2n=2x=14 (RR)

X

triploidi non fertili

2n=3x=21 ←

↓ trattamento con colchicina

Triticum - Secale

Triticale esaploide

2n=6x=42

(AABBRR)

(frumento tenero) 2n=6x=42 al posto del frumento duro, con l’ottenimento

Lo stesso avviene con T. aestivum

di triticale ottoploide 2n=8x=56 (AABBDDRR).

Poiché i triticali primari esaploidi hanno dimostrato di essere citologicamente più stabili e quindi più fertili di

in seguito il lavoro è proseguito attraverso incroci tra forme esaploidi per l’ottenimento di

quelli ottoploidi,

triticali secondari. Questi ultimi, a loro volta, sono stati incrociati con frumenti esaploidi allo scopo di

selezionare linee agronomicamente interessanti che sono quelle da cui derivano le moderne varietà.

MUTAGENESI SPERIMENTALE E TILLING

Questo tipo di miglioramento genetico (mutation breeding) si è affermato dopo la seconda guerra

in concomitanza con l’interesse verso l’uso pacifico dell’energia

mondiale, nucleare. Può essere

applicato per creare variabilità riguardo a una o poche caratteristiche in materiali genetici di pregio

(es. genotipi già coltivati); tuttavia potrebbe generare mutazioni sfavorevoli accanto a quelle favorevoli

ed effetti pleiotropici (un unico gene è in grado di influenzare più aspetti fenotipici).

Gli organi vegetali che vengono sottoposti ad agenti mutageni possono essere semi, polline, organi di

X e γ)

propagazione vegetativa. Gli agenti mutageni possono essere fisici (raggi UV, o chimici (EMS

ossia etilmetanosulforato, agenti che provocano reazioni chimiche col DNA); un esempio di

si ha con l’alchilazione che provoca un’addizione

mutazione puntiforme della guanina di un gruppo

alchilico, con rottura di un legame H e scorretto appaiamento tra basi (FIGURA); in sintesi, i semi

vengono mutagenizzati con EMS, che provoca alchilazione delle guanine e mispairing (le G alchilate

legano T invece di C); il risultato di ciò è una mutazione per transizione G/C A/T. I semi, immersi nella

soluzione di EMS, vengono poi lavati e seminati ottenendo la M1.

La prima generazione ottenuta dopo il trattamento mutageno, quindi da organi mutagenizzati, è detta

M1. Le mutazioni non sono generalmente visibili in M1 perché recessive, salvo alcune eccezioni.

Tranne che nel caso di trattamenti al polline, le piante M1 presentano una situazione chimerica con

l’agente

tessuti geneticamente diversi in un individuo; se viene mutagenizzata ad esempio una marza,

mutageno non provoca la stessa mutazione in tutte le cellule e si hanno tessuti geneticamente diversi

per l’embrione di un seme);

fra loro in uno stesso individuo (lo stesso vale ciò nel polline non può

avvenire perché è formato da una sola cellula. Per questo motivo soltanto se le cellule mutate sono

nel tessuto sporigeno di M1 si ha la pianta che manifesta mutazione in M2. Quindi in M1 si presenta

una situazione chimerica e perché la mutazione sia osservabile nella generazione M2, ottenuta per

autofecondazione della M1, è necessario che:

- le cellule mutate non perdano vitalità o rapidità di moltiplicazione, in quanto in tal caso si avrebbe 10

competizione con cellule non mutate nella chimera per la formazione del tessuto sporigeno;

- le cellule mutate diano origine alle cellule sporigene (come già anticipato).

In M2 si ottengono circa dalle 20mila-30mila piante e le mutazioni in M2 dovranno poi essere

confermate in M3.

Siamo nell’era post-genomica e ciò vuol dire che in molti casi conosciamo le sequenze di geni e le loro

funzioni; possiamo mutare specifici geni con funzione nota (es. geni di suscettibilità della fam. MLO associati

alla resistenza all’oidio; si sono ottenuti piselli resistenti mediante trattamento EMS).

TILLING

Il TILLING (Target Induced Local Lesion IN Genomes) è una tecnica che permette di ricercare e

identificare mutazioni in geni specifici in individui di una popolazione sottoposta a trattamento mutageno.

A differenza del mutation breeding, in cui i mutanti desiderati sono selezionati analizzando il fenotipo, con

attraverso l’analisi

il TILLING si identificano del genotipo. Con questa tecnica, una volta avuta la

generazione M2 si ottengono da essa dei campioni di DNA, che vengono riuniti in pools, ordinati su

delle piastre microtiter e sottoposti a PCR gene-specifica per individuare le mutazioni in geni

specifici (singoli mismatch). Ogni mutazione individuata nel pool viene rianalizzata nei singoli individui che

effettuata l’analisi fenotipica.

lo costituiscono; nella M3 viene poi

Oltre che per scopi applicativi di miglioramento genetico è importante anche per studi di base.

ORGANISMI TRANSGENICI E OGM dall’introduzione

Gli organismi transgenici sono caratterizzati di transgeni attraverso la tecnologia del

DNA ricombinante. I transgeni non sono presenti nella specie in cui vengono trasferiti (es. un gene di

pomodoro trasferito in melanzana). Anche tramite incrocio si ha il trasferimento di geni, ma non si usa

la tecnologia del DNA ricombinante.

Generalmente il concetto di OGM è assimilabile a quello di organismi transgenici; tuttavia alcuni

OGM non sono transgenici ma cis-genici; ciò quando il gene introdotto mediante la tecnica del DNA

L’ottenimento di piante cis-geniche

ricombinante appartiene alla stessa specie. può essere utile, in

all’incrocio intraspecifico

quanto rispetto permette un notevole risparmio di tempo, riuscendo ad avere

istantaneamente il trasferimento del solo gene di interesse.

Al momento le specie transgeniche coltivate su larga scala sono soltanto 4 (mais, soia, cotone e colza),

destinata all’alimentazione

nessuna delle quali umana. Le caratteristiche oggetto di trasformazione

sono state: resistenza a erbicidi e insetti e comunque caratteri qualitativi, monogenici; ciò perché è

semplice trasferire un solo gene; per i caratteri quantitativi sarebbe impossibile.

Le due condizioni che permettono di ottenere piante transgeniche sono:

- esistenza della tecnica del DNA ricombinante;

- totipotenza delle cellule vegetali, ossia la possibilità di queste di rigenerare, in opportune condizioni,

un organismo intero (talee, micropropagazione, ecc.). Si può ottenere una rigenerazione tramite callo

trattando le foglie con disinfettanti e mettendo un espianto fogliare su terreno con bassa concentrazione di

fitormoni; si formerà così un callo che potrà essere sub-coltivato con la formazione di germogli sul terreno

con rapporto ormonale sbilanciato a favore della citochinina e successiva induzione alla radicazione con

rapporto ormonale sbilanciato a favore dell’auxina.

La tecnologia del DNA ricombinante permette di clonare porzioni di DNA (geni nel caso di piante

transgeniche) producendo un gran numero di copie.

Gli enzimi fondamentali per questa tecnologia sono endonucleasi (enzimi di restrizione) e DNA ligasi,

che rispettivamente rompono e riuniscono i legami fosfodiesterici delle molecole di DNA. Gli enzimi di

restrizione riconoscono specifiche sequenze di basi dette siti di restrizione e in corrispondenza di esse

operano un taglio per idrolisi del legame zucchero-fosfato; ogni enzima di restrizione riconosce una

specifica sequenza di DNA. I siti di restrizione, in genere, hanno 4-6-8 paia di basi; normalmente

che si leggono allo stesso modo sia da sinistra a destra in un’elica che da

riconoscono delle sequenze

destra a sinistra nell’elica complementare (sequenze palindromiche). Dal taglio possono derivare dei

piccoli frammenti a singola elica sporgenti nelle fasi terminali del segmento (protruding o estremità

coesive) oppure estremità piatte (blunt); è chiaro che la ligasi è più semplice con le estremità coesive.

La DNA ligasi catalizza la formazione di legami fosfodiesterici fra i frammenti di Okazaki ottenuti.

Quindi, le fasi della tecnologia del DNA ricombinante sono:

- isolamento del DNA di un organismo;

- taglio del DNA con enzimi di restrizione immediatamente a monte e a valle del gene di interesse

(normalmente si fa una PCR del gene);

- taglio del DNA di un vettore di clonaggio (molecola di DNA capace di replicarsi in un organismo ospite,

es. plasmidi in una cellula batterica) con lo stesso enzima di restrizione;

dell’organismo all’interno del vettore di clonaggio

- ligazione dei frammenti di DNA e ottenimento di una

molecola di DNA ricombinante (cioè ottenuto da frammenti riuniti provenienti da diverse fonti);

con l’inserimento all’interno dell’organismo ospite

- trasformazione, del vettore ricombiante (es. 11

batterio) attraverso diverse tecniche come l’elettroporazione o lo shock termico.

I più diffusi vettori di clonaggio sono i plasmidi, molecole di DNA ciclico a doppia elica

extracromosomiche, presenti nei batteri. Si replicano prima della divisione cellulare batterica in modo tale

che le cellule figlie contengano anch’esse almeno una copia del plasmide stesso; hanno una relazione

parassitaria e simbiontica col batterio. I plasmidi utilizzati nella tecnologia del DNA ricombinante non sono

naturali ma costruiti artificialmente e si replicano nel batterio Escherichia coli. Elementi fondamentali

del vettore di clonaggio sono:

- sequenza ori (origine della replicazione);

- un marcatore selettivo (per selezionare le

cellule di E. coli trasformate con il plasmide. es.

gene di resistenza all’ampicillina); è una regione

che permette di selezionare o distinguere cellule

batteriche che hanno inglobato il plasmide e

cellule che non lo contengono;

- siti unici di taglio per diversi enzimi di

restrizione (siti di clonaggio multiplo o

polilinker); il plasmide utilizzato deve avere

diversi siti di restrizione per poter essere tagliato

con gli stessi enzimi di restrizione con cui si era

tagliato il gene, perciò c’è bisogno di un sito di

clonaggio multiplo.

Il metodo più utilizzato per ottenere piante

transgeniche è quello con Agrobacterium tumefaciens.

Si tratta di un batterio terricolo molto diffuso con uno

spettro di ospiti molto largo (soprattutto dicotiledoni); è un

patogeno che causa la formazione di galle sul colletto

(tumore del colletto); la formazione di galle dipende dalla

presenza di un plasmide particolare nel batterio: il

plasmide Ti (tumor inducing). Gli elementi del plasmide

Ti sono:

- regione ori;

- regione T-DNA (Transfer-DNA); è integrato

casualmente nel genoma vegetale. Contiene geni

oncogeni (Tum) e geni Nos che permettono la sintesi di

opine. È delimitato da sequenze dette border di 25 pb

(Left Border o LB e Right Border o RB). Permette la

proliferazione delle cellule della pianta e la sintesi delle

opine da parte di essa che fungono da nutrimento per il

batterio;

- geni vir di virulenza; si trovano fuori dal T-DNA e

servono a riconoscere le sequenze border e a trasferire il

plasmide nel genoma delle piante. Sono attivati da

sostanze in corrispondenza delle ferite (acetosiringone);

- geni Noc che permettono il catabolismo delle opine. Il

batterio ricava energie da opine sintetizzate dalle piante.

Il processo infettivo naturale visto, può essere sfruttato

per inserire geni di interesse nel genoma vegetale.

L’Agrobacterium funziona come un ingegnere genetico

naturale. Per il trasferimento artificiale del T-DNA sono

utili LB, RB, i geni vir e la regione ori, ma non gli altri

geni utili solo alla proliferazione del batterio in natura.

Si usa un sistema binario (due tipologie di plasmidi) di

vettori plasmidici da Agrobacterium tumefaciens (si

possono acquistare da aziende biotecnologiche):

plasmidi helper con regione ori e geni vir; vettori di

clonaggio binario con sequenza ori, T-DNA

comprendete LB e RB e un gene marcatore KanR

(Resistenza alla kanamicina) per selezione vegetale e

polilinker MCS in cui inserire il transgene. Se ne usano

due perché è più semplice tenere separatamente i geni

vir in modo da lavorare con plasmidi più piccoli, non

troppo ingombranti. 12

e si applica l’Agrobacterium

Preso un disco fogliare si praticano delle ferite con il T-DNA che entra nel

L’A.

genoma della pianta che conterrà gene target e marker di selezione. tumefaciens si elimina con

carbenicillina e dai calli che si sviluppano nel mezzo contenente Kanamicina si otterranno le piante

L’A.

transgeniche. tumefaciens crea problemi sulle monocotiledoni, anche se sono stati affinati dei

protocolli che aiutano il batterio ad agire anche su esse, ma si tratta di metodi poco efficienti.

Metodi alternativi sono utilizzati soprattutto per le monocotiledoni, come il metodo biolistico. Si tratta di un

metodo fisico con il DNA di interesse che viene legato a microproiettili che, accelerati da macroproiettili

impattano ad alta velocità sulle cellule target. Altro metodo è l’elettroporazione che è utilizzato per lo più su

cellule senza parete cellulare, quindi non sulle piante.

VANTAGGI SVANTAGGI

I vantaggi potenziali derivati dall’uso di piante Partiamo dal presupposto che l’agricoltura, per definizione

ha un’azione distruttiva sull’ambiente e gli ecosistemi

transgeniche sono:

- incremento delle produzioni, mediante transgeni che naturali. Tale azione distruttiva è maggiore nel caso si

permettono di ridurre al minimo il problema di infestanti, ricorra a sistemi intensivi, che fanno ampio ricorso a input

insetti dannosi, ecc.); esterni. Pertanto, i rischi ambientali dovuti alla coltivazione

- miglioramento della qualità nutrizionale dei prodotti; di piante transgeniche dovrebbero essere sempre

potrebbe sembrare un controsenso ma ad esempio è stato relazionati ai benefici che esse determinano se sono

capaci di diminuire l’uso di pesticidi, erbicidi, ecc. I rischi

prodotto un riso con tutti gli enzimi che permettono la

produzione di vitamina A; nel sud-est asiatico i casi di ambientali a cui si fa riferimento sono:

sull’ecosistema,

- effetto ad esempio il mais Bt è stato

cecità e patologie da carenza di vitamina A sono tantissimi

perché in quelle zone il nutrimento principale è il riso, messo da alcuni autori in relazione con effetti nocivi nei

quindi si potrebbe risolvere questo problema; confronti di organismi non target (tuttavia non va

al contrario dell’opinione sottovalutato l’impatto ambientale dell’alternativo uso di

- sostenibilità ambientale;

pubblica diffusa; se ad es. si ottiene un mais resistente pesticidi);

- trasferimento di geni di resistenza ad erbicidi anche

alla piralide grazie a un transgene, il fatto di non dover nelle specie infestanti;

applicare prodotti chimici (cosa normalmente prevista) è - perdita di biodiversità dovuta alla sostituzione di

un vantaggio relativo alla sostenibilità;

- vantaggi economici per produttori consumatori (non varietà locali con altre GM (in passato comunque varietà

,

sempre) e costitutore varietale; migliorate non transgeniche hanno però avuto lo stesso

- molecular farming e produzione di biofuel (es. mais) effetto).

soprattutto nei biocarburanti di seconda generazione

ottenuti da microalghe transgeniche; il molecular farming è

la produzione di composti utili ai fini industriali o

farmaceutici attraverso piante transgeniche.

i rischi per l’ambiente ci sono, tuttavia

In definitiva, è vero che sarebbe giusto testare, come per tutte le

differenza di impatto ambientale fra l’uso di piante transgeniche

innovazioni tecnologiche, per vedere la

e quello di piante che non lo sono, per vedere se la situazione effettivamente peggiora. Ad ogni modo,

attualmente non è possibile predire gli effetti delle piante transgeniche con sicurezza del 100%, ma si può lo

stesso dire per varietà ottenute per mutagenesi o nuove specie create dall’uomo. Sicuramente l’uso di

antiparassitari ed erbicidi, così come la sottrazione di habitat naturali e quindi tutta l’agricoltura in generale

non sono attività enviromental friendly.

In tanti anni, nessuna ricerca attendibile è stata pubblicata su riviste scientifiche peer-reviewed, per

dimostrare un effetto avverso derivante dal consumo di prodotti geneticamente modificati. È

comunque ovvio che non si può affermare con certezza il contrario. Comunque sia molte varietà oggi in

γ,

commercio sono il risultato di trattamenti a raggi X e o di incroci con specie selvatiche non alimentari.

I potenziali maggiori rischi che potrebbero derivare dal consumo di OGM, sono dovuti alla presenza di

marcatori selettivi che conferiscono resistenza agli antibiotici; il trasferimento di tali geni in organismi

patogeni per l’uomo potrebbe creare grossi problemi.

Si potrebbero avere mutazioni, ma ciò non vuol dire che sia un problema, infatti queste avvengono di

sono il sale dell’evoluzione. Il mutation breeding ha ottenuto, tra l’altro, numerosissime

continuo in natura,

cultivar oggi commercializzate e consumate abitualmente.

Il marcatore selettivo può creare problemi nel caso di trasferimenti genico che può essere:

- orizzontale con trasferimento di geni di resistenza ad antibiotici e batteri patogeni;

- verticale (attraverso incrocio) con trasferimento della resistenza a erbicidi in specie infestanti oppure con la

stessa specie coltivata che diventa infestante.

Per ovviare al problema del marcatore selettivo (che conferisce resistenza agli antibiotici) si potrebbero

creare piante transgeniche marker-free. Per poterlo fare ci sarebbero delle alternative:

- rinunciare al marcatore selettivo; ad esempio si possono eseguire molte PCR e vedere se amplificano o

meno e quindi se il gene è presente o meno; tuttavia questo metodo è costoso;

- utilizzare marcatori che non siano geni di resistenza ad antibiotici o erbicidi (pertanto, quando si

parla di marker-free, si fa riferimento ai marcatori tradizionali usati); ad esempio esiste un sistema basato

sulla fosfo-mannosio isomerasi (PMI), gene che consente alle cellule di vivere in un mezzo contenente

mannosio come sola fonte di C.

- rimozione del marcatore dopo la selezione di piante transgeniche (esistono tecniche a riguardo). 13


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MarcoP87

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in Gestione e Sviluppo Sostenibile dei Sistemi Rurali Mediterranei
SSD:
Università: Bari - Uniba
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher MarcoP87 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Salvaguardia e Valorizzazione della Biodiversità Vegetale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bari - Uniba o del prof Pavan Stefano.

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